专利名称：：Hla遗传标记预测糖尿病肾病危险的方法及其易感基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用基因芯片检测HLA遗传标记来预测天津地区2型糖尿病患者已患有、将有可能发展成或者疑似患有肾病的一种方法，特别是使用HLA-All、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302遗传标记检测天津地区2型糖尿病患者已患有、将有可能发展成或者疑似患有肾病的一种方法。
背景技术：
：人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)是人类主要组织相容性复合物基因的编码产物，定位于第6号染色体短臂的一个狭窄区域，包含有128个功能基因和96个假基因，很多基因座位存在大量的复等位基因，具有高度的多态性。1999年确认的HLA复等位基因已达到1029个。HLA作为是人体内最复杂的遗传多态性系统,在免疫调控过程中发挥重要作用，是人类发现的第一个与疾病有明确关联的遗传系统，已发现70余种疾病与该系统有关联，DM即为其中的一种。HLA多态性检测在医学实'践和科研中具有十分重要意义，为器官、组织移植配型,疾病相关性研究,人类学及法医学上的应用等领域的发展提供了可靠的技术方法和有价值的资料。血清学方法是HLA-B抗原传统的经典分型方法，但是随着对HLA研究的深入和对分型技术要求的不断提高,以及越来越多的等位基因陆续被发现和命名，血清学方法已经无法获得足够的单特异性抗体，不能够分辨出所有的特异性，而且标准抗血清的筛选技术复杂,难度大,人力物力消耗大,另外血清学方法之间存在较多，较强的交叉反应，使HLAI、II类抗原亚型的分辨较为困难。随着生物学技术的不断发展，HLA分型技术从传统的血清学、细胞学分型转向以PCR为基本方法的基因分型。近年来对I、II类抗原的基因分型研究取得了较大进展，其中PCR-SSP、PCR-SS0、PCR-SSCP(单链构像多态性分析)3种分型方法对I类抗原的分型均获得成功。但这些方法也存在一些明显的不足,如PCR-SSP方法,主要依赖于PCR技术，对某一基因个体进行分型时往往要设计大量的引物，这将很难避免接下来PCR过程中的污染问题而导致假阳性，而且操作复杂，需要通过多次的电泳来判断最后的结果，不适合大批量样本的分型，使其在临床应用上受到限制；PCR—SSCP法对分析小于400bp的PCR扩增产物十分有效，但此法仅能探知基因变异的存在，而无法确定变异的确切位置及内容，一般仅用作HLA匹配程度的分析，而不用来进行HLA的具体分型。基因芯片是近年来兴起的一项前沿生物技术，是对传统生物技术如DNA杂交、分型和测序技术重大的飞跃和创新，是涉及到生物信息学，微电子技术，计算机科学，半导体技术等诸多自然学科的综合性技术，在生命科学领域中显出了巨大的潜能和诱人前景。基因芯片是指将许多特定的寡核昔酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于支持物上，然后与待测的标记过的样本基因进行特异性杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一个探针上的荧光信号进行检测，从而得出大量信息。基因芯片具有高度集成和并行处理的特点，所需试剂和样本量少，结果由计算机软件自动分析，是解决HLA众多等位基因分型的有效方法。由于HLA个体遗传学差异的本质是在编码其抗原产物的基因水平上，所以分析HLA基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法,其准确性远高于血清学与细胞学分型，并已逐渐取代了前两者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成为必然趋势。自从70年代HLA免疫学分型方法迅速发展并应用于人类疾病的关系研究以来，各国学者开展了HLA与DM发展关系的研究，但大多数仅限于T1DM与HLA的研究，仅有少数关于T2DM与HLA关联的研究报道，而且大多数认为HLA与T2DM的发病无关。随着对T2DM异质状况研究的深入，发现遗传学因素在T2DM的发病过程中扮演重要角色，同时发现T2DM与HLA存在着某种关联，特别是进入上世纪90年代后，分子生物学基因分型方法的广泛应用，对HLA与T2DM关联的研究又广泛开展。