专利名称：传染性病原体检测用探针和探针组以及载体和基因检查方法
技术领域：
本发明是关于传染性病病原体检测和/或鉴定的发明。特别是有关在检测以及鉴定传染性病原体中有用的来源于传染性病病原体的探针、探针组以及载体、基因检查方法的发明。
还有，是有关适于传染性病病原体检测和/或鉴定的传染性病病原体的PCR扩增处理的发明。
背景技术：
近年来，运用DNA芯片(或也称为DNA微阵列，如下类同)的基因表达解析率先在创造新药的各种领域中得到展开。DNA芯片是让各自不同的检体DNA与配置了各种基因组(探针)DNA微阵列反应，比较各检测体中存在的各种基因量，对每一步骤中大量存在的基因(表达量高的)，或相反地，未活化的(表达量低的)基因进行分类，并分析与其功能相关的技术。
检查传染性病病原体有这样一例，江崎氏等在特开2001-299396号公报中提出了用固定了染色体DNA的DNA芯片作为DNA探针的微生物鉴定法。根据这一方法，相互间GC含量不同的多个已知来源于微生物的染色体DNA与检体中来源于未知微生物的染色体DNA进行反应，通过检测产生的杂交复合体，可以检测出检体中的未知微生物。
另外，作为传染性病病原体检查使用的DNA芯片中的探针，大野氏等分别在特开平6-133798号公报中提出了利用限制性内切酶片段的真菌检测用探针、在特开平10-304896号公报中提出了检测绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)用的探针、在特开平10-304897号公报中提出了利用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(大肠杆菌)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)以及阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)的限制性内切酶片段的检测用探针。
已知上述DNA微阵列，例如，是根据被称为斯坦福法(スタンフオ一ド)的压印法(スタンピンク法)的微阵列，例如，宝酒造公司将与癌患者相关的来自人类己知基因的cDNA片段用点或印的方法涂布的DNA芯片、载玻片上贴有来自人类己知基因约1000种类的cDNA片段的芯片己经在销售。
另一方面，Affymetrix芯片是以上述己知基因cDNA为基础设计的寡核苷酸探针组，通过在基板上的合成来配置探针的一种芯片，所以设计为在一张芯片上高密度地配置有寡探针，一次可以分析超过一万个基因表达水平。
但是，上述现有技术显示的DNA芯片是利用染色体DNA或限制性内切酶片段等DNA探针的芯片，不管哪一方都是从微生物直接提取的DNA作为材料。为此，一次性地大量制备是困难的，具有不适合临床诊断用的问题。这里为了临床诊断使用，大量生产价廉且均质的DNA芯片是必要的。为了这一目的，大量制备作为探针溶液的均质的DNA成为不可缺少的一环，对于DNA探针来说，这样的大量制备也是不可能的。另外，就是有了DNA探针，利用PCR扩增反应将该DNA渐渐地增加是可能的，但对PCR反应来说，一次性大量制备是有困难的，所以临床诊断上的利用是困难的。
还有，由于DNA探针碱基长度过长，类似菌种间的菌种鉴定就有困难，例如，存在不适合传染性病检测用这一问题。在治疗传染性病过程中，确定其菌种与选择和使用与其相对应的抗生素是必要的，为此，在传染性病检测用探针中，虽然不要求区别到同种类内的详细区别(即，同种内的一次性可以检测出)，但要求具有能够检测区别类似的其它种类细菌的功能。例如，特开平10-304897号公报中所示的使用大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌的限制性内切酶片段的DNA芯片，由于探针碱基长度过长，3种菌种相互间交发生叉反应，不能够区别每一个类似的菌种，所以在传染性病检测上的利用就困难了。
作为以上所述的微阵列用途，已经有几个是注目在检查传染性病原体上，以检查传染性病原体为目的的探针组的提案。
使用微阵列进行细菌检查的要点是，即使在感染菌数目少的情况下也能够检测出。为达到这一点，通过使用引物的PCR反应等有效地扩增感染菌DNA碱基序列上的特定部位。例如，16s rRNA基因序列大约在1700碱基对的信息中含有菌种特有的碱基序列，所以认为利用这样的序列，进行一定程度的分类是可能的。因此，在细菌的检测/鉴定中，最好使用细菌的DNA碱基序列中的16s rRNA部分。因此，希望扩增16s rRNA部分。
但是，即使部分地弄清了各种菌的基因序列，并不是就能弄清16srRNA的全长，PCR扩增反应用引物的设计也并不容易。

