专利名称：胃癌患者血清中的循环eb病毒dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及以下发现在患者血液的无细胞液体中存在EB病毒，并且当发现患者体内有病毒，患者遭受胃炎的折磨时，该患者易于从胃炎发展为胃癌。
背景技术：
众所周知，各种来源于肿瘤的DNA能够被各种肿瘤的癌细胞释放出来(Anker et al.，Cancer Metastasis Rev.1865-73(1999))。这样的例子包括胰腺癌的癌基因突变(Anker et al.，Gastroenterology.1124-1120(1997))，肺癌中的微卫星DNA的改变(Chen et al.，Nature Medicine.23-1035(1996))和肝癌中的后生变化(Wong et al.，Cancer Res.593(1999))。此外，病毒DNA已经在各种已知与病毒感染有关的癌症患者血液循环中被发现。这样的例子包括来源于鼻咽癌(Mutirangura et a1.，ClinCancer Res.4665-9(1998)；Lo et al.，Cancer Res.591188-91(1999))和某些淋巴瘤(Lei et al.，Br J Haematol.111239-46(2000)；Gallagher et al.，Int J Cancer.84442-8(1999)；Drouet et al.，J Med Virol.57383-9(1999))的EB病毒(EBV)DNA以及头颈癌中的人类乳头瘤病毒DNA(Capone etal.，Clin Cancer Res.64171-5(2000))。
最近，人们的兴趣集中于癌症患者血浆和血清中的来源于肿瘤的DNA的存在上(Chen，X.Q.et al.，Nat.Med.，21033-1035(1996)；Nawroz，H.et al.，Nat.MED.，21035-1037(1996))。在和病毒相关的癌症患者的血浆和血清内，检测到了与无细胞肿瘤相关的病毒DNA(Mutirangura，A.etal.，Cancer Res.，4665-669(1998)；Lo，Y M.D.et al.，Clin.Cancer Res.，591188-1191(1999)；Capone，R.B.Clin.Cancer Res.，64171-4175(2000))。和许多种类的恶性肿瘤相关的一种很重要的病毒是EB病毒(EBV)(Cohen，J.I.N.Engl.J.MED.，343481-492(2000))，EB病毒(EBV)是人类疱疹病毒，能够感染大多数人群。EB病毒通常经唾液传播，在B淋巴细胞中建立潜伏感染，终生以B淋巴细胞为寄主。在这点上，在鼻咽癌患者(NPC)(Mutirangura，A.et al.，Cancer Res.，4665-669(1998)；Lo，Y.M.D.et al.，Clin.Cancers.，591188-1191(1999))和某种淋巴恶性肿瘤患者(Lei，K.I.et al.，Br.J.Haematol.，111239-246(2000)；Drouet，E.et al.，J.Med.Virol.，57383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，INT.J.Cancer，84442-448(1999))的血浆和血清中检测到了循环的EB病毒DNA。
据报道，EB病毒感染和一部分胃癌有关(Shibata，D.et al.，Am.J.Pathol.，140769-774(1992))。在香港，大约10％的胃癌病例被发现和EB病毒感染有关(Yuen，S.T.et al.，AM.J；Surg Pathol.，181158-1163(1994))。
本发明提供了检测胃癌患者血清中EB病毒DNA，并将监测到的EB病毒DNA的量和临床诊断或者预测相联系的方法。
发明概要一方面，本发明的特点是提供了诊断，检测，监测和确定患者患胃癌的前兆的方法。该方法是以检测或确定存在于胃癌患者血清和血浆中的EB病毒DNA(EBV DNA)的量为特征的方法。相应地，本发明在临床医学上的有广泛的适用性。
本发明的方法也适用于诊断、检测、监测和确定非头颈癌和淋巴恶性肿瘤，例如乳腺癌的前兆。和胃癌一样，这些肿瘤和EB病毒感染有关。
本发明的方法也适用于诊断、检测、监测和确定胃炎前兆。EB病毒DNA在非肿瘤性质的胃病患者，如在胃炎患者的血浆和血清中可以被检测到。
反过来，胃炎又和胃癌有关。本发明进一步包括能够被或已经被诊断为胃癌的患者，其中所述患者癌细胞中没有EB病毒核酸或癌细胞中有EB病毒。