DiamantopoulosEJ等研究表明HLA-A3是T2DM发生早期动脉粥样硬化的保护基因；Tuomilehto-WolfE等研究发现HLA单倍型纯合子T2DM的发病率明显增加。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常见微血管并发症之一，终末期肾病是糖尿病的主要死亡原因。我国住院糖尿病患者肾脏并发症患病率为33.6%，巳成为威胁糖尿病患者生命健康的严重并发症，越来越受到医护工作者和糖尿病患者的重视。血糖控制不良及糖尿病病程长是导致糖尿病慢性并发症的主要危险因素，但并不足以解释糖尿病发生并发症的差异，研究发现遗传素质也影响糖尿病并发症的发生和发展。约30%糖尿病患者无论血糖控制如何均发生DN，而且在家族内有多发倾向。流行病学调査发现，血糖控制的好坏与最终是否发展为DN不完全成相关关系；众多关于DN家族聚集性、DN发病率在不同种族间存在很大差异的报道，均提示遗传因素参与DN的发病，但确切机理不明。HLA作为人体重要的遗传学标志，可能与DN有关。DyckR等认为在糖尿病终末期肾病患者中HLA-A2/DR4和HLA-A2/DR8单倍体频率明显增加。本课题采用寡核苷酸芯片分型方法，依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献，同时考虑遗传的连锁不平衡，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，最后设计了213条探针(HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQAP22条，HLA-DQB1*38条，HLA-DR31条)，制成基因分型芯片，这些探针可完成中分辨度分辨，完全可以满足临床配型工作的需要。通过带荧光标记的引物使待测样本经PCR扩增后所得到的目的片断带上荧光标记，PCR产物与芯片上的探针杂交，根据杂交信号强弱及位置确定样品的基因型，将此方法用于462份样本的HLAI、II类基因型分型。以HLA-B分型为例共使用3条引物(其中下游为混合引物)，66条探针,分型结果与PCR-SSP方法验证对比，结果有6种等位基因是PCR-SSP方法没有鉴别出来的，具有更大的灵敏度。用于分型的探针具有高度特异性，只要PCR扩增成功，杂交后的信号都很强，预计阳性的探针均全部出现。应用芯片检测时，每份样本只需作一次PCR，结果判读通过荧光扫描，计算机自动分析，一次可以同时检测多份样本。在分辨度选择上，我们采用了中分辨度方法。分辨度过低，只能分辨出范围较宽的抗原特异性，满足不了实际应用；分辨度过高，不但增加了分型所需时间和经费，而且过细的分型结果增加了寻找匹配供，受者的难度。而中分辨度方法能够分辨出所有血清学方法所分辨出的特异性，并可对部分等位基因的特异性作出分辨，在实际应用中定型准确快速，可实现一张芯片多人份，提高了检测的速度和准确性，适于临床推广。
发明内容本发明的目的是提供使用HLA遗传标记来预测天津地区2型糖尿病患者已患有、将有可能发展成或者疑似患有肾病的一种方法。为实现这一目的，本发明采取以下技术方案采用寡核苷酸芯片分型方法，依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献，同时考虑遗传的连锁不平衡，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，最后设计了213条探针(HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQA1*22条，HLA-DQB1*38条，HLA-DR31条)，制成基因分型芯片，这些探针可完成中分辨度分辨，完全可以满足临床配型工作的需要。通过带荧光标记的引物使待测样本经PCR扩增后所得到的目的片断带上荧光标记，PCR产物与芯片上的探针杂交，根据杂交信号强弱及位置确定样品的基因型，将此方法用于462份样本的HLAI、II类基因型分型。使用本发明提供的方法，携带HLA-All、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302遗传标记的天津地区2型糖尿病患者已患有、将有可能发展成或者疑似患有肾病的危险性明显增加。具体实施例方式1.