发明内容
本发明考虑到上述所述的问题，是以提供一种可以一次性大量制备且以可以鉴定类似菌种间的菌种的传染性病检测用探针为目的的。
更具体地说，本发明是以提供适合于利用多种传染性病原体菌种进行分类的检测传染性病用探针组为目的的发明。
另外，为使这些类似菌种间的差异可以通过DNA芯片精度良好地进行评价，是以提供一个考虑了检测传染性病用探针和检体的杂交体稳定性的探针组为目的的。
为进行这些传染性病检测用探针与检体的反应，是以提供一个固化这些传染性病检测用探针的载体为目的的。
与检测体溶液反应的过程中，为了将传染性病检测用探针稳定地固化在载体上，得到再现性高的检测结果，是以提供一个以化学方法固化的载体为目的的。
在以传染性病原体的检测/鉴定为目的之中，是以提供一个为扩增检测体中病原体的16s rRNA的PCR反应用引物为目的的。
本发明的其它目的是，提供一个可以在多个菌种中共通利用的，既使是该菌种不清楚的情况下也能有效地扩增病原体16s rRNA的引物组。
更进一步地，本发明的其它目的是，提供一个在同一PCR条件下可能扩增多个菌种病原体的16s rRNA的引物组。
另外，对于人类血液检体来说，同时使用该引物组中的全部，通过进行PCR反应，提供了不扩增人类基因组来源的基因，可以扩增上述任一种菌种为特征的引物组。具体地说，提出了一种具有与人类基因组基因有3个以上碱基不同的序列的引物组。
本发明的其它特征和优点将被描述在以下的说明中。
具体实施例方式
在以下的实施方案中，给出了用于鉴定传染性病原体的寡核苷酸探针，更具体地说，是用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感杆菌(Haemophilusinfluenzae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、以及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的任一个，或多个菌种的探针。即，公开了准确检测上述10种传染性病原体的基因中16s rRNA基因序列的核酸探针或核酸探针组。
根据本实施方案，用于能够与含有上述传染性病原体基因的核酸序列的检查溶液反应的上述寡核苷酸探针由属于后述表1中所表示的第1组(后附序列表的序列号(*请将『序列号』翻译成『SEQ ID No.』)1～14)、表2中所显示第2组(序列号15～24)、表3中所显示第3组(序列号25～36)、表4中所显示第4组(序列号37～47)、表5中所显示第5组(序列号48～57)、表6中所显示第6组(序列号58～68)、表7中所显示第7组(序列号69～77)、表8中所显示第8组(序列号78～85)、表9中所显示第9组(序列号86～97)、表10中所显示第10组(序列号98～106)中的一个组的一个碱基序列组成。这里，具有从第1组中选择出碱基序列的寡核苷酸探针检测金黄色葡萄球菌，具有从第2组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测表皮葡萄球菌、具有从第3组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测大肠杆菌、具有从第4组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测肺炎杆菌、具有从第5组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测绿脓杆菌、具有从第6组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测粘质沙雷氏菌、具有从第7组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测肺炎链球菌、具有从第8组中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测流感杆菌、具有从第9群中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测阴沟肠杆菌、具有从第10群中选择出的碱基序列的寡核苷酸探针检测粪肠球菌。
另外，与这些探针序列互补的序列(与上述第1组互补的序列是后附序列表的序列号113～126、与第2组相互补的序列是所附序列表的序列号127～136、与第3组互补的序列是所附序列表的序列号137～148、与第4组互补的序列是所附序列表的序列号149～159、与第5组互补的序列是所附序列表的序列号160～169、与第6组互补的序列是所附序列表的序列号170～180、与第7组互补的序列是所附序列表的序列号181～189、与第8组互补的序列是所附序列表的序列号190～197、与第9组互补的序列是所附序列表的序列号198～209、与第10组互补的序列是所附序列表的序列号210～218)作为具有同样功能的探针序列也是有效的。
各种菌的探针的设计由编码16s rRNA的基因组部分进行，预期可以达到对于相应的各个菌的特异性非常高，而且各个探针碱基序列没有偏差，充分的杂交灵敏度。
这些寡核苷酸探针被设计成在结合在载体上的2种以上探针和检体的杂交反应中可以形成稳定的杂交体，给出良好结果。
还有，与本发明有关固化传染性病检测用探针的载体，其特征是使用显微打印(BJプリンタ)吐出寡核苷酸，通过化学方式结合的。根据这一点，与现有方法相比，探针不容易脱落，而且也能得到灵敏度提高的附带效果。即，通过现有一般使用的被称为斯坦福法(スタンフオ一ド法)的压印法(スタンピング法)进行DNA芯片生产的情况下(如，宝酒造是用与癌患者有关的来源于人类己知基因的cDNA片段通过点或印的涂布进行DNA芯片生产)，存在着涂布的DNA容易脱落的缺点。另外，如现有技术，DNA芯片上通过合成来排列探针情况下(如Affymetrix的DNA芯片等)，由于各个探针序列的每个合成收率是不一样的，具有不能正确评价的缺点。本发明涉及的载体是考虑了这样相关问题而制作成的，与现有的相比，具有稳定地被固定、不易脱落、能够高灵敏度和高精度检测的特征。以下，关于本发明适合的实施方案进行详细说明。
作为本实施方案的DNA芯片检查对象的检体可以将来源于人、家畜等动物的血液、脊髓、痰、胃液、阴道分泌物、口腔内粘液等体液、尿以及粪便的排泄物等所有被认为有细菌存在的物质作为对象。另外，如成为食物中毒、污染的食物、饮料水以及如温泉一样的自然环境中的水、空气清洁器或净水器的过滤膜等可能由细菌引起污染的全部媒介物。还有，在进出口时被检疫等的动植物也是检体对象。
作为本实施方案的DNA芯片对象的检测体也可以是提取出的核酸本身，也包含使用为16s rRNA检测用而设计的PCR反应用引物制备的扩增检体、或以PCR扩增物为原料进一步进行PCR反应等而制备的检体、通过PCR以外的扩增方法制备的检体、为可视化由各种标记物标记的检体等任一种制备法制备的检体。
用于本实施方案DNA芯片的载体是包含所有的玻璃基板、塑料基板、硅晶片等平面基板、具有凹凸的三维结构体、珠子状的球形物质、棒状、带状、线状的物质(材料)。还有，也包含可在此基板表面进行探针DNA固化处理的材料。特别是，最好是在表面导入了可能发生化学反应官能团的材料，为杂交反应过程中探针稳定地结合、具有再现性的方案。
用于本发明的固化方法，如使用马来酰亚胺基和硫醇(-SH)基的组合的例子。即，通过预先使硫基结合在核酸探针末端，而固相表面含有马来酰亚胺基那样处理，供给到固相表面的核酸探针的硫基与固相表面的马来酰亚胺基进行反应之后，对核酸探针进行固化。
作为马来酰亚胺基的导入方法，首先使氨基硅烷偶联剂(アミノシランカツプリング)与玻璃基板反应，然后，通过这一氨基与EMCS试剂(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimideDojin公司制造)反应，将马来酰亚胺基导入。SH基导入DNA在DNA自动合成仪上合成DNA的时候，可以通过使用5’-Thiol-ModifierC6(Glen Research公司制造)来进行。
在固化中利用官能团的组合是指除上述硫基和马来酰亚胺基的组合以外，还有例如环氧基(固相上)和氨基(核酸探针的末端)的组合等。由各种氨基硅烷偶联剂进行的表面处理也是有效的，可以使用导入与由该氨基硅烷偶联剂导入的官能团发生可反应的官能团的寡核苷酸。还有，也可以利用包被含有官能团树脂的方法。
以下，通过使用可分别检测上述10种传染性病原体的传染性病原体检测用探针的实施例，更详细地进行说明。
实施例1 使用1步PCR法检测微生物[1.探针DNA的准备]作为上述10种病原体检测用的探针，在表1～10中给出了所设计的核酸序列。具体来说，是从编码各种菌16s rRNA的基因组选择了以下所示探针碱基序列。设计的这些探针碱基序列组对于该菌来说特异性非常高，而且各个探针碱基序列没有偏差，期待可以获得充分的杂交灵敏度。另外，不必限定于与表1～10中所示各探针碱基序列完全一致。包含各探针碱基序列的具有20到30左右碱基长度的探针碱基序列也包含在各表中所示的探针碱基序列中。也可以使用上述各表中所显示的碱基序列的互补序列(互补链)。
另外，在以下各个表中，探针号Probe No.是方便分配的符号，序列号与后附的序列表中序列号一致。上述所示，与序列号1～106相对应的互补链序列显示在序列号113～218中。
表1 金黄色葡萄球菌检测用探针

表2 表皮葡萄球菌检测用探针

表3 大肠杆菌检测用探针

表4 肺炎杆菌检测用探针

表5 绿脓杆菌检测用探针

表6 粘质沙雷氏菌检测用探针

表7 肺炎链球菌检测用探针

表8 流感杆菌检测用探针

表9 阴沟肠杆菌检测用探针

表10 粪肠球菌检测用探针

上述各个表中所显示的探针作为DNA微阵列固化的官能团，合成后，根据常规的方法在核酸的5’末端导入了硫基。官能团导入后，精制、冷冻干燥。冷冻干燥的探针保存在-30℃的冷冻库中。
作为检测上述病原体用16s rRNA基因(靶基因)扩增用的PCR引物，设计了以下表11中所显示的核酸序列。具体是，特异扩增编码16s rRNA基因组部分的探针组，即，在大约1400～1700碱基长度的16s rRNA编码领域的两端部分设计尽可能一致的特异融解温度的引物。另外，设计了同时可扩增变异菌株，或基因组上存在的多个16srRNA编码区的多种引物。只要引物组对于病原体编码16s rRNA领域可以通用的，几乎扩增全长，不必限定在下记表11所中列举的引物组也就不言自明了。
表11

