专利名称：包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物的制作方法
包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物
背景技术：
藻胆蛋白和它们的串联染料是在流式细胞术中被广泛地用作荧光标记的重要的荧光染料。通过使用由一个激光线激发的单一供体染料来提供具有截然不同的发射光谱的另外的荧光染料，串联染料的使用已经扩宽了流式细胞术中的延伸的多色分析的能力。当使用多色组合物中的许多串联染料时，在区分荧光信号方面可能会发生困难。 迄今为止，本领域一般将这些“困难”归咎于染料的不稳定性。但是，对于处理这些问题没有任何明确的答案或者暗示。因此，在本领域中仍然需要采用偶联有藻胆蛋白的配体的独特组合的组合物和方法来用于分析。尤其是，在本领域中仍然需要含有藻胆蛋白的串联染料组合物，该组合物可限制本领域中已知的组合物所面临的随着时间的降解。

发明内容
为了便于理解，在下文的发明内容和具体实施方式
中应用于藻胆蛋白、配体、染料或者种类的术语“第一”、“第二”、“第三”，是用于将存在于相同的组合物中的一种藻“胆蛋白、配体、染料或者种类分别与另一种藻胆蛋白、配体、染料或者种类区分开来。这些术语并不是用来确定数量、次序或者重要度。在一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含偶联至第一串联染料的第一配体。第一串联染料包括含有交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白和偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料。所述组合物也包含未偶联的第二藻胆蛋白。第一藻胆蛋白和第二藻胆蛋白来源于第一(即相同的)细菌种类或者真核藻种类。在一个实施方式中，第一藻胆蛋白和第二藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，第一和第二藻胆蛋白是不同的，并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在另一个方面中，如上所述的组合物更进一步地包含偶联至第二串联染料的第二配体。第二串联染料包括第三藻胆蛋白和偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料。所述第三藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。这个组合物也包括含有亚基的未偶联的第四藻胆蛋白。所述第四藻胆蛋白也来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二和第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二和第三藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在更进一步的方面中，如上所述的组合物包含偶联至第三串联染料的第三配体。 第三串联染料包含第五藻胆蛋白和偶联至所述第五藻胆蛋白的第三伴侣染料。所述第五藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第五藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。所述组合物也包含未偶联的第六藻胆蛋白。所述未偶联的第六藻胆蛋白含有亚基并且所述未偶联的第六藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中， 所述第一、第二、第三、第四、第五和第六藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第六藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白，并且所述第六藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在另一个实施方式中，如上所述的组合物也包含偶联至第四串联染料的第四配体。第四串联染料包括第七藻胆蛋白和偶联至所述第七藻胆蛋白的第四伴侣染料。所述第七藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第七藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。所述组合物也包含未偶联的第八藻胆蛋白。所述未偶联的第八藻胆蛋白含有亚基并且所述未偶联的第八藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第八藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七藻胆蛋白， 并且所述第八藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在另一个方面中，任何上述的组合物包括一种以上偶联至并非藻胆蛋白的染料的附加配体。在另一个方面中，上述组合物包含偶联至所述第一串联染料的所述第一配体和所述未偶联的第二藻胆蛋白，并且上述组合物还包括一种以上偶联至来源于所述第一细菌或者真核藻种类的第三藻胆蛋白的附加配体。在一个实施方式中，所述第三藻胆蛋白与所述第一藻胆蛋白或者第二藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第三藻胆蛋白不同于所述第一藻胆蛋白或者第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在更进一步的方面中，上述组合物包含偶联至所述第一串联染料的所述第一配体和所述未偶联的第二藻胆蛋白，并且上述组合物还包括(a)偶联至第二串联染料的第二配体和(b)未偶联的第四藻胆蛋白。