基因探针的序列设计及处理依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献，同时考虑遗传的连锁不平衡，选择了中国北方汉族人群基因频率较高的等位基因，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，最后设计了213条探针(其中HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQAP22条，HLA-DQB"38条，HLA-DR31条)。这些探针完全可以完成中分辨率的组织配型，较临床现在常用的进口试剂盒有更高的分辨率而且可同时完成HLA-I、II类基因的检测，经NH2修饰后可用于芯片点样。我们设计了可以用来特异性扩增HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB1、HLA-DQA1有意义外显子片段的上下游引物，通过调节退火温度，上下游引物浓度等方法优化PCR扩增，并尝试用二次PCR,不对称PCR，混合PCR等方法优化荧光标记的强度，建立对PCR产物进行荧光标记的最佳方法。针对HLA-B座位的exon2和exon3区域分别设计上下游引物(下游为混合引物)，产物长度在900bp左右，序列如下正链5，—GGGTCCCAGTTCTAAAGTCCCCACG—3，，反链5，—CCATCCCCGGCGACCTATAGGAGATG—3，，5，一AGGCCATCCCGGGCGATCTAT—3'。标记PCR:50ulPCR扩增体系，通过带荧光的引物使PCR产物带上Cy3标记。根据genenmer软件及我们设计的引物，初步建立扩增条件..通过单一标本，其他条件确定的梯度PCR，摸索退火温度及循环数，使PCR保持在指数增长期，最终选择96。C5min;94°C22s、62°C50s、72°C30s，40个循环;72°C10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。为了达到最好的PCR结果，预实验中上游引物我们选择了0.1-0.5Umol/L之间的9个浓度(0.1umol/L,0.15ymol/L,0.2umol/L,0.25Pmol/L,0.3umol/L,0.35umol/L,0.4umol/L,0.45Pmol/L,0.5Pmol/L)，每个浓度与下游引物的比例分别为1:1，1:50，1:100,共27组，以一个模板用同样条件进行PCR，以最终PCR产物电泳结果的亮度来确定哪个PCR条件最佳，上游引物浓度为0.4umol/L,上下游引物的比例分别为1:50时条带最亮，也就是PCR产物的量最大，这样有利于我们后期的杂交，选择该浓度作为实验浓度。对于HLA-A，在其座位的exon2和exon3区域分别设计上下游引物，为双下游和双上游引物进行嵌套氏PCR，产物长度在800bp左右，序列如下正链5'-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3',5，-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3',反链5，-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3，，5'-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3，。扩增条件为第一次PCR:96。C3min;96°C25s、65°C45s、72°C30s，26个循环；96°C25s、55°Clmin、72°C2min，4个循环；72°C5min。第二次PCR(NestedPCR):96。C3min;960C30s、56。C30s、72°C30s,30个循环；96。C30s、56。Clmin、72。C2min，4个循环；72。C5min。方法同前选择最佳条件，建立引入荧光标记的PCR体系。在HLA-DRB座位的exon2区域分别设计上下游引物，产物长度在274bp左右，序列如下正链5，隱CCCCACAGCACGTTTCTTG-3'，反链5'-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3'。在HLA-DQB1座位的exon2分别设计上下游引物，下游为混合引物，产物长度在260bp左右，序列如下正链5，-CA/CTGTGCTACTTCACCAAC/TGG-3，，反链5，-CTG/CTAGTTGTGTCTGCAC/TAC-3，。