表11中所显示的引物是合成后经高压液相层析(HPLC)精制而成的，混合3种正向引物和3种反向引物，溶解在TE缓冲液中，使各自的引物浓度达到最终浓度为10pmol/μl。
[3-1]微生物培养与基因组DNA提取的预处理首先，上述各病原体的标准菌株(金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC12600)、表皮葡萄球菌标准菌株(ATCC14990)、大肠杆菌标准菌株(ATCC11775)、肺炎杆菌标准菌株(ATCC13883)、绿脓杆菌标准菌株(ATCC10145)、粘质沙雷氏菌标准菌株、肺炎链球菌标准菌株、流感杆菌标准菌株、阴沟肠杆菌标准菌株(ATCC13047)、粪肠菌标准菌株(ATCC19433)根据常规方法进行培养，生成微生物培养液。该微生物培养液分别采取1.0ml(OD600＝0.7)至1.5ml容量微量离心管中，离心回收菌体(8500rpm，5min，4℃)。然后，舍弃上清液后，加入300μl酶缓冲液(50mM Tris-HClp.H.8.0，25mM EDTA)，用搅拌机再次使之悬浊。再次离心再次悬浊的菌液，回收菌体(8500rpm，5min，4℃)。舍弃上清液后，在回收的菌体中加入以下的酶溶液，用搅拌机再次悬浊。
溶菌酶 50μl(20mg/ml在酶缓冲液中)
N-乙酰胞壁酸酶SG 50μl(0.2mg/ml在酶缓冲液中)下一步，将加入酶液再悬浊的菌液在37℃的温育箱中静置30分钟，进行细胞壁的溶解处理。
基因组抽提以下所显示的微生物基因组DNA的抽提是使用核酸纯化试剂盒(MagExtractor-Genome-TOYOBO公司制造)。
具体是，首先，在预处理的微生物悬浊液中加入溶解/吸附液750μl和磁性珠子40μl，使用试管搅拌机，剧烈地搅拌10分钟(步骤1)。
其次，在分离台(Magical Trapper)上插入微量离心管，静止30秒，让磁性颗粒集中在离心管壁面，离心管插在台上的状态下，将上清液舍弃(步骤2)。
接着，加入洗涤液900μl，用搅拌机进行5秒钟左右的搅拌，再悬浊(步骤3)。
然后，在分离用台(Magical Trapper)上插入微量离心管，静止30秒，让磁性颗粒集中在离心管壁面，离心管插在台上的状态下，将上清液舍弃(步骤4)。
反复操作上述步骤3、4进行第二次洗涤(步骤5)。此后，加入70％乙醇900μl，用搅拌机搅拌5秒钟再悬浊(步骤6)。
其次，在分离用台(Magical Trapper)上插入微量离心管，静止30秒，让磁性颗粒集中在离心管壁面，离心管插在台上的状态下，将上清液舍弃(步骤7)。
反复操作上述步骤6、7，用70％乙醇进行第二次洗涤(步骤8)后，在回收的磁性颗粒中加入纯水100μl，用搅拌机搅拌10分钟(步骤9)。
接着，在分离用台(Magical Trapper)上插入微量离心管，静止30秒，让磁性颗粒集中在离心管壁面，离心管插在台上的状态下，将上清液回收到新的离心管中。
回收的基因组DNA的检查回收的微生物(各病原体株)的基因组DNA，根据常规方法，进行琼脂糖凝胶电泳以及260/280nm的吸光度测定，测定其质量(低分子核酸混入量、分解程度)和回收量。本实施例中，对于各种菌，大约回收到9～10μg的基因组DNA，没有发现基因组DNA的降解或rRNA的混入。回收的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，使其最终浓度达到50ng/μl，在以下的实施例中使用。
根据特开平11-187900号公报公开的方法准备DNA微阵列。
玻璃基板的洗涤合成石英玻璃基板(大小25mm×75mm×1mm，饭山特殊玻璃公司制造)放在耐热、耐碱的架上，在调制到所定浓度的超声波洗涤用的洗涤液中浸泡。在洗涤液中浸泡一夜后，进行20分钟超声波洗涤。然后取出基板，轻轻地用纯水进行冲洗，再在超纯水中进行20分钟超声波洗涤。然后，在80℃加热的1N NaOH水溶液中浸泡10分钟，再用纯水和超纯水进行洗涤，制备成DNA微阵列用的石英玻璃基板。
表面处理将硅烷偶联剂KBM-603(信越シリコ一ン公司制造)溶解在纯水中，使之浓度达到1％，室温下搅拌2小时。接着，将先前洗涤的玻璃基板浸入硅烷偶联剂的水溶液中，室温下放置20分钟。拿出玻璃基板，轻轻地用纯水洗涤表面后，用氮气吹干基板的两面。接着，将干燥的基板在加热到120℃的烤箱中烘1小时，完成偶联剂处理，将氨基导入到基板表面。然后，准备将同仁化学研究所公司制造的N-(6-马来亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺(以下略称为EMCS)溶解在二甲亚砜与乙醇的1∶1混合溶剂中，使最终浓度达到0.3mg/ml的EMCS溶液。
将烘烤完了的玻璃基板放置冷却，室温下在调制好的EMCS溶液中浸泡2小时。通过这样的处理，通过硅烷偶联剂导入在表面的氨基与EMCS的琥珀酰亚胺基发生反应，使玻璃基板表面导入马来酰亚胺基。从EMCS液中取出玻璃基板，用溶解了先前所述EMCS的混合溶剂对玻璃基板进行洗涤，更进一步用乙醇洗涤后，氮气环境下使之干燥。
探针DNA将实施例1中制备成的微生物检测用探针溶解在纯水中，使最终浓度(溶解墨水时)分别达到10μM，分注后，进行冷冻干燥，将水分除去。
由BJ点样器(打印器)点样DNA，以及与基板的结合准备含有丙三醇7.5wt％、硫二甘醇7.5wt％、尿素7.5wt％、Acetylenol EH 1.0 wt％(川研フアインケミカル公司制造)的水溶液。接着，将先前准备的7种探针(表1)各自溶解在上述的混合溶剂中，以达到规定浓度。将得到的DNA溶液充填在点样器(打印器)(商品名BJF-850佳能公司制造)墨水盒中，装在印字头上。
另外，这里使用的点样器是改造成可以在平板上印刷的仪器。这个点样器通过按所指定的文件作成方法输入点样式样，大约5微微升的DNA溶液可以点样在约120μm间距(ピツチ)上。
使用这个改造的点样器，对一块基板进行点样(印字)操作，制备成DNA微阵列。确认了点样(印字)已确切进行后，加湿箱内中静止30分钟，使玻璃基板表面的马来酰亚胺基与核酸探针末端的硫基发生反应。
洗涤反应30分钟后，由含有100mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗表面残留的DNA溶液，得到玻璃基板表面上固定了DNA一条链的基因芯片(DNA微阵列)。
成为检体的微生物基因的扩增，以及标记反应如下所示。
预混合PCR试剂(TAKARA ExTaq) 25μl模板基因组DNA2μl(100ng)正向引物混合物 2μl(20pmol/每试管)反向引物混合物 2μl(20pmol/每试管)Cy-3 dUTP(1mM) 2μl(2nmol/每试管)水 17μl
共计50μl上述组成的反应液按以下的规程，用市售的热循环仪进行扩增反应。
95℃10分钟 72℃10分钟反应结束后，使用精制用柱(QIAGEN QIAquick PCRPurificationKit)将引物除去(精制)后，对扩增产物进行定量，以作为标记检体。
使用上述[4.DNA微阵列制备]中制备的基因芯片与[5.检体的扩增和标记(PCR扩增&荧光标记的进行)]制备的标记检体，进行检测反应。
DNA微阵列封闭将BSA(牛血清白蛋白级分VSigma公司制造)溶解在100mM氯化钠/10mM磷酸缓冲液中，使之浓度达到1wt％。在此溶液中，将[4.DNA微阵列制备]制备的基因芯片在室温下浸泡2小时，进行封闭。封闭结束后，用含有0.1wt％SDS(十二烷基硫酸纳)2×SSC溶液(氯化钠300mM、柠檬酸纳(柠檬酸三钠二水合物C6H5Na3·2H2O)30mM、pH7.0)进行洗涤，用纯水漂洗后，用旋转干燥装置除去水。
杂交将除去水后的基因芯片装入杂交装置(Genomic Solutions Inc.Hybridization Station)，在以下所示的杂交溶液、条件下进行杂交反应。
杂交溶液6×SSPE/10％甲酰胺/靶(第二次PCR产物全量)
(6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4)。
杂交条件65℃3分钟→92℃2分钟→45℃3小时→在25℃用2×SSC/0.1％SDS洗涤→在20℃用2×SSC洗涤→(用纯水漂洗Manual)→旋转干燥(65℃3分钟、92℃2分钟、45℃3小时使杂交反应后、25℃用2×SSC/0.1％SDS洗涤、20℃用2×SSC洗涤、纯水漂洗、旋转干燥)。
将上述杂交反应结束后的基因芯片用基因芯片荧光检测装置(Axon公司制造、GenePix 4000B)进行荧光测定。其结果在以下表12～21中显示，可以再现性良好地、具有充分信号地检测出各种菌。没有检测出其他菌对探针的杂交体。
另外，在本实施例中，各进行二次荧光测定，各结果显示如下。
表12金黄色葡萄球菌的荧光测定结果