第二串联染料包括第三藻胆蛋白和偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料。所述第三藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类。所述未偶联的第四藻胆蛋白含有亚基，并且所述未偶联的第四藻胆蛋白来源于所述第二细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第三和第四藻胆蛋白是相同的。在更进一步的实施方式中，所述第三和第四藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在更进一步的方面中，本发明提供了用于分析样品中细胞种群和非细胞种群的方法。所述方法包括混合所述样品和本文所描述的组合物；以及通过分析荧光来鉴定所述样品中的所述种群。理想地，所述细胞种群和非细胞种群中的至少一种包括所述第一配体的受体。权利要求书中本发明的不同实施方式的其它方面和优势将在下面的具体实施方式
中公开。


图1A-3J是双色和三色试剂组合物的双参数频率图，其中两种不同的荧光染料的荧光强度相对于相同全血样品的不同细胞种群进行绘图。这些频率图表明储存期间通过使用不同含量的游离的藻胆蛋白，提高了本文所描述的配体-染料组合物的稳定性。图IA提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用现有技术中可用的包含配体/染料偶联物(即CD3-别藻蓝蛋白(APC) (0.5yg))和配体/串联染料偶联物 (即CD19-APC-AlexaFluor 750串联染料(0. 5 μ g))的试剂组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备，该试剂组合物由在2至8°C下单独储存21天的组分新鲜配制，并且样品表明了该试剂组合物的效果。这两个偶联物中的APC是来自相同的细菌种类，即钝顶螺旋藻(Spirulina platensis) 0没有游离的(未偶联的)APC存在。图IB提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用现有技术中可用的包含 CD3-APC(0. 5 μ g)和 CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)的组合物，即“现有技术的储存混合物”而被制备，该组合物在2至8°C下预配制并且保留了 21天，并且该样品表明了该组合物的效果。这两个偶联物中的APC是来自相同的细菌种类，即钝顶螺旋藻。 没有游离的(未偶联的)APC存在。图IC提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用本文中所描述的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)和未偶联的 APC(0.5 μ g)的双色试剂组合物而被制备，该试剂组合物由在2至8°C下单独储存21天的组分新鲜配制，并且该样品表明了该组合物的效果。图ID提供了相同的被制备样品的双参数频率图，该样品通过使用本文中所描述的包含0034卩((0.5“8)、0)194卩(41613卩11101~<1)750串联染料(0. 5 μ g)和未偶联的 APC (0. 5 μ g)的双色试剂组合物而被制备，该试剂组合物在2至8°C下预配制21天，并且该样品表明了该组合物的效果。将图IA和IB和图IC和ID相对比。图2A提供了经新鲜制备的对照样品的双参数荧光频率图，该样品通过使用现有技术中的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)禾口 CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)的双色试剂组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备。图2B提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了现有技术中的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)禾口 CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)并且在 2 至 8°C下保留了 21天的双色试剂组合物，即“现有技术储存混合物”。图2C提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)禾口 0. 0625 μ g 天然的、 未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。图2D提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC(0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)和 0. 125 μ g 天然的、未偶联的APC并且在2至8°C保留了 21天的双色试剂组合物。图2E提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含⑶3-APC(0. 5μ g)、⑶19-APC-AlexaFluor 750串联染料(0. 5 μ g)和0. 25 μ g天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。图2F提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC(0. 5μ g)、CD19-APC-AlexaFluor<g>750 串联染料(0. 5 μ g)和 0. 5 μ g 天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。图2G提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor· 750 串联染料(0. 5 μ g)和 2. 0 μ g 天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。