本发明的方法通常包括步骤(1)从患者获得血液样品；(2)从血液样品中提取DNA；(3)测量血液样品中的循环EB病毒DNA的量；和(4)将血液样品中存在的循环EB病毒DNA的量与对照作比较。
值得重视的是，本发明的方法无需从患者体内取血样这一步骤，可以利用以前从患者体内取的血样(或者利用液体组分或从血样中获得的DNA)来实施。
血液样品优选为无细胞的液体样品。所述的无细胞，指的是此样品是血清，其中通过凝集反应和从剩余的液体中分离细胞，或者通过抑制凝集反应，离心液体组分(血浆)，而提取除去细胞。测量液体组分中的EB病毒DNA。当在无细胞样品的液体中发现EB病毒，说明感染活跃，感染的细胞释放EB病毒。
在另一方面，本发明的特点是诊断试剂盒，所述试剂盒包括检测患者血清或血浆中EB病毒DNA的合适的试剂。本发明中的试剂盒可以进一步包括一个或多个从患者取血样的装置，一种从血样中分离EB病毒DNA的装置和定量测定血液样品中的EB病毒DNA的装置。这样的试剂盒对诊断、检测、监测胃炎和胃癌患者以及确定其前兆很有作用。


图1A为胃腺癌，其中含有小EB病毒编码的RNA(EBER)-阳性肿瘤细胞。EBER原位杂交，放大200倍。图1B显示胃腺癌，其中偶尔有EBER-阳性肿瘤浸润淋巴细胞。肿瘤细胞是阴性的，EBER原位杂交，放大400倍。
图2显示三组患者中循环EB病毒DNA的水平差异。在每一个EBER阳性病例的血清中都检测到了EB病毒DNA(血清EBV DNA浓度的中值是1063拷贝/毫升；四分位数间距485-5141拷贝/毫升)。在32个EBER阴性病例中，没有在任何血清中检测到EB病毒DNA。在14例EBER阳性背景的13例(93％)中可以检测到血清EB病毒DNA。这些病例的血清EB病毒DNA浓度中值处于中间，为50拷贝/毫升(四分位数间距为42-98拷贝/毫升)。
图3为具有EBER阳性背景的胃癌、胃炎病例和对照受试者中，可检测到血清EB病毒DNA的病例间的比较。图中显示了这三组患者的血清中EB病毒DNA浓度，这三组患者中循环EB病毒DNA的水平在统计学上无显著差别(Kruskal-Wallis试验，p＝0.296)。
发明详述本发明以诊断、检测、监测并确定患者患胃癌的前兆的方法为特征，本方法是以检测或确定胃癌患者血清中存在的EB病毒DNA的量为特征的方法。本发明的方法在临床医学上有广泛的适用性。
胃癌在包括日本在内的很多地域为高发病，众所周知，一定比例的胃癌和EB病毒感染有关(Shibata et al.，Am J Pathol.140769-74(1992))。本发明的非侵入式的血液试验体现了临床上的巨大进展。
胃炎或消化不良为胃粘膜炎症，胃炎是引起胃粘膜炎性改变的一组相关病症，但是这些病症的临床特征、组织学特征和引发机制有所不同。当炎症为慢性时，就是为人熟知的指示发展为胃腺癌的标志。
胃炎可能是急性的或者慢性的。在饮入太多的酒、吃得太多、吃辛辣食物或抽烟后，一些人会得胃炎，另一些人在长期服用非类固醇的抗炎药物后(NSAID)或者感染了病菌比如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌后得上胃炎。有时在动了大手术、受了外伤、烧伤或者严重感染后会得胃炎。某些疾病，比如恶性贫血、自身免疫病和慢性胆汁逆流等也可以引起胃炎。
临床上，胃炎的最普遍的症状是胃部的不适或疼痛。也有患者报告有打嗝、腹部肿胀、恶心、呕吐或胃部的饱胀感和烧灼感。如果胃的内膜出血，呕吐物或大便中可能也有血。
诊断胃炎需通过一次或多次医学试验，包括胃镜检查、活组织检查、针对贫血的血液试验，和针对血液的粪便试验。此试验检查粪便中是否存在血液，血液的存在是胃炎的迹象。
虽然胃炎和被EB病毒感染的人密切相关，但它和加速发展为胃癌没有任何关系。本发明的一个目的是鉴别出对胃癌易感性增加的胃炎患者。通过医生密切关注高风险的患者、使用更积极的抗胃炎疗法和更频繁的内窥镜检查，本发明的此项试验使这些患者受益。
和在鼻咽癌(Lo，Y.M.D.et al.，Clin.Cancer Res.，591188-1191(1999)；Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，595452-5455(1999))或某些淋巴瘤(Lei，K.I.et al.，Br.J.Haematol.，111239-246(2000)；Drouet，E.et al.，J.Med.Virol.，57383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，Int.J.Cancer，84442-448(1999))中类似，循环EB病毒DNA在临床上可用来诊断和监测患EBER-阳性肿瘤的胃癌患者。最近，循环EB病毒DNA能够预示鼻咽癌发生的重要作用表明，测定EB病毒DNA对预示胃癌有很重要的作用。
