专利名称：：检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种免疫透射比浊的检测方法，尤其是涉及一种检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：脂联素(adiponectin)亦称Acrp30、GBP28或AdipoQ，是由脂肪细胞分泌一种激素蛋白，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为3.017.Omg/L，约占血浆蛋白的0.01%([1]AritaY,KiharaS,OuchiN,etal.Paradoxicaldecreaseofanadipose-specificprotein,adiponectin,inobesity[J].BiochemBiophysResCommun,1999,257(1)=79-83)0随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加([2]ZhangMH,SpiesC,AliS,etal.Adiponectinandinducibleischemiainpatientswithstablecoronaryheartdisease-AaXafromtheHeartandSoulstudy[J].Atherosclerosis,2009,205(1):233_238;[3]KawanoJ,AroraR.Theroleofadiponectininobesity,diabetes,andcardiovasculardisease[J].JCardiometabSyndr.2009,4(1):44-49)。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。目前，脂联素的临床诊断技术主要包括放射免疫法(RIA)([4]SchulzeMB,ShaiI,RimmEB,etal.Adiponectinandfuturecoronaryheartdiseaseeventsamongmenwithtype2diabetes[J]·Diabetes，2005，54(2):534_539)、酶联免疫试验(ELISA)([5]UrbonavicieneG,FrystykJ,FlyvbjergA,etal.Associationofserumadiponectinwithriskforcardiovasculareventsinpatientswithperipheralarterialdisease[J].Atherosclerosis,2010,210(2)619-624)等方法，它们的优点是灵敏度较高，缺点是操作繁琐，耗时长，易受人为操作和外界因素干扰，自动化程度低，而且放射性标记物会对操作者产生危害，对环境造成污染。这些缺点限制了现有的脂联素检测方法的推广应用，使其无法广泛地应用于临床诊断与科研工作。颗粒±曾强免疫透射比池法(particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的吸光度。而且，这种改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不高的不足，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服ELISA和RIA方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。目前，胶乳增强免疫透射比浊法已广泛用于胱抑素C([6]Al-TurkmaniMR，LawT，KelloggMD.Performanceevaluationofaparticle-enhancedturbidimetriccystatinCassayontheHitachi917analyzer[J].ClinChimActa.2008,398(1-2):75_77)、脂蛋白(a)、C反应蛋白、超敏C反应蛋白、抗链球菌溶血素O的检测，取得良好的社会效益，但国内外至今尚未见有此类脂联素检测试剂盒问世
发明内容本发明的目的在于提供一种检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法。本发明所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，所述应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装应用液，所述应用液的组成及其按质量百分比的含量为表面活性剂0.1%0.5%、防腐剂0.05%1%、高分子加速剂2%8%、氯化钠0.10%和缓冲剂50200mmol/L；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成及其按质量百分比的含量为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5%5%、表面活性剂0.0.5%、稳定剂0.0.5%和缓冲剂10100mmol/L。所述应用液中的表面活性剂可选自Tween20或Triton-XlOO等。所述应用液中的防腐剂可选自Proclin300或叠氮钠等。所述应用液中的高分子加速剂可选自聚乙二醇6000(PEG6000)或聚乙二醇8000(PEG8000)等。所述应用液中的缓冲剂可选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或甘氨酸等。所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的表面活性剂可选自Tween20或Triton-XlOO等。所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的稳定剂可选自牛血清白蛋白(BSA)等。所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或甘氨酸等。