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图2H提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC(0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor 750 串联染料(0. 5 μ g)和 5. 0 μ g 天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。图21提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含 CD3-APC (0. 5 μ g)、CD19-APC-AlexaFluor · ‘ 750 串联染料(0. 5 μ g)禾口 10 μ g 天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 21天的双色试剂组合物。图2A和2B与图2C至图21比较，表明本文所描述的组合物与现有技术的组合物相比，稳定性得到提高。图3A-3J是通过使用三色试剂组合物得到的双参数频率图，其中两种不同的荧光染料的荧光强度相对于相同全血样品的不同细胞种群进行绘图。图3A和图:3B提供了经新鲜制备的样品的荧光频率图，该样品通过使用现有技术中的包含 CD4-XL-APC-AlexaFluor 700 串联染料、CD19-APC 和 CD8-XL-APC_AlexaFluor 750串联染料的组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备。提供这些频率图用于和图 3E-3J进行比较。图3C和图3D提供了样品的荧光频率图，该样品使用了现有技术中的包含 CD4-XL-APC-AlexaFluor 700 串联染料、CD19-APC 和 CD8-XL-APC_AlexaFluor 750 串联染料并且在2至8°C下保留了 120天的组合物，即“现有技术的储存混合物”。提供这些频率图用于和图3E-3J进行比较。图3E和图3F提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含 CD4-XL-APC-AlexaFluor 700 串联染料、CD19-APC 和 CD8-XL-APC_AlexaFluor 750 串联染料以及0. 5 μ g天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 120天的组合物。图3G和图3H提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含 CD4-XL-APC-AlexaFluor 700 串联染料、CD19-APC 和 CD8-XL-APC_AlexaFluor 750 串联染料以及1. 0 μ g天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 120天的组合物。图31和图3J提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含 CD4-XL-APC-AlexaFluor 700 串联染料、CD19-APC 和 CD8-XL-APC_AlexaFluor 750 串联染料以及2. 0 μ g天然的、未偶联的APC并且在2至8°C下保留了 120天的组合物。图4提供了波长(A28tl)相对于从钝顶螺旋藻分离的具有不同交联度的APC样品、 和从钝顶螺旋藻分离且没有交联的一种(I)APC样品的大小排阻层析保留体积的绘图。通过计算洗脱峰下的面积来确定APC中的交联百分比。完整的峰的积分面积比上色谱中总面积的比值给出了样品的交联百分比。在图右侧的最高峰对应的是所述的一个(1)未交联的 APC样品。图中剩余的峰对应的是交联的APC样品。具体地讲，图左侧的峰对应的是完整的 APC分子，而图右侧的小峰(未交联的APC的峰下面)对应的是APC亚基。图5是示意图， 显示当被包含藻胆蛋白和可发荧光的(fluorescable)染料的串联染料所标记的配体与被藻胆蛋白所直接标记的配体一起储存时，随着时间发生的亚基互换。小括号Γ)代表交联， Ll代表第一配体，L2代表第二配体，“染料”代表可发荧光的(fluorescable)染料，“ α ”代表所述藻胆蛋白的一种亚基，和“β ”代表所述藻胆蛋白的第二种亚基。术语“交联”或者其变型术语指的是通过不易断裂的共价键进行的分子单元连接。
具体实施例方式本文描述的组合物和方法针对多色试剂制剂中与包含藻胆蛋白的串联染料的降解或者不稳定性相关的困难提供了解决方法。在使用包含储存在一起的不同的抗体与藻胆蛋白和它们的串联染料的偶联物的组合物之后，本申请的发明人确定了这个问题。具体地，当偶联至不同抗体的别藻蓝蛋白 (APC)和 APC-串联染料(比如 APC. AlexaFluor 700,APC. AlexaFluor 750,APC. Cy 7 等等)的偶联物被一起储存在多色制剂中，与生物样品混合，然后用流式细胞计分析样品时， 会观察到如上所述的“困难”。与使用分开储存的相同试剂的新鲜混合物且其他条件都相同时所得到的荧光频率图相比，在所述荧光频率图中观察到补偿要求(溢波(bleed-over)) 的递增。当使用藻红蛋白(PE)和基于PE的串联染料(比如PE-德克萨斯红 、PECy 5、 PECy ’ : 5. 5,PE-AlexaFluor 647、PE_AlexaFluor 700 和 PECy 7)的抗体偶联物时，也有类似的观察现象。