专利名称：对血红蛋白测量的颗粒干扰的校正的方法
技术领域：
本发明涉及血液样品的血红蛋白测量，更具体地，涉及在自动的血液分析仪上对血红蛋白测量的颗粒干扰的校正的方法。
背景技术：
总的血红蛋白浓度的确定指示全血的氧气携带能力。依据具有临床症状的病人的检查并且通过临床上正常的种群的电泳调查，已经发现300个以上的异常血红蛋白。许多这些异常引起已经改变血红蛋白水平的临床病理学或者具有凝固氧气的改变能力的血红蛋白。配备商业的血液分析仪以测量和报告血液样品的血红蛋白浓度。在大部分血液分析仪上，测量血液样品的血红蛋白浓度的过程包含使血液样品中的红细胞溶解并且形成样品混合物中的血红蛋白色原、以预定波长测量样品混合物的分光光度的吸光度、并且报告血液样品的总的血红蛋白浓度。在用于测量血红蛋白浓度的样品混合物中，红细胞被溶解以释放血红蛋白分子， 诸如白细胞、有核红细胞以及血小板的其它细胞颗粒余留在样品混合物中，尽管它们可能受损伤或者尺寸缩小。已知的是，因为细胞颗粒吸收并且散射测量中使用的入射光，所以存在于样品混合物中的这些细胞颗粒干扰血红蛋白的分光光度测量。在正常的血液样品中， 白细胞浓度典型的是从4 X IO3/μ L到9 X IO3/μ L，并且血小板浓度典型的是从200 X IO3/ μ L到400 X IO3/μ L。然而，在一些病理学的条件下，例如，严重的脂血或者蛋白血，白细胞浓度可以高于20Χ107μ ，并且血小板浓度可以高于700Χ107μ 。在一些白细胞增多样品中，白细胞浓度基本上可以高于100X 103/yL。用于血红蛋白测量的样品混合物中的这些细胞颗粒可能导致血红蛋白浓度的显著的估计过高。颗粒干扰还已经与具有大量血红蛋白以及严重的小红细胞症/血红蛋白过少的血液样品相冲突。当前的许多方法被用于防止或者校正细胞颗粒对血红蛋白测量的干扰。在临床以及实验室标准化学会(以前的NCCLQ人工的参考方法中，当样品混合物在750纳米的吸光度> 0. 003时，或者当吸光度比值(在540纳米的吸光度与在504纳米的吸光度相比) < 1. 59时，需要经由0. 22 μ m的过滤器过滤样品混合物，以去除颗粒。在临床诊断实验室中的一般惯例，作为经常由血液分析仪制造商推荐的，在血液分析仪报告异常高的白细胞浓度之后，再次利用预稀释来分析血液样品，以确定血红蛋白浓度。在这个过程中，血液样品被食盐水稀释，或者被在血液分析仪上使用的稀释剂所稀释从而降低颗粒的浓度，例如，把白细胞浓度降低到低于20Χ103/μ L或者制造商推荐的水平。然后，在仪器上再次分析预稀释的样品以测量血红蛋白。考虑稀释剂，从预稀释的样品获得的血红蛋白浓度被用于计算血液样品的血红蛋白浓度。这个方法具有许多缺点。血液样品必需在仪器上被分析两次。它消耗时间并且需要通过操作者人工的制备。该预稀释引入起源于吸管吸入血液和稀释剂的其他的误差，并且在稀释之前和之后，人工地混合血液。 此外，对于具有低血红蛋白浓度的血液样品，进一步的稀释降低了血红蛋白测量的准确度。另一个已知的校正对血红蛋白测量的颗粒干扰的方法是，以两个不同的波长测量样品混合物的吸光度。第一波长是在可见区中，例如在540纳米，被用于测量血红蛋白色原。第二波长是在红外线区，例如在800纳米，从而测量由细胞颗粒引起的混浊度。在第二波长的吸光度被用于校正在第一波长的测量，从而产生校正的血红蛋白浓度。使用这个方法的手持装置，以商品名Hemocue Hb 201+为代表，可在市场上从希曼AB公司(HemoCue AB)(瑞典恩厄尔霍尔姆市)获得。这个装置只是用于测量血红蛋白，而不是其它血液学参数。在一些血液学实验室中，特别是在欧洲，在血液样品已经在血液分析仪上被分析和被报告具有异常高的白细胞浓度之后，然后Hemocue Hb 201+被用于测量和报告血红蛋白浓度。因此，需要一种方法，特别在自动的血液分析仪上的自动的处理，从而校正细胞颗粒对血红蛋白浓度的测量的干扰。

发明内容
在一个方面，本发明指向校正对血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的方法。在一个实施例中，该方法包括将血液样品的等分试样与溶解试剂混合以使红细胞溶解，并且形成样品混合物；以在样品混合物中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量样品混合物的吸光度，并且使用获得的吸光度获得血液样品的表观血红蛋白浓度；测量保留在样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小；使用细胞颗粒的浓度和大小，去除细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响，以便获得血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及报告血液样品的校正的血红蛋白浓度。在一个实施例中，所述细胞颗粒对所述表观血红蛋白浓度的所述影响被定义为所述细胞颗粒的所述浓度和大小系数的函数，以及该函数进一步包括换算系数。通过从表观血红蛋白浓度中减去函数来获得校正的血红蛋白浓度。通过样品混合物中的细胞颗粒的平均体积、平均横截面面积、平均直径或者它们的组合来定义细胞颗粒的大小系数。在进一步的实施例中，该方法进一步包括将获得的细胞颗粒的浓度与预定标准相比较，并且当细胞颗粒的浓度超过该预定标准时，开始校正处理。另外，本发明的方法进一步提供校正的平均红细胞血红蛋白(MCH)和校正的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。在一个实施例中，该方法包括将血液样品的另一个等分试样与稀释剂混合以形成另一个样品混合物；测量在另一个样品混合物中的红细胞的浓度和平均红细胞体积；使用校正的血红蛋白浓度和红细胞的浓度获得校正的平均红细胞血红蛋白 (MCH)；以及使用校正的血红蛋白浓度、红细胞的浓度和平均红细胞体积获得校正的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。