所述应用液缓冲剂与胶乳悬液缓冲剂最好保持一致。所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法包括以下步骤1)制备胶乳抗体将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，得两种胶乳抗体悬液；在步骤1)中，所述将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，可采用以下具体方法在碳酸盐缓冲液中将醛基微球分别与两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体混勻，37°C旋转反应后，加入碳酸盐缓冲液配制的NaBH4溶液，4°C旋转反应后，再加入碳酸盐缓冲液配制的甘氨酸溶液，再4°C旋转反应后，用清洗贮存液进行清洗，所得胶乳抗体沉淀重悬于清洗贮存液中，得胶乳抗体悬液，置于4°C环境放置；所述两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体可采用clone:Adn37抗体和clone:Adn26抗体；所述醛基微球可采用上海照康生物科技有限公司提供的醛基微球，所述醛基微球的粒径可为100300nm，最好为150匪，醛基微球的质量百分比为0.5%5%；所述碳酸盐缓冲液pH可为8.59.6，最好为9.6；质量百分比为20IOOmmol/L,最好为50mmol/L。所述37°C旋转反应的时间可为416h，最好为16h所述NaBH4溶液的质量百分比为0.050.5g/L，最好为0.lg/L；所述4°C旋转反应的时间可为24h，最好为4h；所述甘氨酸溶液的质量百分比可为10lOOmmol/L，最好为50mmol/L；所述再4°C旋转反应的时间可为224h，最好为16h；所述清洗贮存液pH可为7.48.8，最好为8.0，包括缓冲剂、表面活性剂和稳定齐U。缓冲剂可以是磷酸盐，也可以是三羟甲基氨基甲烷(TriS)或甘氨酸，缓冲剂在清洗贮存液中所占的质量百分比为10lOOmmol/L，最好为25mmol/L，表面活性剂和稳定剂的质量百分比分别为0.0.5%和0.05%0.5%，最好为0.2%和0.1%。2)制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液分别将步骤1)制备的两种胶乳抗体悬液混合，得包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液；在步骤2)中，所述两种胶乳抗体悬液混合最好是两种胶乳抗体悬液等体积混合。3)制备应用液将表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂、氯化钠和缓冲剂一并完全溶解于水中，得应用液；在步骤3)中，所述缓冲剂种类与步骤2)中清洗贮存液中缓冲剂保持一致；所述应用液PH值可为7.48.0，最好为8.0；所述表面活性剂所占的质量百分比可为0.0.5%,最好为0.2%，防腐剂所占的质量百分比可为0.05%1%，最好为0.1%，高分子加速剂所占的质量百分比可为2%8%，最好为4%;氯化钠所占的质量百分比可为0.10%，最好为1.2%，缓冲剂的质量百分比可为50200mmol/L，最好为100mmol/L。4)配制脂联素系列标准品选用脂联素标准品，使用小牛血清进行系列稀释S6:40μg/ml，S5:20μg/ml，S4:10μg/ml,S3:5μg/ml，S2:1μg/mlSl:0.2μg/mlSO小牛血清，分装即可。在步骤4)中，所述脂联素标准品可选用商品化高纯度脂联素标准品；所述分装可采用0.5ml/瓶分装。以下给出采用所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒在生化分析仪上进行脂联素检测的具体条件在生化分析仪上设定参数反应温度37°C；分析方法2点终点法；主波长570nm，副波长800nm(可不用)；样品量/应用液(Rl)/包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液(R2)5μ1/200μ1/50μ1；反应方向上升。本发明采用抗人脂联素单克隆抗体包被醛基微球，通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不高的不足，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服ELISA和RIA方法操作复杂、重复性不好等的缺点，实现人血脂联素在生化仪上大批量定量快速检测人脂联素水平，归纳起来有以下几个方面的突出优点(1)操作简单；(2)灵敏度较高，可达0.2yg/ml;(3)不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性好，能较真实地反映被测物质的含量；(4)能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。图1为本发明所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒实施例的结构组成示意图。具体实施例方式参见图1，本发明所述检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒实施例包括盒体1、应用液瓶2和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶3，所述应用液瓶2和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶3放置于盒体1内，所述应用液瓶中装应用液，所述应用液的组成及其按质量百分比的含量为表面活性剂0.0.5%、防腐剂0.05%1%、高分子加速剂20Z08%、氯化钠0.10%和缓冲剂50200mmol/L；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成及其按质量百分比的含量为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5%5%、表面活性剂0.0.5%、稳定剂0.0.5%和缓冲剂101OOmmol/L。