并不希望被理论所束缚，发明人推测当混和物相同时，在含藻胆蛋白的配体-串联染料偶联物和配体-藻胆蛋白偶联物之间发生了亚基交换，导致了在串联染料和直接偶联的藻胆蛋白之间的补偿要求(溢波)的不想要的增加。发明人观察到，当交联藻胆蛋白的偶联物比如XL. APC与相应的交联串联染料的偶联物比如XL. APC-AlexaFluor '750混合并且放置于大约2至大约8°C的温度下，单个的藻胆蛋白分子的亚基会出现交换。举例来说， 发明人观察到，当⑶3-APC和⑶19-APC-AlexaFluor 750混合并且随着时间保留在大约 2至大约8°C下，通过荧光频率图证明，显示形成了⑶3-APC-AlexaFluor 750和⑶19-APC 偶联物。图5中图示表明了藻胆蛋白亚基交换的一个方面。当然，本领域的技术人员会理解，图5的示意图中显示的一种以上的配体和/或发荧光的(fluorescable)染料可以偶联至交联的或者未交联的亚基上，并且亚基交换的不同修饰物可以出现在相同的溶液中。均从聚球藻6301 (蓝藻类细菌)分离的别藻蓝蛋白B(APC-B)和别藻蓝蛋白(APC) 之间的亚基交换，已经在文献(参见生物化学期刊256,12600(1981))中讨论过。总之，已注意到在APC-B和APC的混合物中，通过亚基交换形成了接近统计学含量的异源三聚体。 例如，已知APC具有的四级结构包含基于单独的亚基结构和氨基酸序列的疏水作用以及氢键和离子键的组合而结合的三个α亚基和三个β亚基。APC在低浓度、低ρΗ条件下且当暴露于一种以上离液序列高的离子时，APC也已知可以离解成它的亚基(α-β单体以及α 和β组分)。在这里使用的术语“离液序列高的离子”指的是可通过干扰稳定化的分子内相互作用而破坏藻胆蛋白的三维结构的试剂。已经报道了交联的APC组合物并且通过不同供应商(其中Prozymehc.和MartekBiosciences)销售的交联APC组合物。本发明人设计出本文所论述的新颖的试剂组合物以便处理不期望有的亚基交换的这个问题。本发明人发现，添加来自与配体偶联的串联染料中的藻胆蛋白相同的细菌种类的、或者能够与之交换亚基的未偶联的藻胆蛋白至包含配体偶联的藻胆蛋白串联染料的试剂组合物中，可产生相对稳定的试剂组合物。本发明内容和下面详细论述的上述这些稳定的染料组合物的不同实施方式解决了本发明人确定的现有技术多色组合物用于生物样品分析时的稳定性问题。本文描述的组合物的不同实施方式可以包含以下被标记的配体 (a)至少一种偶联至包含藻胆蛋白的串联染料的配体；(b)可供选择地一种以上直接偶联至藻胆蛋白的配体；和(c)可供选择地一种以上偶联至并非藻胆蛋白的荧光染料或标记的配体。组合物也包含至少一种未偶联的藻胆蛋白作为另一个组分，所述未偶联的藻胆蛋白可以与偶联至所述串联染料的配体上的藻胆蛋白交换亚基。
在这里使用的术语“稳定的”指的是在和生物样品混合前和/或混合后本发明的所述组合物。在一个实施方式中，“稳定的”指的是当本文描述的所述组合物被加到生物样品中、随后使用荧光分析细胞种群时，不会没有引起荧光性质的显著变化的所述组合物。理想地，“稳定(的)”指的是在所述组合物中配体偶联的串联染料和任何其它配体偶联的藻胆蛋白的荧光性质在被混合后没有发生变化。在更进一步的实施方式中，在混合其所述组分之后且在与生物样品混合之前，所述组合物是立即“稳定(的)”。在另一个实施方式中， 在混合后在大约2至大约8°C下保留组合物至少1星期直至52星期，所述组合物是“稳定 (的)”。作为另外的实施例，在混合之后至少4、10、15、20、25、30、35、40、45、50或者51个星期，这种组合物是稳定的。理想地，所述组合物在它们储藏或者使用所需要的任何温度下都是稳定的。在一个实施方式中，所述组合物在降低的温度，即温度低于室温下是稳定的。在另一个实施方式中，所述组合物在大约2至大约10°C下是稳定的。在具体实施方式
中，所述组合物在大约 2、3、4、5、6、7、8、9或者10°C下是稳定的。在又一个实施方式中，所述组合物在室温下是稳定的。在更进一步的实施方式中，所述组合物在升高的温度，即温度超过室温下是稳定的。当在用于细胞分析和非细胞分析的方法中使用本文所描述的新颖的染料组合物时，可以观察到相对于新鲜制备的组合物，用所述配体偶联的串联染料或者用所述配体偶联的藻胆蛋白进行标记的细胞的荧光性质降低了溢波或者没有溢波。参见例如本文所提供的图和实施例。更进一步地，所述染料组合物导致了错误数据的减少、由于更少损耗的染料组合物而引起的耗费减小、以及连续不断制备新鲜染料组合物(包括新鲜对照组合物)使所需要的时间减少。I.定义提供了下列定义并且下列定义包括本领域中广泛适用的信息。在此提供了某个术语的实施例，这些实施例不是排它性的并且可能包括本领域中其它已知的或者可用的实施例。因此，这种实施例并不是对本发明的限制。A. “样品”本文使用的“样品”是任何包含哺乳动物细胞的悬浮液，即包含细胞种群和/或非细胞种群的生物样品。在特定的实施方式中，提供所述样品的所述哺乳动物是人，尽管也可能采用来自其它未人的哺乳动物的样品。本领域的技术人员容易地理解术语“细胞的”和“非细胞的”。 至少一种所述细胞种群或者非细胞种群需要在上述组合物中使用的每个不同配体的受体。 典型的“细胞的”种群包括但不限于血液细胞和非血液细胞。这种样品包括但不限于全血、 周围血液、骨髓抽出物、淋巴组织、脾组织、脑脊髓液、皮肤组织、粘膜组织、胸腔穿刺液、胸膜液和脊髓液。血液的(即血)细胞种群选自单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、不成熟的粒细胞、杆状核嗜中性细胞、母细胞、变体淋巴细胞和非典型淋巴细胞。非白细胞的血液细胞种群包括红细胞、网织红细胞、有核红细胞、血小板、网织血小板和巨核细胞。在血液中，非典型的细胞包括中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、不成熟的粒细胞、杆状核嗜中性细胞、母细胞、非典型淋巴细胞、变体淋巴细胞、有核红细胞、巨血小板、浆细胞等等。非血液的细胞其中包括上皮细胞和内皮细胞。典型的“非细胞的”种群其中包括但不限于小珠、蛋白质、微粒、微粒体。