在HLA-DQA1座位的exon2区域分别设计上下游引物，产物长度在240bp左右，序列如下正链5，-A/GC/TGGTGTAAACTTGTACCAGT-3',反链5，-TTGGTAGCAGCA/GGTAGAGTTG-3，。经过摸索条件，将HLA-DRB、HLA-DQB1及HLA-DQA1的标记PCR扩增条件统一为95°C5min，94°C30s、57°C30s、72°Clmin，40个循环。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。方法同前选择最佳条件，建立引入荧光标记的PCR体系。用统一得HLA-DRB、HLA-DQB1及HLA-DQA1扩增条件扩增，不但能达到最好的扩增效果，而且优化了操作过程，更利于将此种检测手段推向临床。2.DNA分型探针的设计及制备不同分辨度探针可满足不同的实际需要。低分辨度探针分辨范围较宽，实际应用很少；高分辨度探针所需时间及成本均高，一般用于个别复杂基因位点的检测。而中分辨度探针即可保持一定的分型精确度，又可避免临床应用中不必要的过细的分型，因此本文依据第十三届国际组织相容性工作会议报告，选择了中国北方汉族人群基因频率较高的等位基因，针对HLA-B不同基因亚型的独特序列，共设计了66条中分辨度探针，HLA-DQA1的相关探针22条探针，HLA-DRB相关探针31条，HLA-DQB1相关探针38条，HLA-A相关探针56条，经NH2-修饰后用于芯片点样。通过NH2-与环氧基的化学结合，将探针固定在环氧片基上。将浓度为100umol/L的寡核苷酸探针与点样缓冲液1:1混合加入到96孔板中，用点样仪点成所需矩阵。从左向右，每五个点代表一条探针，共分五个矩阵，分别是HLA-A，HLA-B，HLA-DQA1，HLA-DQB1,HLA-DRB五组探针。点样后封闭过夜，待其自然干燥后，130。C烘烤30min,95。C水浴lmin，封闭待其自然干燥，-20°0保存备用。3.杂交及相应杂交温度、时间的摸索将10ul杂交buffer，18ulPCR产物与lul鲑精DNA(鲑精DNA用来降低杂交背景)充分混合，将同一样本的HLA-A，HLA-B,HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DRB的五种不同PCR产物用移液器加样到相应点样区域，根据区域大小选择合适大小的盖玻片，盖上盖玻片。放入分子杂交仪中，杂交条件分别为40'C，半小时；40°C,l小时；60°C，l小时；60°C，半小时；40°C，过夜；60°C，过夜，然后根据杂交信号的强度，选择40°C，l小时作为最优化的杂交条件。4.杂交后背景洗脱及洗液浓度、浸泡时间的选择从杂交仪中取出芯片，分为六组第一组5X洗脱液洗脱，浸泡5分钟；取出后放入3X洗脱液中浸泡5分钟；再用ddH20洗2次(每一步浸泡清洗后，都必须迅速离心)。第二组6X洗脱液洗脱，浸泡5分钟；取出后放入5X洗脱液中浸泡5分钟再放入3X洗脱液中浸泡5分钟；再用ddH20洗2次。第三组3X洗脱液浸泡5分钟；用ddH20洗2次。后三组将所有时间均改为3分钟。根据最终扫描结果选择5X洗脱液洗脱，浸泡5分钟；取出芯片后放入3X洗脱液中浸泡5分钟；再用ddH20洗2次(每一步浸泡清洗后，都必须迅速离心)作为最终选择方案。将洗过的芯片置于室温自然晾干，干燥后用ScanarryGx扫描。5.HLA组织配型芯片分型结果判断(图像扫描及数据处理)通过分析软件，将直观的信号强弱转化为信号比值，根据比值及具体位置上标记的探针序列，即可确定样本的基因型。当带荧光标记的PCR产物与芯片上的探针杂交时，探针如果与PCR产物完全互补，则扫描出的杂交信号强，颜色在黄白之间；如果与PCR产物完全不互补，扫描出的信号弱，颜色为蓝或无色；如果与PCR产物部分互补，则扫描出的信号和颜色介于两者之间。通过特定分析软件，将直观的颜色强弱转化为信号的比值，可以方便的得出分型结果。HLA配型芯片设计了阳性对照和阴性对照而且每个探针都有5次重复，使系统的可靠性、稳定性、科学性得到了有效保证。6.临床样本分析-6.1样本来源(1)正常对照组100例(男50例，女50例)，平均年龄56士4.7岁，北方汉族，为某单位退休职工健康查体。(2)试验组①2型糖尿病无肾病组100例(男47例，女53例)，平均年龄58土9.5岁。