实施例1制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒以4mg醛基微球为例，本实施例的主要步骤包括1.制备胶乳抗体选用高纯度、高亲和力的两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体(clone:Adn37,cloneAdn26)。使用20mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将醛基微球分别与两种抗体以101的质量比混勻，37°C，旋转反应16h，此时总反应体积为400μ1；反应结束后，加入上述碳酸盐缓冲液配制的4mg/mlNaBH4溶液20μ1，4°C，反应4h；再加入封闭试剂lmol/L甘氨酸溶液20μ1，4°C，反应16h;25mmol/LTBS缓冲液(含Tween200.2%,BSA0.1%，ρΗ7·4)清洗3次；沉淀重悬于4ml25mmol/LTBS缓冲液(含Tween200.2%,BSA0.1%,ρΗ7·4)，胶乳悬液浓度为lmg/ml。2.两种胶乳抗体混合，制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液分别将制备的两种胶乳抗体悬液等体积混合，此为R2胶乳悬液。3.制备应用液pH8.0的50mmol/Ltris缓冲液，内含12%的NaCl,4%^PEG6000，0.1%Proclin300。4.脂联素系列标准品的配制选用商品化高纯度脂联素标准品，使用小牛血清进行系列稀释S6:40μg/ml，S5:20μg/ml,S4:10μg/ml，S3:5μg/ml，S2:1μg/ml，Sl:0.2μg/mlSO小牛血清，0.5ml/瓶分装即可。实施例2制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒以4mg醛基微球为例，本实施例的主要步骤包括1.制备胶乳抗体将醛基微球分别与两种抗体以201的质量比混勻，余同实施例1。2.两种胶乳抗体混合，制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液同实施例1。3.制备应用液ρΗ7·4的50mmol/Ltris缓冲液，内含12%的NaCl,6%^PEG6000，0.1%Proclin300。4.脂联素系列标准品的配制同实施例1。实施例3制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒1.制备胶乳抗体将步骤1制备胶乳抗体中加入4mg/mlNaBH4溶液的量改为10μ1，4°C，反应时间改为2h，余同实施例1。2.两种胶乳抗体混合，制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液同实施例1。3.制备应用液pH8.0的200mmol/Ltris缓冲液，内含5.0%的NaCl,6%的PEG8000，0.1%Proclin300。4.脂联素系列标准品的配制同实施例1。实施例4制备检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒1.制备胶乳抗体将实施例1步骤1)制备胶乳抗体中加入封闭试剂lmol/L甘氨酸溶液的量改为10μ1，4°C，反应时间改为4h，25mmol/LTBS缓冲液中Tween20改为0.5%，BSA改为0.5%，pH改为8.0，余同实施例1。2.两种胶乳抗体混合，制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液同实施例1。3.制备应用液同实施例1。4.脂联素系列标准品的配制同实施例1。实施例5生化分析仪上进行脂联素的检测在7060型生化分析仪上设定参数反应温度37°C；分析方法2点终点法；主波长570nm，副波长:800nm；样品量/R1/R25μ1/250μ1/50μ1；反应方向上升。读点分别在20点及34点。选择多点定标后，仪器自动完成定标，定标OK后，进行常规血清标本的脂联素检测，结果经仪器自动换算直接以mg/L为单位报告数值。权利要求检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，其特征在于包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，所述应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装应用液，所述应用液的组成及其按质量百分比的含量为表面活性剂0.1％～0.5％、防腐剂0.05％～1％、高分子加速剂2％～8％、氯化钠0.1％～10％和缓冲剂50～200mmol/L；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成及其按质量百分比的含量为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳0.5％～5％、表面活性剂0.1％～0.5％、稳定剂0.1％～0.5％和缓冲剂10～100mmol/L。2.如权利要求1所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，其特征在于所述应用液中的表面活性剂选自Tween20或Triton-XlOO；所述应用液中的防腐剂选自Proclin300或叠氮钠；所述应用液中的高分子加速剂选自聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；所述应用液中的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐或甘氨酸。3.