在一个实施方式中，所述样品是人的全血样品或者包含五个“正常”白细胞种群 (单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞)以及由于疾病、对不利的环境刺激(诸如致癌因子)的反应或者治疗法的结果而造成的可能地许多非典型细胞种群的周围血液样品。因此，用于通过这些方法进行分析的合适样品是可能包含成熟的和不成熟的白细胞和非白细胞种群、以及非典型细胞的病人血液样品。在一个实施例中，样品包含母细胞。在更进一步的实施例中，样品包含有核红细胞。作为另一个实施例，样品包含不成熟的粒细胞。作为又一个实施例，样品包含非典型淋巴细胞。不正常的样品中的细胞的其它组合物也可能通过本文描述的方法和组合物来分析。B. “配体”在本文所描述的组合物的所有实施方式中，术语“配体”指的是结合至存在于细胞或者非细胞颗粒表面上的受体的部分(诸如抗体)。在一个实施方式中，所述配体“偶联至”、“连接至”或者“结合于”上述串联染料的藻胆蛋白。本领域的技术人员能够容易地通过本领域中的方法将串联染料偶联至配体例如单克隆抗体。在一个实施方式中，所述串联染料通过染料的亚氨基硫烷活化而被偶联至所述配体。正如本文所定义的，配体包括可检测并且与一种以上特定受体起反应的各种试剂。所有合适的配体的特征在于所期望的其结合颗粒群体上指定受体的能力。在一个实施方式中，所述配体是可优先结合至所有的或者一部分细胞表面受体的组分。典型地，所述配体包含可以被分离的并且天然生成的或者重组制备的或者人工的或者合成的氨基酸序列或者核酸序列。在一个实施方式中，所述配体是蛋白质，例如抗体或者酶，或者其片段。在另一个实施方式中，所述配体是核酸探针。在其它实施方式中，所述配体是多分子的组合体， 诸如重组蛋白质的四聚物。可用于构建这种配体的方法是本领域技术人员已知的方法。通常对于细胞分析，定向于细胞表面决定子的抗体或者抗体片段是所选择的配体。在这里使用的术语“抗体”指的是包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的多克隆的、单克隆、 合成的或者重组的抗体。抗体片段也是有用的，并且包括但不限于上述完整的抗体的一种以上Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段或者Fc抗体片段。类似地，单链可变抗体片段或者包含抗体的互补决定区(CDR)的重组构建体可以被用作这些方法中有用的配体。此外， 共同具有足够的CDR以便保持可结合所期望细胞表面抗原的抗体的功能等效结合特性的合成抗体或者嵌合抗体或者人源化抗体构建物，可以被用作所选择的配体。在一个实施方式中，在本文所描述的组合物内使用的单独的配体或者抗体每个都可结合在所选择的样品中的细胞种群上进行差异表达的抗原决定子，并且所述单独的配体或者抗体被选择得与光散射和/或电参数的特定联合组合可提供所期望的差异信息。例如，在一个实施方式中，本文有用的抗体可结合至在白细胞和非白细胞种群上差异表达的抗原决定子。这种抗原决定子可以完全不在非白细胞上，只在白细胞上表达。可供选择地， 这种抗原决定子可以在白细胞上大量表达且在非白细胞上最少地表达。因此这种抗体允许从非白细胞(例如红细胞(RBC)、有核红细胞或者血小板)中识别和区分白细胞。还有其它实施方式采用可结合相同细胞类型或者种群上的不同决定子的一种以上抗体。因此可结合相同细胞类型或者种群上的不同决定子的不同抗体的组合物可以被用来代替结合细胞种群上一种决定子的单一抗体。在另一个实施方式中，根据当白细胞成熟和老化时白细胞上抗原决定子的差异表达，这种抗体(或者抗体组合物)也能够区分成熟的白细胞和不成熟的白细胞。可用作本文所描述的组合物中的配体和用于血液分析的抗体具体包括但不限于其中本领域中已知的抗⑶2、抗⑶3、抗⑶4、抗⑶5、抗⑶7、抗⑶8、抗⑶9、抗⑶10、抗⑶11a、 抗⑶lib、抗 CD13、抗 CD14、抗 CD15、抗 CD16、抗 CD·、抗 CD18、抗 CD19、抗 CD20、抗⑶23、 抗 CDM、抗 CD25、抗 CD33、抗 CD35、抗 CD36、抗 CD38、抗 CD41、抗 CD45、抗 CD45RA、抗 CD48、抗 CD49d、抗 CD50、抗 CD52、抗 CD53、抗 CD55、抗 CD56、抗 CD59、抗 CD61、抗 CD62L、抗 CD62p、抗 CD64、抗 CD66b,ii CD66c、抗 CD73、抗 CD82、抗 CD87、抗 CD90、抗 CDl 17、抗 CD142、抗 0)2:3 、 抗 CD235b、抗 CD235c、抗 CD236、抗 CD239、抗 CD240、抗 CD241、抗 CD242、抗 gp_42、抗 LY-6、 抗RT6、抗SCA-2、抗κ (Kappa)、抗λ (Lambda)和抗HLA-DR。很容易理解，本发明不受所述组合物中的特定配体选择的限制，并且本领域的技术人员可以选择和利用本文没有具体叙述的其它配体或者抗体，将其包括在本发明的组合物中。本发明的组合物包含一种以上配体。在一个实施方式中，所述组合物包含两种或更多配体。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种以上配体。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种以上配体。在又一个实施方式中，所述组合物包含1、2、3、4、5、6、7、 8、9或者10种配体。本领域的技术人员能容易理解，在单一试剂组合物中被使用的配体数没有“最大值”，并且配体的选择取决于使用的试剂和仪器能力。存在于单一组合物中的配体可以相同或者可以不同。在一个实施方式中，所述组合物包含两种配体并且所述配体是相同的(Li和Li)。