本发明的方法也适用于检测、监测患者患非头颈癌和淋巴恶性肿瘤的前兆，这些癌症都和EB病毒相关。和某些肝癌(Sugawara et al.，Virology.256196-202(1999))一样，这些瘤也和EB病毒感染有关(Bonnet et al.，JNatl Cancer Inst.911376-81(1999))。
本发明的方法也可以应用于检测、监测胃炎的前兆。EB病毒DNA可以在非瘤性的胃病，比如胃炎中检测到。众所周知，某些类型的胃炎和EB病毒感染有关(Yanai et al.，J Clin Gastroenterol.2939-43，1999)。某些类型的胃炎使患者易于产生肠组织变形，肠组织变形反过来又使患者易患胃癌(Yoshimura et al.，J Clin Pathol.53532-6，2000)。
虽然日本的Yanai仅研究了20个胃炎患者，并在一定比例的胃炎患者和这些患者的胃的上皮中发现了EB病毒，但EB病毒和胃炎这二者的相关性还没有建立。最近德国的Hungermann对多于242个病情由轻微至严重的慢性胃炎患者的研究表明，这些患者感染EB病毒的非常少，推断EB病毒感染胃的上皮细胞不是胃癌发生中的事件。
本发明包括发现可以通过简单的血液试验鉴别出EB病毒对胃上皮组织的感染。以前，只有当EB病毒感染了淋巴或其它非上皮组织，才可以使用相似的方法检测。因为众所周知，上皮细胞可抵抗EB病毒感染。本发明展示了全新的概念和机遇，首先鉴别出感染了EB病毒的胃炎患者，随后，研究了这些胃炎患者以后对胃癌的易感性增加的可能性。通过医生密切关注高风险的患者、使用更积极的抗胃炎和抗病毒疗法和更频繁的内窥镜检查，本发明的检测法使这些患者受益。
本发明的另一个目的是关注感染导致癌症的EB病毒危险性很高的患者。事实证明，体内含有H2型、BW46和B17型HLA抗原的患者感染导致鼻咽癌的EB病毒的倾向很大。其他由于疾病的原因，无免疫能力的患者，比如感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)，或者那些在器官移植后接受免疫抑制剂治疗的人也有很大的危险。本发明显示，肿瘤细胞内含有EB病毒DNA的胃癌病例可以被很容易地检测到。而且，甚至对肿瘤细胞内没有EB病毒DNA的病例而言，只要在附近的上皮中出现了EB病毒感染的淋巴细胞或其它细胞，胃癌就可以被检测到。总之，无论肿瘤是EB病毒DNA阳性或阴性，大约35％的胃癌病例可以由本发明检测到。
本发明新的方法将对监测患者有很大的帮助，因为EB病毒感染的直接或间接的结果，都使患者有很高的危险发展为各种癌症。根据本发明，除了淋巴癌之外，胃癌也应加入到被监督的疾病名单内。
在用实体组织评价EB病毒DNA时，将活组织样品包埋入石蜡中并切片，切片厚度5um。参照试剂盒生产厂家的说明用Qiagen组织试剂盒提取DNA。最终洗脱液50μl用于DNA研究。
任何常规的DNA扩增或信号扩增方法都可以用于检测EB病毒DNA。在大多数情况下，用本领域熟知的几个核酸扩增方法中的任何一个扩增靶序列即可。特别是，核酸扩增为核酸扩增子(拷贝)的酶促合成反应，所述核酸扩增子包含一段和被扩增的核酸序列互补的序列。本领域中用的核酸扩增方法的例子包括聚合酶链式反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，连接酶链式反应(LCR)，和与转录相关的扩增(TAA)。
当样品中的靶序列的量很少时，核酸扩增尤其有益。通过扩增靶序列和测定合成的扩增子，试验的灵敏度可大大提高，因为为了更好的保证检测到样品中属于生物或病毒的核酸，在试验的开始需要很少的靶序列。
核酸扩增的方法已在文献中详细描述，例如PCR扩增，在Mullis等在美国的专利4,683,195，4,683,202和4,800,159以及Methods inEnzymology，155335-350(1987)中有说明。SDA方法在Walker的PCRMethods and Applications 325-30(1993)，Walker et al.in Nucleic AcidsRes.，201691-1996(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.，89392-396(1991)中记载。LCR在美国专利5,427,930和5,686,272中有说明。不同的TAA形式在出版物如Burg等的美国专利5,437,990、Kacian等的美国专利5,399,491和5,554,516以及Gingeras等的国际申请PCT/US87/01966、国际申请WO 88/01302、国际申请PCT/US88/02108、国际申请WO88/10315中有说明。
