专利名称：四环素免疫胶体金快速检测试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型属于兽药残留免疫化学快速检测技术领域，具体涉及一种检测试剂板。
背景技术：
四环素是由链霉菌产生的一种广谱抗生素，在畜禽、水生生物等产业领域应用此类药物对动物进行诊断、预防和治疗疾病，以及促进动物生长、提高饲料转化率，带来了可观的经济效益。但是，长期食用这种动物食品及其制品，必然会危及人类的健康。四环素药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏的损害，以及牙齿的染色，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎作用。目前，四环素造成的动物性食品的药物残留，已经对人类健康构成了潜在的危害。欧美、日本及中国均要求其限量使用。 目前，食品中四环素残留常用的检测方法主要是仪器法和免疫分析法。仪器法，如高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用(LC-MS)等，具有特异性好、准确率高的特点，但由于存在对设备、环境、操作技能等要求，且检测周期长，不利于大规模样本筛选。免疫分析法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，具有检测量大，操作相对简单等优点，但是该法同样需要实验室设备，分析时间较长，具有一定局限性。

实用新型内容本实用新型的目的在于针对上述方法的不足，提供一种灵敏度高、操作简单、检测
时间短、不需要特殊仪器设备、生产成本低的牛奶中四环素残留检测试剂板。 本实用新型试剂板由塑料模板上下板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品
垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜
和吸水垫相邻各部分间有l-2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫
部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体
系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体
顺利发生反应。 胶体金结合垫上包被有抗四环素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有四环素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联四环素的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)等。 本实用新型所描述的试剂板的各部分组成成分与功能如下 塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用 背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组
成部分的作用。 样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。 胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗四环素单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。 硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。 吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。 本实用新型试纸板具有如下有益效果 (1)特异性好。本实用新型试剂板的抗四环素单克隆抗体除对四环素的交叉反应 率为100%外，对四环素类药物中的土霉素、金霉素的交叉反应率分别为69%和62%，因此 本实用新型可以同时检测牛奶中多种四环素类药物残留。此外，本实用新型试剂对氯霉素、 链霉素、庆大霉素、青霉素、磺胺类等其他种类抗生素药物无交叉反应。 (2)灵敏度高。我国国家标准规定牛奶中四环素残留限量为100i!g/kg。本实用 新型试剂板的灵敏度可达到四环素标准品5ii g/kg、土霉素标准品7i! g/kg、金霉素标准 品8ii g/kg，用于检测牛奶中的四环素类残留，最低检测限可达到四环素10i! g/kg、土霉素 15 ii g/kg、金霉素16 ii g/kg。 (3)操作简便快速。本实用新型将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试剂 条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大縮短了检样时间，且样品无需处理， 滴样后3 5分钟内读取结果，使得整个检测过程仅需5分钟左右。本方法不需任何专业 培训，普通人员均可操作，只需按说明滴样后用肉眼判读即可。 (4)不依赖于实验设备。本实用新型在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素
膜上检测线和控制线的颜色深浅对比来判读结果，整个检测过程无需用到任何实验设备，
真正做到了对实验设备零要求的目标，尤其适合于野外及现场操作，易于推广使用。 (5)成本低，效益好。本实用新型试剂板生产工艺流程简单，生产成本低廉，投资
少，见效快。
图l.为四环素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体 金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。 图2.为四环素免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样？L C为控 制区，T为检测区。 图3.为四环素免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为 检测区。
具体实施方式
要制备四环素免疫胶体金快速检测试剂板需要制备四环素载体蛋白偶联物、抗四 环素单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记抗四环素单克隆抗体，这些物质的制备方法如 下。
1.四环素与载体蛋白的偶联 采用Ma皿ich法将盐酸四环素与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原。称取 50mg盐酸四环素溶于2mL水中，加入到50mg/mL载体蛋白溶液中，再加入2mL 3mol/L pH 5 醋酸钠缓冲液和2mL 7. 5%甲醛溶液，上述混合溶液室温下搅拌2h，用双蒸水透析5天，滤 膜过滤后，收集。 2.抗四环素单克隆抗体的制备 取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的四环素载体蛋白偶联物与等体积