在另一个实施方式中，所述组合物包含两种配体并且所述配体是不同的(Li和L2)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含三种配体并且所述配体是相同的(L1、L1和Li)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含三种配体并且所述配体是不同的(L1、L2和L3)。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种配体并且两种配体是相同的，一种配体是不同的(L1、L1和L2)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且所述配体是相同的(Li、Li、Li、Li)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且所有的四个配体是不同的(Li、L2、 L3、L4)。在另一个实施方式中，所述组合物包含四种配体并且任何两种配体是相同的，其他两种配体是相同的，但是不同于开头两种配体(L1、L1、L2、L2)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且任何三种配体是相同的，第四配体是不同的(L1、L1、 Ll和I^)。对于包含五种以上配体的组合物可以使用类似的级数，本领域的技术人员能够确定这种级数。参见下面的公式，其中η是配体的总数，r是不同于其他配体的配体的数目， 并且0 < r < η。
权利要求
1.一种组合物，其包含(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包含(i)含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌种类或者第一真核藻种类；和( )偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料；和(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；其中所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是相同的；或者所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是不同的，并且所述第二藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白在所述亚基之间不含交联。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白在所述亚基之间含有交联。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白是天然蛋白质。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白是被修饰的蛋白质。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白中的交联量大于所述第二藻胆蛋白中的交联量。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白被修饰以便消除或者减少荧光。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述修饰并不影响所述第二藻胆蛋白的交联。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白被漂白。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白对所述第一藻胆蛋白之比是大约0.25 1至大约10 1。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白和所述第二藻胆蛋白选自于由别藻蓝蛋白、藻红蛋白、藻青蛋白以及藻红青蛋白所构成的组。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白和所述第二藻胆蛋白选自于由R-藻红蛋白、B-藻红蛋白、Y-藻红蛋白、藻红蛋白566、藻红青蛋白、R-藻青蛋白以及别藻蓝蛋白所构成的组。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白和所述第二藻胆蛋白是别藻蓝蛋白。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一细菌种类是蓝藻类细菌。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述蓝藻类细菌选自于由钝顶螺旋藻、 多变鱼腥藻、无类囊体蓝藻、小单岐藻以及赖氏鞘氏藻所构成的组。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包含(i)含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和( )偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料； 其中所述第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于所述第一和第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，进一步包含(d)偶联至第三串联染料的第三配体，所述第三串联染料包含(i)含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和( )偶联至所述第四藻胆蛋白的第三伴侣染料； 其中所述第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二或第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二或第三藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，进一步包含(e)偶联至第四串联染料的第四配体，所述第四串联染料包含(i)含交联的和未交联的亚基的第五藻胆蛋白，所述第五藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和( )偶联至所述第五藻胆蛋白的第四伴侣染料； 其中所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白是相同的；或者所述第五藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白，并且所述第五藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