实时定量PCR是监测EB病毒DNA的较优选的方式，它的基础是持续的对荧光PCR反应进程进行光学监测(Heide et al.Genome Res.6986-694，1996 and Lo et al.Am J.Hum.Genet.62768-775，1998)。在这个系统中，除了常规PCR用的两个扩增引物外，还包含一个双标记的荧光杂交探针(Livak，et al.PCR Methods Appl.，4357-362，1995)。一种荧光染料作为报告基团(FAM)，它的发射光谱被第二个荧光染料(TAMRA)淬灭。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶(9)的5′到3′的外切核酸酶活性从探针上切掉报告基团，这样报告基团从淬灭基团上脱离，导致在518nm的荧光发射量增加。
本发明的方法通常包括步骤(1)从患者获得血液样品；(2)从血液样品中提取DNA；(3)测量血液样品中存在的循环EB病毒DNA的量；和(4)将血液样品中存在的循环EB病毒DNA的量与对照作比较。
血液样品优选用离心方式分离，得到液体组分，测量液体组分中的EB病毒DNA。
本领域的技术人员清楚从血液样品中提取DNA的许多熟知的方式。优选的方式是用QIAamp血液试剂盒。
也可以用许多熟知的或新的方法中的一种测量循环EB病毒DNA的量。特别优选的方法为包含实时的PCR扩增系统的方法。为了从统计学上评估所得值的显著性，可以容易地设计将测定的EB病毒DNA水平和对照相比较的标准方法。
根据样品中出现的循环EB病毒DNA的量和临床发展的关系，本领域技术人员可以容易的制定合适的诊断标准。然而，每毫升胃癌患者血清中出现的EB病毒DNA通常至少约为200拷贝，更优选至少约为500拷贝，更优选至少约为1000拷贝。1ml血清中有500拷贝EB病毒DNA的分界点(cut-off point)仅适用于在测定时得了癌症而且癌细胞中有EB病毒DNA的病例。因为在只有EB病毒浸润淋巴细胞而癌细胞中无EB病毒DNA的胃癌患者中，EB病毒DNA水平很低。每毫升血清中EB病毒DNA拷贝水平低也是那些只患有胃炎的患者的特征。
EB病毒DNA的拷贝数可以随时测定，并和疾病的发展和复原(regression)相关。所以，本发明提供了一种非侵入的针对胃癌、胃炎和某些其它癌症的诊断和后续监测的方法。值得注意的是，500拷贝的分界点仅适用于在试验时就已经得了癌症的病例。因为淋巴细胞浸润的患者EB病毒DNA的水平很低。
在另一方面，本发明的特征为诊断试剂盒，包括检测患者血清或血浆中EB病毒DNA的合适的试剂。本发明的试剂盒可进一步包括一个或多个从患者取血样的装置，一个从血样中分离EB病毒DNA的装置和定量血液样品中的EB病毒DNA的装置。这样的试剂盒对诊断、检测、监测和确定患者患胃炎、胃癌和某些其他非头颈癌和淋巴恶性肿瘤的前兆很有作用。
在说明书中引证的所有出版物和专利申请都收录入参考文献。
虽然为了达到清楚理解的目的，上述的发明已经用图示和实施例详细说明，但是本领域的普通技术人员在本发明的指导下可以很容易的明白，在不背离本发明的主旨和权利要求的范围情况下可以对本发明作变化和修饰。
实施例以下的实施例仅作说明用，并不是为了限制本发明。本领域技术人员会很容易地知晓各种非关键的参数，这些参数的变化或更改会产生基本相似的结果。
实施例1材料和方法香港威尔士王子医院的51个胃癌患者在知情同意的情况下参加试验。在外科手术切除肿瘤之前抽取血样，手术后，用肿瘤的切片作原位杂交分析EBER(小的EB病毒编码的RNA)，也从30个没有患癌症证据的胃炎患者、和197个明显健康的对照受试者中抽取血样。
从血浆样品中提取DNA，收集每个受试者的外周血(5ml)放入含有EDTA的试管中，分离血浆。血液样品在1600Xg离心，将血浆小心的从含有EDTA的试管转移到聚丙烯试管中。在进行下一步操作前将样品储藏在-20℃。使用生产厂家推荐的血液和体液的操作规程(2)，用QIAamp血液试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从血浆样品中提取DNA。用血浆样品(130-800μl/柱)提取DNA。记下确切的量，计算靶DNA的浓度。使用提取柱上流出的最终的洗脱液50μl。