②早期糖尿病肾病组104例(男50例女54例)，平均年龄57土4.3岁。③临床糖尿病肾病组106例(男51例女55例)，平均年龄59土6.4岁。终末期糖尿病肾病组52例(男27例女25例)，平均年龄60士5.2岁。试验组均来源于天津医科大学代谢病医院20032005年住院患者，均符合1997年ADA诊断标准，均为天津地区的汉族人。各组间年龄、病程、均无明显差异，依据中国糖尿病指南进行DN分期留取24h尿测尿微量白蛋白(UMA)，早期DN期UMA》30mg/d和UMA《300mg/d;临床DN期UMA》300mg/d;肾功能衰竭期。基因组DNA提取采用QIAGEN公司DNA提取试剂盒，严格按照操作说明进行。6.2试验组各组间临床表型特征比较表1试验组各组间临床表型特征比较Non-DN早期DN临床DN终末期DNBMI22.89±3.1924.52±3.74#25.15±3.77*23.19±3.39ABUN5.92±1.956.60±2.728.98±5.73BiS15.84±6.67#《ACr71.94±22.0787,8473.07145.69±159.01*《296.92±239.92*《AUA256.01±90.08298.18±108.22#346.78±123.12*《429.40±160.61*"TC5.12±1.135.53±1.64#5.90土1.30林5.76±1.31#TG1.48±1.202.09土2.04"2.23±1.93**1.51±0.6严LDL3.26±0.921.38±0.142.08±0.21#2.68±0.38#VLDL0.41±0,180.54±0.26*0.59±0.29s0.46±0.17《AHDL1.44±0,321.40±0.341.44±0,291.47±0.36FIB3.37±1.073.89±1.37*4.34土1.51"※4.33±1.42#GHb9.48±2.639.18±2.188.74±2.01#8.24±2.02#iSUMA14.19±5.37106.61±67.97#408.31±33.55fl《402.00±14.14*《FPG10.06±3.4610.54±4.029.94±4.209.53±4.62与Non-DN相比P0.05;※与早期DN相比PO.05;与临床DN相比P〈0.056.3临床样本分型结果对462例临床样本进行了检测，芯片检测结果用国际知名的onelambda公司的MicroSSPTMClassI&IIGenericTray，MicroSSPTMAlleleSpecficDQB1，MicroSSPTMAlleleSpecficDRB进行平行对照试验。基因分型结果与用国际公认的onelambda试剂盒所得出的基因分型结果基本一致。对不一致的样本进行了测序对照，测序结果与芯片分析结果完全一致。3.1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特异性18个，等位基因196个。462份临床样本进行芯片检测，随即选取样本进行经测序(由上海博亚公司完成)验证芯片结果正确。样本检测结果如表2。表2.2型糖尿病及各亚组与正常对照组HLA-A等位基因频率比较HLA-A等位基因AlA2A3AllA23A24A25A26A28糖尿病组100111615186221412(0.06)(0.08)(0.08)(0.09)(0.03)(0.11)(0.07)(0.06)(0.01)肾病in期组10412181516101615114(0.06)(0.09)(0.07)(0.08)(0.04)(0.08)(0.07)(0.06)(0.01)肾病rv期组10612221219101818144(0.05)(0.11)(0.06)(0.1)(0.02)(0.09)(0.09)(0.07)(0.02)肾病v期组52917961(0.05)(0.09)(0.07)(0.17)(0.05)(0.09)(0.07)(0.06)(0.01)正常对照组100861878516102(0.04)(0.03)(0.09)(0.04)(0.04)(0.03)(0.08)(0.05)(0.01)1.0539.7561.39812.7382.47211.3l.