表13表皮葡萄球菌的荧光测定结果

表14大肠杆菌的荧光测定结果

表15肺炎杆菌的荧光测定结果

表16绿脓杆菌的荧光测定结果

表17粘质沙雷氏菌的荧光测定结果

表18肺炎链球菌的荧光测定结果

表19流感杆菌的荧光测定结果

表20阴沟肠杆菌的荧光测定结果

表21粪肠球菌检测用探针的荧光测定结果

表12～21的荧光亮度值(光电倍增器电压400V)显示了像素平均亮度(分辨率5μm)。S/N比值表示为用测定器附带的分析软件将得到的荧光亮度值除于对照平均值。
表12～21中明确显示，可以再现性好地、具有充分信号地检测出各病原体。
实施例2 用2步PCR法检测微生物与实施例1同样，准备探针DNA、检体扩增用PCR引物、各病原体的基因组DNA、DNA微阵列，进行以下的实验。
成为检体的微生物基因的扩增(Ist PCR)以及标记(2nd PCR)反应如下所示。
预混合PCR试剂(TAKARA ExTaq) 25μl模板基因组DNA 2μl(10ng)正向引物混合物2μl(20pmol/每试管)反向引物混合物2μl(20pmol/每试管)水19μl共计 50μl上述组成的反应液按以下的规程，用市售的热循环仪进行扩增反应。
95℃10分钟 72℃10分钟反应结束后，使用精制柱(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit)进行精制后，对扩增产物进行定量。
酶 0.5μl(2.5u)(QIAGEN Hotstar Taq Polymerase)模板基因组DNA(1st PCR产物) 10μl(30ng)dNTP mix(Low dTTP)*2μlCy-3 dUTP(1mM) 2μl(2nmol/试管)
反向引物混合物 5μl(50pmol/每试管)10×缓冲液 5μl水 25.5μl共计 50μl*dNTP mix(Low dTTP)dATP，dCTP，dGTP/5mM(最终10纳摩尔/试管)dTTP/4 mM(最终8纳摩尔/试管)上述组成的反应液按以下的规程，用市售的热循环仪进行扩增反应。
95℃10分钟 72℃10分钟反应结束后，使用精制柱(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit)进行精制，成为标记检体。
与实施例1同样进行。
用DNA微阵列荧光检测装置(Axon公司制造、GenePix 4000B)对杂交反应结束后的DNA微阵列进行荧光检测。其测定结果显示在表22～31中。
另外，在本实施例中，各进行二次荧光测定，各结果显示在表22～31中。
表22金黄色葡萄球菌的荧光测定结果

表23表皮葡萄球菌的荧光测定结果

表24大肠杆菌的荧光测定结果

表25肺炎杆菌的荧光测定结果

表26绿脓杆菌的荧光测定结果

表27粘质沙雷氏菌的荧光测定结果

表28肺炎链球菌的荧光测定结果

表29流感杆菌的荧光测定结果

表30阴沟肠杆菌的荧光测定结果

表31粪肠球菌检测用探针的荧光测定结果

表22-31的荧光亮度值(光电倍增器电压400V)显示了像素平均亮度(分辩率5μm)。S/N比值表示为用测定器附带的分析软件将得到的荧光亮度值除于对照平均值。
表22～31中明确显示，可以再现性好地、具有充分信号地检测出各病原体。
实施例3 用2-步PCR法检测微生物与实施例1、2同样，准备探针DNA、检体扩增用PCR引物、各病原体的基因组DNA、DNA微阵列，进行以下的实验。
成为检体的微生物基因的扩增(Ist PCR)以及标记(2nd PCR)反应如下所示。
AmpliTaq Gold LD(50U/μl) 0.5μl模板基因组DNA 变量dNTP mis(2.5mM/each) 4.0μl×10 PCR缓冲液 5.0μl25mM MgCl27.0μl正向引物混合物(10μM/each) 0.25μl反向引物混合物(10μM/each) 0.25μl水 变量共计 50μl上述组成的反应液按以下的规程，用市售的循环仪进行扩增反应。
95℃10分钟 72℃10分钟反应结束后，使用精制柱(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit)进行精制后，对扩增产物进行定量。
预混合PCR试剂(TAKARA ExTaq) 25μl模板DNA(1st PCR产物)变量(30钠克/试管)
Cy3标记反向引物混合物5μl水 变量共计 50μl上述组成的反应液按照以下规程，用市售的循环进行扩增反应。
95℃10分钟

72℃10分钟反应结束后，使用精制柱(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit)进行精制，成为标记检体。
与实施例1同样进行。
用DNA微阵列荧光检测装置(Axon公司制造，GenePix 4000B)对杂交反应结束后的DNA微阵列进行荧光检测。其测定结果显示在表32～41中。
另外，在本实施例中，各进行二次荧光测定，各结果显示在表32～41中。
表32金黄色葡萄球菌的荧光测定结果