用实时定量PCR系统测量循环EB病毒DNA浓度，即EB病毒基因组用BamHI-W酶切后的片段区域的浓度(Lo，Y M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999))，实时定量PCR的原理和反应过程在以前已说明(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999))。用ABI Prism 7700序列检测仪收集数据，用Applied Biosystems公司开发的Sequence DetectionSystem软件(1.6.3版)分析数据。结果以每毫升血清中的EB病毒基因组拷贝数表示。
所有的血清DNA样品都用于实时PCR分析β-球蛋白基因(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999))，所有的待测样品都会有阳性信号，这样可以显示提取DNA的质量。在每个分析中包含多个阴性的水空白。
具体地，已经专门开发了两个实时定量PCR系统用于EB病毒DNA检测(a)一个针对BamHI-W区；和(b)另一个针对EBNA-I区(Baer，etal Nature，310207-211，1984)。BamHI-W系统由扩增引物(SEQ ID NO1)W-44F(5’-CCCAACACTCCACCACACC-3’)、和(SEQ ID NO2)W-119R(5′-TCTT AGGAGCTGTCCGAGGG-3′)、双标记的荧光探针(SEQ IDNO3)W-67T(5′-FAM)CACACACTACACACACCCACCCGTCTC(TAMRA)-3′组成。
EBNA-1系统由扩增引物(SEQ ID NO4)EBNA-1162F(5’-TCATCATCATCCGGGTCTCC-3’)、和(SEQ ID NO5)EBNA-1229R[(5’-CCTACAGGGT-GGAAAAATGGC-3’)、双标记的荧光探针(SEQ IDNO6)EBNA-1186T[5’-(FAM)CGCAGGCCCCCTCCAGGTAGAA(TAMRA)-3′]组成。为防止探针在PCR反应中延伸，荧光探针包含一个封闭3’端的磷酸基团。用Primer Express软件(Perkin-Elmer Corp.，FosterCity，CA)设计引物和探针的组合。从GeneBank序列数据库得到EB病毒基因组序列的数据(登录号V0l555)。如以前Lo，等(Lo，et et al.，Am J.Hum Genet 62768-775，1998)所述，β-球蛋白基因的实时定量PCR由引物和探针组成，而且用作血浆DNA扩增的对照。
在50μl反应液中用TaqMan PCR Core Reagent试剂盒(Perkin-ElmerCorp.)中提供的成分(除了荧光探针和扩增引物之外)建立荧光PCR反应。荧光探针是由Perkin-ElmerApplied Biosystems公司根据定制合成的。PCR引物是由Life Technologies公司(Gaithersburg，MD)合成。每个反应中有5pl 10×缓冲液A；300nM的每种扩增引物；相应的25nM(对EB病毒探针而言)或者100nM的(对β-球蛋白探针而言)荧光探针；4mM的MgCl2；dATP、dCTP、dGTP各200μm；400μm dUTP；1.25单位的AmpliTaq Gold；0.5单位的AmpErase尿嘧啶N-糖基化酶。
在Perkin-Elmer Applied Biosystems公司生产的7700序列检测仪内的规格为96孔的反应板上进行DNA扩增。每一个分析样品都有双份。每次分析都使用多个阴性的水空白。
用从EB病毒阳性的细胞系Namalwa(ATCC CRL-1432；参见Klein etal.，Int J.Cancer，1044-57，1972)中提取的DNA作为标准，每次分析中重复制作标准曲线。Namalwa是在每个细胞中含有两个整合的病毒基因组的二倍体细胞系。将每一个二倍体细胞6.6pgDNA的换算因数用于计算拷贝数(Saiki et al.，Science，239487-491，1988)。每毫升血浆的EB病毒基因组的拷贝数以循环的无细胞EB病毒DNA的浓度表示。
对EBV BamHI-W和EBNA-IPCR系统使用相同的热分布图。热循环最初是50℃保温2分钟，以使得尿嘧啶N-糖基化酶作用，然后在95℃初次变性10分钟，然后又进行40个循环，每个循环为95℃ 15秒、56℃ 1分钟。