19.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含一种以上偶联至并非藻胆蛋白的染料的附加配体。
20.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含(c)偶联至第三藻胆蛋白的第二配体，所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类； 其中所述第三藻胆蛋白与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白相同；或者所述第三藻胆蛋白不同于所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述第三藻胆蛋白不含可与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
22.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
23.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述第一配体和所述第二配体是相同的。
24.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述第一配体和所述第二配体是不同的。
25.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，进一步包含一种以上偶联至并非藻胆蛋白的染料的附加配体。
26.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包含(i)含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌种类或者第二真核藻种类；和( )偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料；(d)含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于所述第二细菌种类或者所述第二真核藻种类；其中所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
27.如权利要求沈所述的组合物，其特征在于，进一步包含(e)偶联至第四藻胆蛋白的第三配体，所述第四藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类、所述第一真核藻种类、所述第二细菌种类、或者所述第二真核藻种类，其中所述第四藻胆蛋白与所述第一藻胆蛋白、所述第二藻胆蛋白或者所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二或者第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二或者第三藻胆蛋白中所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
28.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一配体包含氨基酸序列或者核酸序列。
29.如权利要求观所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸序列包括抗体、酶、重组蛋白质、多分子组合体、或者它们的片段。
30.如权利要求四所述的组合物，其特征在于，所述多分子组合体是重组蛋白质的四聚物。
31.一种用于分析样品中细胞种群和非细胞种群的方法，所述方法包括(a)将所述样品和如权利要求1所述的组合物混合，其中所述细胞种群和非细胞种群中的至少一种包含所述第一配体的受体；以及(b)通过分析荧光来确定所述样品中的所述种群。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，进一步包括确定每个所述种群的至少一种附加参数。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述附加参数是独立地选自于由一种以上荧光通道、一种以上光学参数、一种以上电参数、时间、散射及它们的组合所构成的组。
全文摘要
提供了包含(i)偶联至藻胆蛋白串联染料的配体和(ii)未偶联的藻胆蛋白的新颖组合物，其中藻胆蛋白来源于相同的细菌或者真核藻种类。藻胆蛋白一定是相同的或者是不同的，但是必须含有一些可交换的未交联的亚基。还提供了制备这些组合物、包含这些组合物或者这些组合物组分的试剂盒的方法，以及将这些组合物用于细胞和非细胞分析的方法。
文档编号G01N33/533GK102308214SQ200980156793
公开日2012年1月4日 申请日期2009年12月10日 优先权日2008年12月12日
发明者E·戈特罗, F·埃斯特韦斯·洛博里, F·马莱格, J·沃尔弗斯, L·A·沙里耶, M·A·福曼, R·K·古普塔 申请人:贝克曼考尔特公司