表33表皮葡萄球菌的荧光测定结果

表34大肠杆菌的荧光测定结果

表35肺炎杆菌的荧光测定结果

表36绿脓杆菌的荧光测定结果

表37粘质沙雷氏菌的荧光测定结果

表38肺炎链球菌的荧光测定结果

表39流感杆菌的荧光测定结果

表40阴沟肠杆菌的荧光测定结果

表41粪肠球菌的荧光测定结果

表32-41中明确显示，可以再现性好地、具有充分信号地检测出各病原体。
如以上说明的，经上述实施例，病原体能够用具有检测10种细菌，如，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎链球菌、流感杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠菌能力的，分别被固化或组合的探针组的DNA微阵列检测，使鉴定传染性病原体成为了可能，解决了来自于微生物DNA探针的一大问题。即，寡核苷酸探针由于碱基数少，从化学角度的大量合成是可能的，精制或浓度的控制也是可能的。另外，提供了在根据细菌种进行分类的目的中，同样种的菌种可能一次性检测出，且可以区别其它细菌进行检测的探针组。
这些差异，可以评价为比DNA微阵列精度更好，能够提供考虑到探针与检体的杂交体的稳定性的探针组。更进一步地，为了这些探针DNA与检体进行反应，能够提供固化探针DNA的载体。探针以及探针组与检体溶液发生反应过程中，这些探针DNA被稳定地固化在载体上，为得到再现性高的检测结果，可以提供化学方法固化的载体。
按照上述实施方案，由于准确地检测出传染性病原体基因16srRNA基因序列，能够高效率而又高精度地判断该传染性病原体的存在。
实施例4 关于引物组在上述实施例中，对用于扩增金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎链球菌、流感杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌的任一种，或数种的16s rRNA基因序列的引物组(表11)进行了说明。
本实施方案的引物组是根据为鉴定传染性病原体而进行的PCR反应中给出良好的扩增结果而设计的。这里，“良好的”不仅是指目的16s rRNA的充分扩增，而且还指没有16s rRNA以外的产物。
另外，这里“良好的”是指不扩增包含在检体中来自于检体的人类基因组基因，而是仅扩增传染性病原体的16s rRNA。
本实施方案中使用的检体是指人、家畜等动物来源的血液、脊髓、喀痰、胃液、阴道分泌物、口腔内粘液等体液、尿以及粪便样的排泄物等所有被认为有细菌存在的物质作为对象。另外，成为食物中毒、污染的食物、饮料水以及如温泉一样的自然环境中的水、空气净化器或净水器的过滤膜等，列举为具有可能由细菌引起污染的全部媒介物。还有，在进出口时检疫等的动植物也是作为检体的对象。
本实施方案中使用的PCR反应是包含将抽提出核酸作为模板的PCR反应，或该PCR扩增产物作为模板，进一步用序列号107～109(表11的F1～F3)、或用序列号110～112(表11的R1～R3)一侧引物非对称PCR反应，为了直观，加入标记物PCR法等任一种的反应。
为检测出传染性病原体将扩增16s rRNA基因(靶基因)用的PCR引物设计为如表11所示的核酸序列。
具体地说，将编码16s rRNA基因组部分进行特异扩增的探针组，即，在大约1500碱基长度的16s rRNA编码领域的两端设计具有尽可能一致的特异融解温度的引物。另外，设计为同时也可以扩增变异菌种或基因组上存在数个16s rRNA编码领域的数个引物。
表11中所显示的引物是合成后经高压液相层析精制而成的。全部混合3种正向引物和3种反向引物，溶解在TE缓冲液中，使各自的引物浓度达到最终浓度为10pmol/μl。本实施例中，可以使用全部的正向引物和反向引物，也可以使用分别来自正向引物和反向引物的各1-3种。
使用以上生成的正向引物与反向引物的溶液(Forward Primermix和Reverse Primer mix)，将用[3.提取各病原体基因组DNA(模式检体)]说明的方法抽提的基因组按照[5.检体的扩增和标记(PCR扩增和加入荧光标记)]说明的方法进行扩增。
反应结束后，使用精制柱(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit)除去引物后，通过琼脂胶电泳对扩增产物进行探讨。在1500碱基对领域中检测出一条带，可以确认良好地进行了PCR反应，而且无副产物。
由于使用表11的引物，在如上述所说的10种传染性病原体(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎链球菌、流感杆菌、阴沟肠杆菌以及粪肠球菌)中，全都可以得到良好的PCR扩增效果。
实施例5 扩增来自血液与菌液的混合物的16s rRNA基因在人血液200μl(采样EDTA血)中，加入按照实施例1说明的方法培养的阴沟肠杆菌103、104、105，作为菌血症模式系。在这些溶液中分别加入乙酰胞壁酸酶溶液(0.2mg/ml于酶缓冲液中)，在37℃下加温30分钟后，使用Qiamp Blood mini Kit(キアゲン公司制造)提取DNA，作为PCR反应用的模板。
对于这样的DNA，与实施例4同样，使用表11的引物组进行PCR反应。
其结果，与实施例4同样，在1500碱基对长领域中检测出带，可以确认进行了良好的PCR反应，而且，无副产物，从该带求得的PCR扩增产物量是与加入的菌量成比例的。这一点显示了当使用该引物组时，不产生人类基因组的PCR产物，仅使阴沟肠杆菌的16s rRNA被扩增。
如上所述，按本实施方案，可以高效率、高纯度地扩增数种病原体基因中16s rRNA部分。当人类基因组DNA存在时也可以高效率地仅扩增病原体的16s rRNA。
发明效果如上所述，本发明可以提供可一次性大量制备，且可以在类似菌种间进行鉴定菌种的传染性病原体检测用探针。更具体地说，可以提供一种适合于数种传染性病按照病原体的菌种进行分类的传染性病原体检测用的探针组。
或者，使提供适合检测如上述10种传染性病病原体的传染性病原体检测用探针成为可能。
还有，这些类似菌种间的差异可以高精度地在DNA芯片上被评价，为提供一种也考虑到传染性病检测病原体用探针和检测体以及其杂交体地稳定性的探针组成为可能。
还有，为进行这些传染性病原体检测用探针与检体的反应，可以提供将这些传染性病原体检测用探针固化的载体。
另外，在与检体溶液反应的过程中，为了使这些传染性病原体检测用探针被稳定地固化在载体上，得到高再现性的检测结果，可以提供用化学方法固化的载体。
发明效果本发明以检测传染性病原体和/或鉴定为目的，提供了用于扩增检体中病原体16s rRNA的PCR反应用的引物。
另外，本发明由于可在数个菌种中共同利用，提供了在菌种不明确的状态下也可以有效地扩增传染性病原体16s rRNA的引物组。
还有，本发明提供了数个传染性病原体16s rRNA在同一PCR条件下可能扩增的引物组。
由于本发明的许多广泛而又不同的实施方案显然是不违背其本质和范畴，这可以理解为本发明除了在附加权利要求上有定义的，它并不局限于特殊的实施方案上。
序列表<110>佳能株式会社(CANON KABUSHIKI KAISHA)<120>检测引起感染症病菌的探针和探针组、载体、以及基因筛选方法<130>
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<223>合成DNA探针，命名为PF-11<400>68ttatcctttg ttgccagcgg ttcg24<210>69<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-1<400>69agtagaacgc tgaaggagga gcttg 25<210>70<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-2<400>70cttgcatcac taccagatgg acctg 25<210>71<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-3<400>71tgagagtgga aagttcacac tgtgac 26
<210>72<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-4<400>72gctgtggctt aaccatagta ggcttt 26<210>73<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-5<400>73aagcggctct ctggcttgta act23<210>74<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-6<400>74tagacccttt ccggggttta gtgc24<210>75<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-7<400>75gacggcaagc taatctctta aagcca 26<210>76<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-8<400>76gacatttgct taaaaggtgc acttgca 27<210>77<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PG-9<400>77gttgtaagag aagaacgagt gtgagagtg 29<210>78<211>24
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-1<400>78gcttgggaat ctggcttatg gagg24<210>79<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-2<400>79tgccatagga tgagcccaag tgg 23<210>80<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-3<400>80cttgggaatg tactgacgct catgtg 26<210>81<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-4<400>81ggattgggct tagagcttgg tgc 23<210>82<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-5<400>82tacagaggga agcgaagctg cg 22<210>83<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-6<400>83ggcgtttacc acggtatgat tcatga 26<210>84<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-7<400>84aatgcctacc aagcctgcga tct 23<210>85<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PH-8<400>85tatcggaaga tgaaagtgcg ggact 25<210>86<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-1<400>86cagagagctt gctctcgggt ga 22<210>87<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-2<400>87gggaggaagg tgttgtggtt aataac 26<210>88<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-3<400>88ggtgttgtgg ttaataacca cagcaa 26<210>89<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-4<400>89gcggtctgtc aagtcggatg tg 22<210>90<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-5
<400>90attcgaaact ggcaggctag agtct 25<210>91<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-6<400>91taaccacagc aattgacgtt acccg 25<210>92<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-7<400>92gcaattgacg ttacccgcag aaga 24<210>93<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-8<400>93gtagcacaga gagcttgctc tcg 23<210>94<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-9<400>94cggggaggaa ggtgttgtgg tta23<210>95<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-10<400>95accacagcaa ttgacgttac ccg 23<210>96<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-11<400>96gaaactggca ggctagagtcttgtag 26