扩增的数据由7700序列检测仪收集并储存在Macintosh计算机(Apple Computer，Cupertino，CA)中，然后用Perkin-Elmer AppliedBiosystems公司开发的Sequence Detection System软件分析数据。每次重复检测的平均数进一步用于浓度的计算。血浆EB病毒DNA浓度或者β-球蛋白基因的浓度(以拷贝/毫升表示)用下述的公式计算C=Q×VDNAVPCR×1Vext]]>
其中，C表示血浆中的靶的浓度(拷贝/毫升)，Q表示在PCR中由序列检测仪测定的靶的数量(拷贝数)，VDNA表示提取后所得的DNA的总体积(总共为50μl/Qiagen提取物)，VPCR表示用于PCR的DNA溶液的体积(总共为5μl，Vext表示提取的血浆/血清的体积(一般为0.13-0.80毫升)。
如以前的方法所述(Hui，P.K.et al.，Hum.Pathol.，25947-952(1994))，使用EBER的与荧光素结合的寡核苷酸探针对在石蜡中包埋的组织切片进行原位杂交，测定肿瘤细胞中出现的EB病毒。
结果总共有51个胃癌患者接受试验，在这一群人中，5个胃癌患者是EBER阳性(图1A)，14个病例的肿瘤细胞为EBER阴性，但偶尔出现了EBER阳性的浸润淋巴细胞(图1B)。这14个病例被归类为EBER阳性背景。
图2显示了这三组患者的循环EB病毒DNA的水平差异。对EBER阳性的每一个病例都测定了血清中的EB病毒DNA。(血清EB病毒DNA浓度的中值1063拷贝/毫升，四分位数间距485-5141拷贝/毫升)在32个阴性病例的任何一个中，在血清中没有检测到EB病毒DNA(图2)。
14例具有EBER阳性背景的患者中，13例(93％)可以检测到血清EB病毒DNA。这些病例的血清EB病毒DNA浓度中值处于中间，为50拷贝/毫升(四分位数间距为42-98拷贝/ml)。这三组数据的差异在统计学上有显著意义(p＜0.001，Kruskal-Wallis试验)。
Pairwise多重比较分析表明在EBER阳性和EBER阴性的组之间存在显著差异(p＜0.05，Dunn′s法)，在EBER-背景和EBER-阴性的组之间也存在显著差异(p＜0.05，Dunn′s法)。
在30个胃炎患者的血清样品中有7个可以检测到EB病毒DNA(23％)，在作为对照的197个健康人中有7个检测到EB病毒DNA(3.6％)。这两组患者血清中EB病毒DNA阳性的比例有显著差异(CHI-SQUARE试验，p＝0.028)，甚至在检测到了循环EB病毒DNA的病例中，血清EB病毒DNA实际的浓度通常比EBER阳性的胃癌患者中要低。
将在血清中可以检测到EB病毒DNA的EBER阳性背景的胃癌病例和胃炎患者以及对照受试者进行了比较，这三组血清EB病毒DNA的浓度已在图3中标注。这三组受试者的循环EB病毒DNA水平之间在统计学上没有显著差异(Kruskal-Wallis试验，p＝0.296)。
讨论这些数据表明在一定比例的胃癌患者的血清样品中可以检测到无细胞的EB病毒DNA。此外，这些数据还表明在可检测到血清EB病毒DNA和肿瘤的EBER状况之间有一种令人感兴趣的关系。因此，EBER阳性的胃癌患者和血清中高水平的EB病毒DNA有关，EBER阳性背景的胃癌病例和中等水平的EB病毒DNA有关。EBER阴性的病例中没有发现血清EB病毒DNA。这一试验进一步表明血浆和血清是监测癌症的材料的非侵入的来源(Anker，P.et al.，Cancer Metastasis Rev.，1865-73(1999))。
和鼻咽癌(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999)；Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，595452-5455(1999))以及某些淋巴癌(Lei，K.I.etal.，Br.J.Haematol.，111239-246(2000)；Drouet，E，et al.，J.Med.Virol.，57383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，Int.J.Cancer，84442-448(1999))的情况相似，临床上，循环EB病毒DNA可用于诊断、监测具有EBER阳性肿瘤的胃癌患者。最近，EB病毒DNA在预示鼻咽癌中的价值显示出来。现有的数据(Lo，Y.M.D.et AL.，Cancer Res.，606878-6881)表明EB病毒DNA测定在预示胃癌中也有很重要的作用。
