专利名称：一种测定植物内源激素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种测定植物内源激素的方法。
背景技术：
植物内源激素(Plant Endogenous Hormones)是指在植物体内合成的，通常从合 成部位运往作用部位，在低浓度(lymol/L以下)时对植物的生长发育产生显著调节作用 的微量有机物质，其中赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)是植 物体内重要的四种内源激素。内源激素在植物中含量极低，性质不稳定，加之细胞中其他化 合物的干扰，故测定的方法必须十分灵敏和专一，传统的测定植物内源激素的方法如下先 将收集到的植物材料用液氮冷冻并保存于低于-2(TC的冰箱内；然后选用合适的有机溶剂 来提取材料中的激素，选用的有机溶剂既要避免提取出许多干扰的化合物，又不能破坏激 素本身；最后用多种有机溶剂对提取液进行萃取即进行提取液的分离纯化，获得一定纯度 的样品，利用一些大型分析仪器测定样品中的激素含量。其中提取和分离纯化的过程非常 复杂繁琐，费时费力，稍有操作不当极易造成样品中待测激素的浪费，并且很难实现多种植 物内源激素的同时测定。 微透析(Microdialysis， MD)是一种优良的在线取样方法，其最大的优点是基本 不干扰生物体内正常生命活动，实现活体取样。微透析的原理与普通透析技术相同，即小分 子物质顺着浓度梯度通过半透膜进行扩散，只是装置精巧，可以置入小的组织空间中。将微 透析探针植入生物体内，当灌流液通过探针时，生物体内相对分子质量合适的物质便会顺 浓度梯度通过半透膜进入灌流液中。由于透析管中的灌流液不断流动更新，因此，跨膜浓度 梯度始终存在，微透析得以持续进行。

发明内容
基于以上原理，本发明采用微透析法，在基本不干扰生物体内正常生命过程的情 况下，进行活体(Invivo)、实时(In time)、在线(On line)取样检测，特别适合研究生命过 程的动态变化。 本发明提供了一种测定植物内源激素的方法，采用微透析体系，在植物体上直接 进行微透析收集样品，将透析液在高效液相色谱仪上进样，分离并测定出其中的激素含 其中，微透析体系由导引管、微透析探针、连接管、灌注介质、微量注射泵和样品收
集器组成，样品的具体收集过程如下 第一步、将导引管插入植物，再植入探针； 第二步、开动微量注射泵，调整泵的灌流速度为1 y L/min ; 第三步、将出液管末端放入小离心管内收集透析液。 为避免探针的脱落和损坏，植入探针后立即采用牙托水密封，其中牙托水由自凝 粉与义齿基托树脂液剂混合搅拌至粘糊状而成。
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本发明所采用的灌注介质储存于注射器中，为纯化水、双蒸水或超纯水，选择灌注 介质的原则是水的纯度越高越好，对测定的干扰越小，灌流速度为1 P L/min，探针分子截留 量为30kD。 本发明的色谱条件为流动相为甲醇0.2%磷酸水溶液=60 : 40，流速为 0. 6mL/min，柱温为30。C，检测波长为203nm(GA) 、273nm(6-BA) 、214nm(IAA) 、263nm(ABA)。
本发明适用于植物体含水较多的部位，如植物的叶、茎和果实，尤其是植物的嫩茎。 本发明将已经成熟应用于动物的微透析技术应用于植物活体的微透析取样，以活 体植物嫩茎为材料，采用高效液相色谱法(HPLC)测定了植物活体内四种内源激素的含量， 初步建立了微透析方法与高效液相色谱技术相结合测定植物内源激素的方法。
传统的测定植物激素方法，样品提取过程较为繁琐，且不能做到活体检测。本发 明通过微透析的方法在植物体上进行活体取样，将微透析探针植入植物体内，植物激素通 过探针头部的半透膜渗透进入灌流液并被灌流液带出，收集灌流液即透析液在高效液相色 谱仪上直接进样，同时测定出了细胞分裂素(6-BA)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸 (ABA)这四种激素。 本发明不仅避免了样品复杂的提取和分离纯化过程，还实现了植物体实时、活体、 在线取样测定植物激素，更加客观真实的反映了植物体代谢过程中其内源激素的含量变化 情况。