<210>97<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PI-12<400>97aggcggtctg tcaagtcgga tg 22<210>98<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-1<400>98ttctttcctc ccgagtgctt gca 23<210>99<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-2<400>99aacacgtggg taacctaccc atcag 25<210>100<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-3<400>100atggcataag agtgaaaggc gctt24<210>101<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-4<400>101gacccgcggt gcattagcta gt 22<210>102<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-5<400>102ggacgttagt aactgaacgt cccct 25<210>103<211>22
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-6<400>103ctcaaccgggg gagggtcatt gg 22<210>104<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-7<400>104ttggagggtt tccgcccttc ag 22<210>105<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-8<400>105atagagcttt cccttcgggg acaaa 25<210>106<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针，命名为PJ-9<400>106cgaggtcatg caaatctctt aaagcttct 29<210>107<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>正向引物的合成DNA，命名为F-1<400>107gcggcgtgcc taatacatgc aag 23<210>108<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>正向引物的合成DNA，命名为F-2<400>108gcggcaggcc taacacatgc aag 23<210>109<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>正向引物的合成DNA，命名为F-3<400>109gcggcaggct taacacatgc aag 23<210>110<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>反向引物的合成DNA，命名为R-1<400>110atccagccgc accttccgat ac 22<210>111<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>反问引物的合成DNA，命名为R-2<400>111atccaaccgc aggttcccct ac 22<210>112<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>反向引物的合成DNA，命名为R-3<400>112atccagccgc aggttcccct ac 22<210>113<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-1的互补DNA序列<400>113tctttcactt ttgaaccatg cggttc 26<210>114<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-2的互补DNA序列<400>114gcagcgcgga tccatctata agtg24<210>115<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-3的互补DNA序列
<400>115ctgattaggt accgtcaaga tgtgca 26<210>116<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-5的互补DNA序列<400>116cgttagctgc agcactaagg gg 22<210>117<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-4的互补DNA序列<400>117gcggtttcgc tgccctttgt att 23<210>118<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-6的互补DNA序列<400>118agctcctaaa aggttactcc accgg 25<210>119<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-7的互补DNA序列<400>119tcgacggcta gctcctaaaa ggtta 25<210>120<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-8的互补DNA序列<400>120accttcgacg gctagctcct aaa 23<210>121<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-9的互补DNA序列<400>121atttgtccca ccttcgacgg cta 23
<210>122<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-10的互补DNA序列<400>122agagaagcaa gcttctcgtc cgt 23<210>123<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-11的互补DNA序列<400>123agcgcggatc catctataag tgaca 25<210>124<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-12的互补DNA序列<400>124cgtcaagatg tgcacagtta cttaca 26<210>125<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-13的互补DNA序列<400>125ggggaaggct ctatctctag agttgt 26<210>126<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PA-14的互补DNA序列<400>126ggctagctcc taaaaggtta ctccac 26<210>127<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-1的互补DNA序列<400>127ggagcaagct cctcgtctgt tc 22<210>128
<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-2的互补DNA序列<400>128agtgacagca aaaccgtctt tcacta 26<210>129<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-3的互补DNA序列<400>129accgtcaaga cgtgcatagt tactta 26<210>130<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-4的互补DNA序列<400>130gggaaaactc tatctctaga ggggtc 26<210>131<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-5的互补DNA序列<400>131gacggctagc tccaaatggt tact24<210>132<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-6的互补DNA序列<400>132gctaacgtca gaggagcaag ctc 23<210>133<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-7的互补DNA序列<400>133ccaaatggtt actccaccgg ct 22<210>134<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>合成DNA探针PB-8的互补DNA序列<400>134cagaggagca agctcctcgt ct 22<210>135<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-9的互补DNA序列<400>135acgtgcatag ttacttacac atttgttct 29<210>136<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PB-10的互补DNA序列<400>136tcgacggcta gctccaaatg gt 22<210>137<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-1的互补DNA序列<400>137tgggcacatc cgatggcaag ag 22<210>138<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-2的互补DNA序列<400>138cgggtaacgt caatgagcaa aggtat 26<210>139<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-3的互补DNA序列<400>139ctgcgggtaa cgtcaatgag caaa24<210>140<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-4的互补DNA序列
<400>140tctacgagac tcaagcttgc cagt24<210>141<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-5的互补DNA序列<400>141cgcgaggtcg cttctctttg tat 23<210>142<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-6的互补DNA序列<400>142actacgacgc actttatgag gtccg 25<210>143<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-7的互补DNA序列<400>143attaacttta ctcccttcct ccccgc 26<210>144<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-8的互补DNA序列<400>144cagcaaagaa gcaagcttct tcctgtta28<210>145<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-9的互补DNA序列<400>145atctggggcac atccgatggc aa 22<210>146<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-10的互补DNA序列<400>146gagcaaaggt attaacttta ctcccttcc 29
<210>147<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-11的互补DNA序列<400>147cggaccgctg gcaacaaaag at 22<210>148<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PC-12的互补DNA序列<400>148caatgagcaa aggtattaac tttactccct t31<210>149<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-1的互补DNA序列<400>149ccgagagcaa gctctctgtg cta 23<210>150<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-2的互补DNA序列<400>150tctgggcaca tctgatggca tga 23<210>151<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-3的互补DNA序列<400>151attaacctta tcgccttcct ccccg 25<210>152<211>25<212> DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-4的互补DNA序列<400>152tcttctgcgg gtaacgtcaa tcgaa 25<210>153