测定背景为EBER阳性的胃癌中的循环EB病毒DNA是很有趣的。EBER阳性淋巴细胞浸润的肿瘤组织可能是在这些病例的血清中可检测到的低水平的EB病毒DNA的来源。如果这是正确的，进一步的工作就可以阐明EBER阳性淋巴细胞释放EB病毒的机制。机制可能是DNA活跃释放(Rogers，J.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，691685-1689(1972))和一部分细胞中裂解性的EB病毒感染的活化。
循环EB病毒DNA和EBER阳性浸润淋巴细胞表明在非瘤性炎症的情况下，也可见到低水平的循环EB病毒DNA。实际上，循环EB病毒DNA出现在胃炎患者中。作为对照，在明显健康的对照人群中有3.6％检测到了血清EB病毒DNA。在明显健康的受试者中也出现了低水平的循环EB病毒DNA，这在以前的研究中报道过(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999)，Shotelersuk，K.et al.，Clin.Cancer Res.，61046-1051(2000))。在那些可检测到血清EB病毒DNA的胃炎患者和作为对照的健康人中，病毒DNA的浓度和那些EBER阳性背景的胃癌病例中的非常相似(图3)。正如以上给EBER-背景的胃癌所作假定一样，这一发现表明可能是胃炎患者或作为对照的健康人群的EB病毒阳性的淋巴细胞释放了循环的EB病毒DNA。关于循环EB病毒DNA的水平，在这27个检测到血清EB病毒DNA的病例中，26个的水平低于500拷贝/毫升。然而，5个EBER阳性的胃癌患者中，有4个(80％)的循环EB病毒DNA水平高于500拷贝/毫升。在以前的研究中(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，591188-1191(1999))，57个鼻咽癌患者中，有48个(84％)的循环EB病毒DNA水平高于500拷贝/毫升。这一分析表明血浆/血清中EB病毒DNA浓度为500拷贝/毫升可能是高特异性鉴定这些癌症患者的实用诊断分界值。预期将有大量的临床研究中进一步改进该诊断的分界值。
明显健康的人的血液中存在低水平的循环EB病毒DNA，这一现象的长期的重要意义还有待阐明。重要的是，进一步的研究应该说明这些个体患EB病毒相关疾病的风险增大的可能性。这一问题对公众健康和生物学有重要意义。
从生物学上说，测定EBER阳性的胃癌患者循环EB病毒DNA可能能够提供与血浆中来源于肿瘤的DNA的清除率有关的重要信息。对这个问题还知道得很少，因为以前对来源于肿瘤的DNA的清除动力学研究都是针对接受放射治疗(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，602351-2355(2000))和化学治疗(Lei，K.I.et al.，BR.J.Haematol.，]111239-246(2000))的患者进行的。从这些以前的研究中建立的动力学参数代表了(a)由于治疗导致肿瘤细胞死亡，和(b)从血浆中清除来源于肿瘤的DNA的复合结果。由于胃癌最主要是通过外科切除手术来治疗，这个新的模型系统可能提供了在单一时间点也就是在手术中切除肿瘤后关于清除来源于肿瘤的DNA的信息。就像知道胎儿DNA是如何从母体血浆中清除(Lo，Y.M.D.et al.，AM.J.Hum.Genet.，64218-224(1999))一样，这些信息将使人们更加明白血浆中DNA在体内是如何被清除的。
现有的数据也表明，循环EB病毒DNA可能在许多和EB病毒有关的其他癌症类型中很有用。这样的癌症例子包括乳腺癌(Bonnet，M.et al.，J.Natl.Cancer Inst.，911376-1381(1999))和肝细胞癌(Sugawara，Y.et al.，Virology，256196-202(1999))。因为肿瘤类型和EB病毒的关系仍有争议，测定这些肿瘤患者血浆中的EB病毒DNA就可能对解决这些问题有帮助。
(SEQ ID NO1)W-44F(5′-CCCAACACTCCACCACACC-3′)(SEQ ID NO2)W-119R(5’-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3’)(SEQ ID NO3)W-67T[(5′-FAM)CACACACTACACACACCCAC-CCGTCTC(TAMRA)-3’](SEQ ID NO4)EBNA-1162F(5′-TCATCATCATCCGGGTCTCC-3′)(SEQ ID NO5)EBNA-1229R(5’-CCTACAGGGT-GGAAAAATGGC-3’)(SEQ ID NO6)EBNA-1186T[5′-(FAM)CGCAGGCCCCCTCCAGGTA-GAA(TAMRA)-3 ′]