图1、基本微透析系统示意图，其中A、注射器，注射器中贮有灌注介质；B、注射泵； C、连接管；D、样品收集；E、微透析探针。 图2、植物激素标准品色谱图，其中GA的保留时间为7. 036min， 6-BA的保留时间为 7. 626min， IAA的保留时间为9. 287min， ABA的保留时间为11. 003min。
图3、吴屯杨透析液中ABA色谱图，测定波长为263nm，保留时间为10. 986min。
图4、吴屯杨透析液中IAA色谱图，测定波长为214nm，保留时间为9. 308min。
图5、吴屯杨透析液中6-BA色谱图，测定波长为273nm，保留时间为7. 646min。
图6、吴屯杨透析液中GA色谱图，测定波长为203nm，保留时间为7. 002min。
图7、鹅掌柴透析液中ABA色谱图，测定波长为263nm，保留时间为11. 032min。
图8、鹅掌柴透析液中IAA色谱图，测定波长为214nm，保留时间为9. 311min。
图9、鹅掌柴透析液中6-BA色谱图，测定波长为273nm，保留时间为7. 605min。
图10、鹅掌柴透析液中GA色谱图，测定波长为203nm，保留时间为6. 989min。
图11、不同时间段吴屯杨透析液中内源激素含量的变化。
图12、不同时间段鹅掌柴透析液中内源激素含量的变化。
具体实施方案 实施例一 微透析法 定杨树嫩茎内源激素。
1、材料与方法
(l)试验材料
于2009年4月下旬插条盆栽吴屯杨，待其生长一个月左右，选择生长良好的植株， 在其嫩茎中上部进行微透析取样，获取质外体透析液，用岛津LC-20AB高效液相色谱仪进 行检测。 (2)色谱条件 岛津Inertsil ODS-SP (250mmX4. 6mm， 5 ii m)色谱柱，流动相V(甲醇)V(超纯 水，其中含有0. 2 %的分析纯磷酸)，柱温为30°C，流速0. 6mL/min，检测波长GA， 203nm ; 6-BA， 273nm ;IAA， 214nm ;ABA， 263nm。进样量20 ii L。
(3)激素标准溶液的配制 准确称取标准品赤霉素、细胞分裂素、吲哚乙酸、脱落酸各5mg，置于50ml容量瓶 内，用流动相定容至50mL，配制成100mg/L的标准溶液，再分别将上述4种溶液配制成系列
浓度梯度的混合标准溶液，待测。
(4)样品的获取 微透析取样选用购自美国BAS公司的微透析仪和微透析探针，微透析探针分子截 留量为30KD。取样时，由于植物嫩茎组织相对动物组织较硬，为防止损伤探针，先用导引管 插入幼嫩茎的取样部位，与嫩茎夹角为30 45度，然后再植入探针；为防止灌流液溢出流 失及探针的脱落，采用牙托水(取少量自凝粉，用胶头吸管吸适量义齿基托树脂液剂搅拌， 至黏糊状即可)密封；连接好电源、微量注射泵、注射器、进液管及出液管，调整泵的灌流速 度为1 y L/min，用Millipore-Q超纯水作灌流液。微透析取样时每30min收集一次透析液， 收集透析液的小离心管置于盛满冰块的冰盒内，为透析液提供一个较为恒定的低温环境。 将不同时间段收集好的透析液直接在高效液相仪上进样。以上试验重复三次。
(5)样品中植物内源激素含量的测定 将获得的透析液在选定的色谱条件下进样，测定出其浓度值。做三次重复。
(6)微透析探针体外回收率的测定 本试验用探针的体外回收率来修正测定值。将探针插入已知浓度的植物激素混合 标准溶液中，灌流速度调为1 P L/min，使用岛津高效液相色谱仪测定出透析液中各激素浓 度与标准液中各激素浓度之比就是该探针的体外回收率。做三次重复，取平均值。本试验 测得的体外回收率为GA，17. 6% ;6-BA，11.4% ;IAA，12. 1% ;ABA，9. 3%。
2、结果与分析 (1)激素定性分析(如附图2所示)。
(2) —元线性回归分析 将已经配制好的各浓度梯度混合标准溶液在确定的色谱条件下分别进样。以峰面 积为纵座标，以各进样浓度(mg/L)为横座标，将相关数据输入Excel2003进行运算，得到四 种内源激素的线性回归方程及其相关系数，如表1所示。从表中可以看出，各标样溶液浓度 与其峰面积线性关系良好，相关系数均在0. 999以上。
表1、内源激素在选定色谱条件下的标准曲线
内源激素回归方程线性范围相关系数
赤霉素(GA)Y=5 7696. lx+7981.670.1 500.9993
细胞分裂素 (6~BA)Y=291825x-196190.04~250.9997