賜0.7921.288p0.9020.0450.8450.0130.650.0230.8930.940.863HLA-A等位基因A30A31A32A33A34A36A66A69A74糖尿病组腦2126624412162(0.01)(0.06)(0.03)(0.03)(0.12)(0.02)(0.06)(0.08)(0.01)肾病III期组104415889616214(0.02)(0.08)(0.04)(0.04)(0.05)(0.03)(0.08)(0.11)(0.02)肾病IV期组1064128610614184(0.01)(0.06)(0.03)(0.03)(0.05)(0.02)(0.07)(0.09)(0.02)肾病v期组520544101(0.)(0.05)(0.05)(0.02)(0.04)(0.03)(0.07)(0.1)(001)正常对照组100148222681822(0.01)(0.07)(0.04)(0.11)(0.13)(0.04(0.09)(0.11)(0.01)50.581T^j10.3162.5610.9491.317P0.8240.9650.5360.80.0350.6340.9170.8580.816天津地区2型糖尿病及各亚组肾病患者的A2(P<0.05,RR=1.68)、All(P<0.05，RR=1.78)和A24(P<0.05,RR=1.83)等位基因频率明显高于正常对照组，2型糖尿病及各亚组肾病患者A33等位基因频率明显低于对照组(P<0.05,RR=0.37)。天津地区2型糖尿病并发肾病V期组患者的All等位基因频率明显高于无肾病患者(P<0.05,RR=2.79),各亚组肾病组A34等位基因频率明显低于2型糖尿病无肾病组及正常对照组(P<0.05，RR=0.15)。3.2HLA配型芯片可分辨HLA-B抗原特异性41个，等位基因402个。462份临床样本进行芯片检测，随即选取样本经测序(由上海博亚公司完成)验证芯片结果正确。样本检测结果如表3。表32型糖尿病及各亚组与正常对照组HLA-B等位基因频率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>组别HLA-B等位基因天津地区2型糖尿病及各亚组肾病患者的B40(P<0.01,RR=3.67)、B41(P<0.01,RR=3)和B54(P<0.01，RR=2.6)等位基因频率明显高于正常对照组，2型糖尿病及各亚组肾病患者B50等位基因频率明显低于对照组(PO.Ol，RR=0.33)，天津地区2型糖尿病并肾病患者与无肾病患者HLA-B无统计学差异(P>0.05)。3.3HLA配型芯片可分辨HLA-DRB抗原特异性18个，等位基因432个。462份临床样本进行芯片检测，随即选取样本进行经测序(由上海博亚公司完成)验证芯片结果正确。样本检测结果如表4。表42型糖尿病及各亚组与正常对照组HLA-DRB等位基因频率比较组别N-HLA-DRB等位基因DR1DR3DR4DR7DR8DR9DR10DR11DR12糖尿病组10042218108613149(0.02)(0.11)(0.09)(0.05)(0.04)(0.03)(0.07)(0.07)(0.04)肾病III期组1046181812106121411(0.03)(0.09)(0.09)(O夠(0.05)(0.03)(0.05)(0.06)(0.05)肾病IV期组1065182011912131411(0.02)(0.09)(0.1)(0.05)(0.04)(0.06)(0.06)(0.07)(0.06)肾病v期组5231211489(0.01)(0.06)(0.06)(0.02)(0.02)(0.04)(0.03)(0.02)(0.05)正常对照组10018612103141211(0.09)(0.03)(0.03)(0.06)(0.05)(0.02)(0.07)(0.06)(0.06)x219.68511.19211.0730.7920.96510.8061.0631.2952.806p0.0010.0240.0260.9390.9150.0290.90.8620.591组别N.HLA-DRB等位基因DR13DR14DR15DR16DR17DR18DR51DR52DR53糖尿病组10013"7810121314910(0.07)(0.03)(0.04)(0.05)(0.06)(0.07)(0.07)(0.05)(0.05)肾病III期组104肾病IV期组106肾病V期组52正常对照组100糖尿病组肾病in期组肾病iv期组肾