如权利要求1所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒，其特征在于所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的表面活性剂选自Tween20或Triton-XlOO；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的稳定剂选自牛血清白蛋白；所述包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液中的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐或甘氨酸。4.如权利要求1所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)制备胶乳抗体悬液将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，得两种胶乳抗体悬液；2)制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液分别将步骤1)制备的两种胶乳抗体悬液混合，得包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液；3)制备应用液将表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂、氯化钠和缓冲剂一并完全溶解于水中，得应用液；4)配制脂联素系列标准品选用脂联素标准品，使用小牛血清进行系列稀释:S6:40yg/ml,S5:20yg/ml,S410μg/ml，S3:5μg/ml,S2:1μg/mlSl:0·2μg/mlSO小牛血清，分装即可。5.如权利要求4所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，采用以下具体方法在碳酸盐缓冲液中将醛基微球分别与两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体混勻，37°C旋转反应后，加入碳酸盐缓冲液配制的NaBH4溶液，4°C旋转反应后，再加入碳酸盐缓冲液配制的甘氨酸溶液，再4°C旋转反应后，用清洗贮存液进行清洗，所得胶乳抗体沉淀重悬于清洗贮存液中，得胶乳抗体悬液，置于4°C环境放置。6.如权利要4或5所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体采用clone:Adn37抗体和clone:Adn26抗体；所述醛基微球的粒径为100300nm，最好为150nm，醛基微球的质量百分比为0.5%5%。7.如权利要求4所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述碳酸盐缓冲液pH为8.59.6，最好为9.6；质量百分比为20100mmol/L，最好为50mmol/L；所述37°C旋转反应的时间为416h，最好为16h；所述NaBH4溶液的质量百分比为0.050.5g/L，最好为0.lg/L；所述4°C旋转反应的时间为24h，最好为4h；所述甘氨酸溶液的质量百分比为10lOOmmol/L，最好为50mmol/L；所述再4°C旋转反应的时间为224h，最好为16h。8.如权利要求4所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述清洗贮存液PH为7.48.8，最好为8.0，包括缓冲剂、表面活性剂和稳定剂；缓冲剂为磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷或甘氨酸，缓冲剂在清洗贮存液中所占的质量百分比为10lOOmmol/L，最好为25mmol/L，表面活性剂和稳定剂的质量百分比分别为0.0.5%和0.05%0.5%，最好为0.2%和0.1%。9.如权利要求4所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述两种胶乳抗体悬液混合是两种胶乳抗体悬液等体积混合。10.如权利要求4所述的检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述缓冲剂种类与步骤2)中清洗贮存液中缓冲剂保持一致；所述应用液PH值为7.48.0，最好为8.0；所述表面活性剂所占的质量百分比为0.0.5%，最好为0.2%，防腐剂所占的质量百分比为0.05%1%，最好为0.1%，高分子加速剂所占的质量百分比为2%8%，最好为4%；氯化钠所占的质量百分比为0.10%，最好为1.2%，缓冲剂的质量百分比为50200mmol/L，最好为100mmol/L。全文摘要检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法，涉及一种免疫透射比浊的检测方法。检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒包括盒体、应用液瓶和包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶，应用液瓶中装应用液，应用液的组成为表面活性剂、防腐剂、高分子加速剂、氯化钠和缓冲剂；包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液瓶中装包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液的组成为包被抗人脂联素单克隆抗体胶乳、表面活性剂、稳定剂和缓冲剂。先制备胶乳抗体，再制备包被抗人脂联素单克隆抗体的胶乳悬液，然后制备应用液，最后配制脂联素系列标准品。文档编号G01N33/531GK101968492SQ201010526950公开日2011年2月9日申请日期2010年10月29日优先权日2010年10月29日发明者张忠英,游攀,金宏伟,陈美珺申请人:厦门大学附属中山医院