<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-5的互补DNA序列<400>153ggatttcaca tccgacttga cagacc 26<210>154<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-6的互补DNA序列<400>154cccctctaca agactctagc ctgc24<210>155<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-7的互补DNA序列<400>155atctgggcac atctgatggc atga24<210>156<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-8的互补DNA序列<400>156ttaaccttat cgccttcctc cccg24<210>157<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-9的互补DNA序列<4D0>157tcttctgcgg gtaacgtcaa tcgataa 27<210>158<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PD-10的互补DNA序列<400>158gactctagcc tgccagtttc gaatg 25<210>159<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>合成DNA探针PD-11的互补DNA序列<400>159gcctaaccgc tggcaacaaa gg 22<210>160<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-1的互补DNA序列<400>160gaagatcccc cactttctcc ctca24<210>161<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-2的互补DNA序列<400>161gctaatccga cctaggctca tctga 25<210>162<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-3的互补DNA序列<400>162ccaccctcta ccgtactcta gctc24<210>163<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-4的互补DNA序列<400>163gaaattccac caccctctac cgtac 25<210>164<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-5的互补DNA序列<4D0>164gtgtcagtat cagtccaggt ggtc24<210>165<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-6的互补DNA序列
<400>165gaaagttctc agcatgtcaa ggcca 25<210>166<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-7的互补DNA序列<400>166ccacccgagg tgctggtaac taa 23<210>167<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-8的互补DNA序列<400>167cgtccccctt gcggttagac ta 22<210>168<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-9的互补DNA序列<400>168gtactctagc tcagtagttt tggatgca28<210>169<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PE-10的互补DNA序列<400>169aggatcccaa cggctagtcg ac 22<210>170<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-1的互补DNA序列<400>170agggagcaag ctccctgtgc ta 22<210>171<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-2的互补DNA序列<400>171gatgagcgta ttaagctcac cacct 25
<210>172<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-3的互补DNA序列<400>172cttctgcgag taacgtcaat tgatga 26<210>173<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-4的互补DNA序列<400>173tctagcttgc cagtttcaaa tgcagt 26<210>174<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-5的互补DNA序列<400>174ggccgaagct gcaacaaagg ataa24<210>175<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-6的互补DNA序列<400>175ccaccttcct cctcgctgaa agt 23<210>176<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-7的互补DNA序列<400>176gagcaagctc ccctgtgcta cc 22<210>177<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-8的互补DNA序列<400>177tattaagctc accaccttcc tcctcg 26<210>178
<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-9的互补DNA序列<400>178gcgagtaacg tcaattgatg agcgta 26<210>179<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-10的互补DNA序列<400>179tctacgagac tctagcttgc cagtttc 27<210>180<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PF-11的互补DNA序列<400>180cgaaccgctg gcaacaaagg ataa24<210>181<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-1的互补DNA序列<400>181caagctcctc cttcagcgtt ctact 25<210>182<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-2的互补DNA序列<400>182caggtccatc tggtagtgat gcaag 25<210>183<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-3的互补DNA序列<400>183gtcacagtgt gaactttcca ctctca 26<210>184<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>合成DNA探针PG-4的互补DNA序列<400>184aaagcctact atggttaagc cacagc 26<210>185<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-5的互补DNA序列<400>185agttacaagc cagagagccg ctt 23<210>186<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-6的互补DNA序列<400>186gcactaaacc ccggaaaggg tcta24<210>187<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-7的互补DNA序列<400>187tggctttaag agattagctt gccgtc 26<210>188<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-8的互补DNA序列<400>188tgcaagtgca ccttttaagc aaatgtc 27<210>189<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PG-9的互补DNA序列<400>189cactctcaca ctcgttcttc tcttacaac 29<210>190<211>24<212>DNA<213>入工的<220>
<223>合成DNA探针PH-1的互补DNA序列
<400>190cctccataag ccagattccc aagc24<210>191<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-2的互补DNA序列<400>191ccacttgggc tcatcctatg gca 23<210>192<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-3的互补DNA序列<400>192cacatgagcg tcagtacatt cccaag 26<210>193<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-4的互补DNA序列<400>193gcaccaagct ctaagcccaa tcc 23<210>194<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-5的互补DNA序列<400>194cgcagcttcg cttccctctg ta 22<210>195<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-6的互补DNA序列<400>195tcatgaatca taccgtggta aacgcc 26<210>196<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-7的互补DNA序列<400>196agatcgcagg cttggtaggc att 23
<210>197<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PH-8的互补DNA序列<400>197agtcccgcac tttcatcttc cgata 25<210>198<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-1的互补DNA序列<400>198tgcaagcact cgggaggaaa gaa 23<210>199<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-2的互补DNA序列<400>199ctgatgggta ggttacccac gtgtt 25<210>200<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-3的互补DNA序列<400>200aagcgccttt cactcttatg ccat24<210>201<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-4的互补DNA序列<400>201actagctaat gcaccgcggg tc 22<210>202<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-5的互补DNA序列<400>202aggggacgtt cagttactaa cgtcc 25<210>203
<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-6的互补DNA序列<400>203ccaatgaccc tccccggttg ag 22<210>204<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-7的互补DNA序列<400>204ctgaagggcg gaaaccctcc aa 22<210>205<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-8的互补DNA序列<400>205cgagagcaag ctctctgtgc tac23<210>206<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-9的互补DNA序列<400>206taaccacaac accttcctcc ccg 23<210>207<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-10的互补DNA序列<400>207cgggtaacgt caattgctgt ggt 23<210>208<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PI-11的互补DNA序列<400>208ctacaagact ctagcctgcc agtttc 26<210>209<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>合成DNA探针PI-12的互补DNA序列<400>209catccgactt gacagaccgc ct 22<210>210<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-1的互补DNA序列<400>210tcacccgaga gcaagctctc tg 22<210>211<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-2的互补DNA序列<400>211gttattaacc acaacacctt cctccc 26<210>212<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-3的互补DNA序列<400>212ttgctgtggt tattaaccac aacacc 26<210>213<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-4的互补DNA序列<400>213cacatccgac ttgacagacc gc 22<210>214<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-5的互补DNA序列<400>214agactctagc ctgccagttt cgaat 25<210>215<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-6的互补DNA序列