病v期组正常对照组x2pB75B7624(0.01)(0.02)16(0.004)(0.03)24(0.01)(0.02)02(0)(0.02)26(0.01)(0.03)1.3680.9320.850.926(0.03)8(0.04)(0.04)8(0.04)0.4250.983(0.02)(0.04)3(0.03)7(0.04)1.9210.756(0.03)6(0.03)3(0.03)7(0.04)0.4950.9746(0.03)(0.04)(0.03)8(0.04)0.820.93610010410652100B62(0,01)(0.01)(0.01)1(o.oi)(o.oi)01.00B631(0.01)1(0.004)0(0)0(0)1(0.01)1.5050.826B640(0)1(o細)1(B65(0.01)3(0.02)B679(0.05)8(0.04)88(0.04)9(0.05)3(0.03)9(0.05)0.6510.9571u91BooooOI!C;00oooooo3oo/IN003o一ooS64刀6oS18力49"oo9S1oo0302n^40:9KB-SSscsa435o3n-9o<u1o2oddd774945-SoS1^620704oooowg;天津地区2型糖尿病及肾病各亚组患者的DR3(P<0.05,RR=3)、DR4(P<0.05,RR=2.43)和DR9(P<0.05,RR=3)等位基因频率明显高于正常对照组，DR1等位基因频率明显低于对照组(P<0.05，RR=0.53)。天津地区2型糖尿病并发肾病IV、V期患者的DR9等位基因频率明显高于肾病m期组和无肾病组，(P<0.05,RR=3)。3.4HLA配型芯片可分辨HLA-DQBl抗原特异性6个，等位基因51个。462份临床样本进行芯片检测，随即选取样本经测序(由上海博亚公司完成)验证芯片结果正确。样本检测结果如表5。表5天津地区2型糖尿病及各亚组与正常对照组HLA-DQB1等位基因频率比较:'HI.A-DQB1等位基肉~~—~—<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>天津地区2型糖尿病并发肾病患者的HLA-DQBl*05等位基因频率明显低于正常对照组和无肾病组患者(P<0.05,RR=0.6)。8.5HLA配型芯片可分辨HLA-DQA1抗原特异性6个，等位基因28个。462份临床样本进行芯片检测，随即选取样本经测序(由上海博亚公司完成)验证芯片结果正确。样本检测结果如表6。表6天津地区2型糖尿病患者与正常对照HLA-DQA1等位基因频率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>p<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种应用HLA遗传标记预测糖尿病患者已患有、将有可能发展成、或者疑似患有肾病的方法，包括如下步骤检测来自糖尿病患者的样品中是否含有下列HLA遗传标记中的至少一种HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1＊0302，这些遗传标记的存在表明该糖尿病患者已患有、将有可能发展成、或者疑似患有肾病。2.根据权利要求1还包括易患糖尿病肾病HLA遗传标记HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1女0302。3.根据权利要求1所述的方法，还包括从患者中取样的方法。4.根据权利要求2所述的方法，其中所取样品为血样。5.根据权利要求l，HLA遗传标记应用基因芯片检测。6.根据权利要求l、2、3、4，其中所述患者为己患有、将有可能发展成、或者疑似患有2型糖尿病的患者。全文摘要本发明公开了检测糖尿病患者已患有、将有可能发展成或疑似患有肾病的方法，以及糖尿病肾病的易感基因。该方法包括应用基因芯片检测来自糖尿病患者的样品中HLA遗传标记。并且证明HLA-A11、HLA-DR9、HLA-DQA1*0302，这些遗传标记的存在表明该糖尿病患者已患有、将有可能发展成、或者疑似患有肾病。文档编号G01N33/68GK101294215SQ200710057228公开日2008年10月29日申请日期2007年4月26日优先权日2007年4月26日发明者蓓孙,瑞张,刚郭,陈莉明申请人:天津医科大学