权利要求
1.确定患者由胃炎发展为胃癌的增大的可能性的方法，包括(a)从胃炎患者处取得来源于血液的无细胞液体样本；和(b)测定所述液体中是否存在EB病毒，如果存在病毒表明患者发展为胃癌的可能性增大。
2.根据权利要求1所述的方法，包括步骤(1)从患者取血样；(2)从所述血样中得到液体组分；(3)从所述液体组分中提取DNA；和(4)测量在所述液体组分中存在的循环EB病毒DNA的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括步骤(5)将存在于液体组分中的循环EB病毒DNA的量和对照进行比较。
4.根据权利要求1所述的方法，其中每毫升液体组分中至少含有约500拷贝EB病毒DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中每毫升液体组分中至少含有1拷贝EB病毒DNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液是血浆样本。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定包括使EB病毒核酸和核酸探针的杂交。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定是在聚合酶链式反应基础上的测定。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者已经被诊断患有慢性胃炎。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者可以被诊断为胃癌，且癌细胞不含有EB病毒核酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者可以被诊断为胃癌，且癌细胞含有EB病毒核酸。
12.一种诊断、检测、监测或者确定患者患非头颈癌或者淋巴恶性肿瘤的前兆的方法，包括测定所述患者血清或血浆中存在EB病毒DNA的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，包括步骤(1)从患者取血样；(2)从所述血样中得到液体组分；(3)从所述液体组分中提取DNA；和(4)测量所述液体组分中存在的循环EB病毒DNA的量。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括步骤(5)将存在于所述液体组分中的循环EB病毒DNA的量和对照进行比较。
15.诊断、检测、监测或确定患者患胃炎前兆的方法，包括测定所述患者血清或血浆中存在EB病毒DNA的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，包括步骤(1)从患者取血样；(2)从所述血样中得到液体组分；(3)从所述液体组分中提取DNA；和(4)测量在所述液体组分中存在循环EB病毒DNA的量。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括步骤(5)将出现在所述血液中的循环EB病毒DNA的量和对照进行比较。
18.确定患者由胃炎发展为胃癌的增大的可能性的试剂盒，在单个试剂盒产品中包括(a)测定患者血液中EB病毒的核酸；以及(b)说明如何使用核酸测定EB病毒是否存在的说明书，以及当患者血液中存在病毒时，对所述患者发展为胃癌的增加的可能性的解释。
19.测定患者血清或血浆中EB病毒DNA的诊断试剂盒，包括测定血清或血浆中EB病毒DNA的合适的试剂。
20.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包括从患者取血样的装置。
21.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒包括从血样中分离EB病毒DNA的装置。
22.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒包括定量测量血样中的EB病毒DNA的装置。
全文摘要
本发明的特征是提供了通过检测或者测量患者血清或血浆中存在的EB病毒DNA，诊断、检测、监测和确定患者患胃癌、非头颈癌、淋巴恶性肿瘤和胃炎的前兆的方法。本发明的另一个特征是含有适于检测患者血清或血浆中的EB病毒DNA试剂的试剂盒。
文档编号G01N33/569GK1489634SQ0280425
公开日2004年4月14日 申请日期2002年1月30日 优先权日2001年1月31日
发明者卢煜明, 陈咏仪, 吴国伟 申请人:香港中文大学