4的弗氏完全佐剂乳化，皮下注射，剂量为100 i！ g/只，以后每隔3周加强免疫1次，改用不完全佐剂，腹腔注射。融合前3d强化免疫l次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 : 10的比例混合，在50XPEG作用下融合，然后用HAT培养基悬浮，再分种于96孔培养板中，于37°C、5% C02培养箱中培养。[0030] 融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛以10mg/L四环素载体蛋白偶联物(此处载体蛋白与作为免疫原的载体蛋白应为不同种类)包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP (1 : 1000) ， OPD显色。筛选出的阳性孔再用四环素载体蛋白偶联物(同初筛)包被的酶联板进行阻断间接ELISA。先将细胞培养上清与2X10—3mol/L TC溶液等量混合，37。C感作lh，再加入已包被的酶标板中。同时用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代TC溶液作对照，其余步骤同上。若TC阻断后的0D值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。 体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，待细胞浓度达5X105mL—1时停止换液，直至细胞全部死亡，收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡IO天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株107个细胞，7天后抽取腹水。[0032] 3.胶体金溶液的制备 胶体金颗粒的大小平均为30nm，其制备方法为在lOOmL去离子水中加入lmL 1%柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入lmL 1%氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4t:下保存备用。[0034] 4.胶体金标记抗四环素单克隆抗体制备 取已制备好的lOOmL胶体金溶液，用0. lmol L—H酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1. 5mg抗四环素单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mg mL—1聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌15min。 20， OOOrpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7. 4PBS缓冲液(含0. 4mg mL—屮EG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 ii m无菌过滤器过滤后，fC保存备用。[0036] 5.四环素免疫胶体金快速检测试剂板的组装 参照图l，用点膜机把适当浓度的四环素-载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，在37t:烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记四环素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。 检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。[0039] 6.四环素免疫胶体金快速检测试剂板检测原理 当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有四环素残留，四环素药物将和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的四环素药物占据而无法与检测线上四环素特异性抗原结合；所以当样品中的四环素
含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线将较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中四环素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。 7.四环素免疫胶体金快速检测试剂板检测实施例操作方法 7. 1样品制备 将牛奶样品预热到5(TC左右。 7. 2检测步骤 从包装袋中取出试剂板后立即使用，用滴管吸取预热牛奶溶液，于加样孔中滴加5滴(约150 ii L)，加样后开始计时，结果应在5 10分钟读取，其他时间判读无效。[0046] 7. 3结果判断 读取结果时，试剂板水平置于观察者正面，如图3右侧所示。 阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表明样品中四环素浓度低于10i!g/kg或无四环素残留。如图4.a所示。 阳性(+) :T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中四环素浓度高于10iig/
kg ;T线比C线越浅，表明样品中四环素浓度越高。如图4. b所示。 无效未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。如图4.c所示。
权利要求一种检测四环素药物残留的免疫胶体金快速检测试剂板，含有塑料模板上下板、背衬、附着在背衬上依次紧密相连的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其特征在于样品吸收垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有1-2mm的重叠，胶体金结合垫上包被有抗四环素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有四环素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。
2. 根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于偶联四环素的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。
3. 根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于背衬为一面涂有不干胶的PVC板，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型四环素免疫胶体金快速检测试剂板，属于兽药残留免疫化学的快速测定试纸，由上下两块塑料模板和试纸条组成。在试纸条背衬上依次粘附有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有1-2mm的重叠，胶体金结合垫上包被有抗四环素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有四环素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。本实用新型特异性好，可同时检测四环素、土霉素、金霉素等四环素类抗生素残留，灵敏度高达5μg/kg，操作简便快速，整个检测过程仅需5分钟左右，且无需任何实验设备，尤其适合于野外及现场操作，易于推广使用。
文档编号G01N33/577GK201518027SQ20092018968
公开日2010年6月30日 申请日期2009年7月24日 优先权日2009年7月24日
发明者卜令杰, 张少恩, 桑丽雅, 邵伟 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司