口引哚乙酸(IAA)Y=233086x-301750.04~250.9998
脱落酸(ABA)Y=95177.1x+2751.870.01 50.9992 (3)样品激素测定 将微透析取样获取的透析液在确定的色谱条件下直接进样，将测得的峰面积代入 回归方程计算出测定值，再依据探针的体外回收率对测定值进行修正。试验过程中每隔 30min收集透析液进一次样，透析液色谱图如附图3 6所示。各时间段不同激素含量如附 图11所示。 (4)样品加标回收率的测定 将灌流速度设为1 y L/min，在杨树嫩茎上进行微透析取样，获取四份透析液待测。
在每份透析液中准确吸取300 L于四支小离心管内，分别加入一定体积的标准溶液。测定
各激素浓度，根据测定结果换算成透析液中加标前后各内源激素的质量值。重复3次，计算
加标回收率。实验结果见表2。 表2、内源激素加标回收试验结果
样品中内源激素样品中含量(吗)加标量(昭)标准回收量(吗)回收率(％)
赤酶素(GA)8.6211019.496104.7
细胞分裂素(6-BA)3.7881013.12695.2
吲哚乙酸(IAA)2.4191011.27690.8
脱落酸(ABA)0.601109.71191.6 (5)样品稳定性的测定 于杨树嫩茎上进行微透析取样两小时，将获得的透析液每隔1个小时进样一次， 测定激素含量。重复三次。由表3可以看出本方法获取的样品中各种激素含量在取样后含 量变化非常小，因此利用本方法取样测定植物激素具有较好的稳定性。
表3、样品稳定性测定结果
透析液中内源激素
含J
60min后120min后180min后 240min后
(mg/L)含量(mg/L)含量(mg/L)含量(mg/L)含量(mg/L)
赤酶素(GA)29.0929.4831.7331.4729.40
细胞分裂素(6-BA)2駕1.9671.9971.9841.986
吲哚乙酸(IAA)1.1261.1251.1191.1141.107
脱落酸(ABA)0.36470,36790.35890.36070.3598 实施例二 、微透析法测定鹅掌柴嫩茎内源激素。 测定方法与实施例一相同。微透析取样获取的透析液色谱图如附图7 各时间段不同激素含量如附图12所示。
IO所示，
权利要求
一种测定植物内源激素的方法，其特征在于采用微透析体系收集样品，将取得的透析液在高效液相色谱仪上进样，分离并测定出其中的激素含量，检测的色谱条件为流动相为甲醇∶0.2％磷酸水溶液＝60∶40，流速为0.6mL/min，柱温为30℃，检测波长为203nm、273nm、214nm和263nm；其中，微透析体系由导引管、微透析探针、连接管、灌注介质、微量注射泵和样品收集器组成，灌注介质为纯化水，储存于注射器中，样品的具体收集过程如下第一步、将导引管插入植物，再植入探针；第二步、开动微量注射泵，调整泵的灌流速度为1μL/min；第三步、将出液管末端放入小离心管内收集透析液。
2. 根据权利要求1所述的一种测定植物内源激素的方法，其特征在于在活体植物上进 行微透析取样。
3. 根据权利要求1所述的一种测定植物内源激素的方法，其特征在于植入探针后立即 采用牙托水密封，其中牙托水由自凝粉与义齿基托树脂液剂混合搅拌至粘糊状而成。
4. 根据权利要求1所述的一种测定植物内源激素的方法，其特征在于灌注介质为双蒸 水或超纯水。
5. 根据权利要求1所述的一种测定植物内源激素的方法，其特征在于适用于植物的 叶、茎和果实，尤其适用于植物的嫩茎。
全文摘要
本发明提供一种测定植物内源激素的方法。在植物体上进行微透析取样，将获取的透析液在高效液相仪上进样，可同时分离并测定出四种主要的植物内源激素赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)。与传统的测定植物内源激素方法相比较，本发明实现了植物体内源激素的活体测定，可以最大程度地降低对植物体的伤害；样品提取较为简便，易于操作，并且能较为真实地反映植物体生命活动进程中其内源激素含量的变化，实现了植物体内源激素实时、活体、在线的测定。
文档编号G01N30/00GK101738441SQ20101010039
公开日2010年6月16日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者姜国斌, 姜波, 李日红, 金华 申请人:大连民族学院