<400>215cgggtaacgt caattgctgt ggtta 25<210>216<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-7的互补DNA序列<400>216tcttctgcgg gtaacgtcaa ttgc24<210>217<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-8的互补DNA序列<400>217tttgtccccg aagggaaagc tctat 25<210>218<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成DNA探针PJ-9的互补DNA序列<400>218agaagcttta agagatttgc atgacctcg 29
权利要求
1.一种检测传染性病原体基因的传染性病原体检测用探针组，其中包括含有具有从下列各组序列选择出的碱基序列的寡核苷酸形成的多种探针包含SEQ ID No.1～14碱基序列及其互补序列的第1组、包含SEQ ID No.15～24碱基序列及其互补序列的第2组、包含SEQ IDNo.25～36碱基序列及其互补序列的第3组、包含SEQ ID No.37～47碱基序列以及其互补序列的第4组、包含SEQ ID No.48～57碱基序列及其互补序列的第5组、包含SEQ ID No.58～68碱基序列及其互补序列的第6组、包含SEQ ID No.69～77碱基序列及其互补序列的第7组、包含SEQ ID No.78～85碱基序列及其互补序列的第8组、包含SEQ ID No.86～97碱基序列及其互补序列的第9组、包含SEQ IDNo.98～106碱基序列及其互补序列的第10组。
2.一种载体，其中，权利要求1所述的传染性病原体检测用探针组中所含的探针用化学方法固定在载体上。
3.一种检测传染性病原体基因的基因检测方法，其中，使用权利要求2所述的载体。
4.一种可以检测来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ IDNo.1～14碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
5.一种可以检测来源于金黄色葡萄球菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针含有具有SEQID No.1～14碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
6.一种载体，其中，权利要求5所述的传染性病检测用探针组中所含的探针是用化学方法固定在载体上的。
7.一种检测来源于金黄色葡萄球菌基因的基因检测方法，其中使用权利要求6所述的载体。
8.一种可以检测来源于表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.15～24碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
9.一种可以检测来源于表皮葡萄球菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.15～24碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
10.一种载体，其中，权利要求9所述的传染性病检测用探针组中所含探针是用化学方法固定在载体上的。
11.一种检测来源于表皮葡萄球菌基因的基因检测方法，其中使用权利要求10所述的载体。
12.一种可以检测来源于大肠杆菌(Escherichia coli)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.25～36碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
13.一种可以检测来源于大肠杆菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.25～36碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
14.一种载体，其中，权利要求13所述的传染性病检测用探针之中至少一种是用化学方法固定在载体上的。
15.一种检测来源于大肠杆菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求14所述的载体。
16.一种可以检测来源于肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.37～47碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
17.一种可以检测来源于肺炎杆菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上病原体检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.37～47碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
18.一种载体，其中，权利要求17的所述传染性病检测用探针之中至少一种探针用化学方法固定在载体上。
19.一种检测来源于肺炎杆菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求18所述的载体。
20.一种可以检测来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.48～57碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
21.一种可以检测来源于绿脓杆菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.48～57碱基序列以及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
22.一种载体，其中，权利要求21所述探针组中所含的探针是用化学方法固定在载体上的。
23.一种检测来源于绿脓杆菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求22所述的载体。
24.一种可以检测来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.58～68碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
25.一种可以检测来源于粘质沙雷氏菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.58～68碱基序列及其互补序列中任一的寡核苷酸。
26.一种载体，其中，权利要求25所述探针组中所含的探针是用化学方法固定在载体上的。
27.一种检测来源于粘质沙雷氏菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求22所述的载体。
28.一种可以检测来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.69～77碱基序列以及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
29.一种可以检测来源于肺炎链球菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.69～77碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
30.一种载体，其中，权利要求29所述的传染性病检测用探针之中至少一种是用化学方法固定在载体上的。
31.一种检测来源于肺炎链球菌基因的基因检测的方法，其中，使用权利要求30所述的载体。
32.一种可以检测来源于流感杆菌(Haemophilus influenzae)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.78～85碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
33.一种可以检测来源于流感杆菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.78～85碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
34.一种载体，其中，权利要求33所述的传染性病检测用探针之中至少一种是用化学方法固定在载体上的。
35.一种检测来源于流感杆菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求34所述的载体。
36.一种可以检测来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.86～97碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
37.一种可以检测来源于阴沟肠杆菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.86-97碱基序列及其互补序列中的任一个寡核苷酸。
38.一种载体，其中，权利要求37所述的传染性病检测用探针之中至少一种是用化学方法固定在载体上的。
39.一种检测来源于阴沟肠杆菌基因的基因检测方法，其中，使用权利要求38所述的载体。
40.一种可以检测来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)基因的传染性病检测用探针，其中所述探针包括具有SEQ ID No.98～106碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
41.一种可以检测来源于粪肠球菌基因的探针组，其中所述探针组包括一种以上传染性病检测用探针，每个探针包括具有SEQ IDNo.98～106碱基序列及其互补序列中任一序列的寡核苷酸。
42.一种载体，其中，权利要求41所述传染性病检测用探针之中至少一种是用化学方法固定在载体上的。
43.一种检测来源于粪肠球菌基因的基因检测的方法，其中，使用权利要求42所述的载体。
44.一种用于传染性病原体16s rRNA基因序列PCR扩增的传染性病原体扩增反应用引物，其中所述引物包括具有SEQ ID No.107～112的碱基序列中任一序列的寡核苷酸。
45.权利要求44的传染性病原体扩增反应用引物，其中所述引物的序列与人类基因组DNA的碱基序列有3个以上碱基不同。
46.一种用于感染性病原体16s rRNA基因序列PCR扩增的传染性病原体扩增反应用引物组，其中所述引物组包括每个含有寡核苷酸的多个引物，其中所述寡核苷酸具有包括SEQ ID No.107～109碱基序列中的至少一个以上和SEQ ID No.110～112碱基序列中的至少一个以上的多个碱基序列。
47.权利要求46的引物组，其中，同时使用所有引物组对人类血液检体进行PCR反应。
48.一种传染性病原体检测方法，其中，使用权利要求46所述的传染性病原体检测用引物组进行PCR扩增处理，通过DNA探针进行传染性病原体的检测。
49.一种检测传染性病原体基因的传染性病原体检测用探针组，其中包括包含具有从下列各组序列选择出的碱基序列的寡核苷酸形成的多种探针包含SEQ ID No.1～9碱基序列及其互补序列的第1组、包含SEQID No.15～21碱基序列及其互补序列的第2组、包含SEQ ID No.25～31碱基序列及其互补序列的第3组、包含SEQ ID No.37～42碱基序列及其互补序列的第4组、包含SEQ ID No.48～55碱基序列及其互补序列的第5组、包含SEQ ID No.58～62碱基序列及其互补序列的第6组、包含SEQ ID No.69～75碱基序列及其互补序列的第7组、包含SEQ ID No.78～84碱基序列及其互补序列的第8组、包含SEQ IDNo.86～92碱基序列及其互补序列的第9组、包含SEQ ID No.98～105碱基序列及其互补序列的第10组。
全文摘要
一种检测传染性病原体基因的传染性病原体检测用探针组，其中包括由具有从下列各组序列选择出的碱基序列的寡核苷酸形成的多种探针包含SEQ ID No.1～14碱基序列及其互补序列的第1组、包含SEQ ID No.15～24碱基序列及其互补序列的第2组、包含SEQ ID No.25～36碱基序列及其互补序列的第3组、包含SEQ ID No.37～47碱基序列以及其互补序列的第4组、包含SEQ ID No.48～57碱基序列及其互补序列的第5组、包含SEQ ID No.58～68碱基序列及其互补序列的第6组、包含SEQ ID No.69～77碱基序列及其互补序列的第7组、包含SEQ ID No.78～85碱基序列及其互补序列的第8组、包含SEQ ID No.86～97碱基序列及其互补序列的第9组、包含SEQ ID No.98～106碱基序列及其互补序列的第10组。
文档编号G01N37/00GK1539994SQ20041003337
公开日2004年10月27日 申请日期2004年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者山本伸子, 小仓真哉, 川口正浩, 塚田护, 吉井裕人, 铃木智博, 石井美绘, 福井寿文, 人, 博, 哉, 文, 浩, 绘 申请人:佳能株式会社