在另一方面，本发明指向用于校正对血液分析仪上的血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的自动的处理。该处理包括使第一样品混合物部分通过光路，以在所述第一样品混合物部分中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量所述第一样品混合物部分的吸光度以获得所述血液样品的表观血红蛋白浓度，以及在第一存储器中存储所述表观血红蛋白浓度；使第二样品混合物部分通过颗粒测量装置，对所述第二样品混合物部分中的细胞颗粒的数量进行计数以获得所述细胞颗粒的浓度，以及在第二存储器中存储所述浓度。使用所述浓度以及所述细胞颗粒的大小函数来确定影响的血红蛋白当量；从所述表观血红蛋白浓度去除获得的影响的血红蛋白当量以获得所述血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及报告血液样品的校正的血红蛋白浓度。在一个实施例中，通过将血液样品的一个等分试样与溶解试剂混合以溶解其中的红细胞，来一起制备第一样品混合物部分和第二样品混合物部分。在另一个实施例中，通过将血液样品的第一等分试样与第一溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备第一样品混合物部分，以及通过将血液样品的第二等分试样与第二溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备第二样品混合物部分。在进一步实施例中，通过将所述血液样品的第一等分试样与第一溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备所述第一样品混合物部分，以及通过将所述血液样品的第二等分试样与用于测量血小板的稀释剂混合来制备所述第二样品混合物部分。在进一步的实施例中，该处理进一步包括将细胞颗粒的浓度与预定标准相比较， 并且当细胞颗粒的浓度超过一个以上的该预定标准时，开始校正处理。以下参考附图详细描述本发明的进一步特征和优势，以及各个实施例的构成与操作。注意，本发明不局限于在此描述的具体实施例。在此呈现的这种实施例只是用于说明的目的。基于在此涵盖的教导，其他的实施例对于相关领域的技术人员来说是显而易见的。


在此合并到说明书并且形成说明书的一部分的附解本发明，并且连同说明书一起进一步用来说明本发明的原理，并且使相关领域的技术人员能够制造和使用本发明。图1显示如实例1中描述的在血液分析仪上获得的正常血液样品的白细胞分布直方图。图2图解血液样品的表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度之间的差关于白细胞的浓度和大小的相关性。图3A到3D图解四个临床异常的血液样品的白细胞大小分布直方图，全部具有极高的白细胞浓度，却具有不同的亚群浓度。图4显示血液样品的表观血红蛋白浓度和具有增加两个不同大小的细胞类似物的白细胞浓度的相关曲线。图5A显示血液样品的表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度之间的差、和总的细胞颗粒浓度(Cp)与细胞颗粒的平均横截面面积(Am)的乘积的相关曲线。图5B显示血液样品的表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度之间的差、和总的细胞颗粒浓度(Cp)与细胞颗粒的平均直径(Dm)的乘积的相关曲线。图6显示使用实验的血液分析仪和在实例1中描述的参考方法测量的、143个血液样品的表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度的相关曲线。图7显示图6中显示的相同的血液样品的校正的血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度的相关曲线，其中，使用样品混合物中的总的细胞颗粒浓度和细胞颗粒的加权平均体积的函数获得校正的血红蛋白浓度。
图8显示图6中显示的相同的血液样品的校正的血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度的相关曲线，其中，使用样品混合物中的总的细胞颗粒浓度和细胞颗粒的加权平均横截面面积的函数获得校正的血红蛋白浓度。图9显示图6中显示的相同的血液样品的校正的血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度的相关曲线，其中，使用样品混合物中的总的细胞颗粒浓度和细胞颗粒的加权平均直径的函数获得校正的血红蛋白浓度。当结合附图时从以下阐明的详细说明，本发明的特征和优势将变得更明显，其中， 同样的参考特征自始至终识别相应的元件。
具体实施例方式本发明针对校正对于血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的方法。该说明书公开了包括本发明的特征的一个以上的实施例。公开的实施例仅仅举例说明本发明。本发明的范围不局限于公开的实施例。本发明进一步由附加的权利要求书所限定。描述的实施例以及说明书中对于“一个实施例”、“实施例”、“实例实施例”等等的引用表示描述的实施例可以包括特定的特征、结构或者特性，但是每个实施例可能不一定包括特定的特征，结构或者特性。此外，这种短语不一定涉及相同的实施例。进一步，当结合实施例描述特定的特征、结构或者特性时，可以理解，结合其他是否明确描述的实施例实现这种特征、结构或者特性是属于本领域的技术人员的学识范围。在一个实施例中，本发明提供一种对于在血液分析仪上的血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的校正的方法。更具体地说，该方法包括(a)将血液样品的等分试样与溶解试剂混合以使红细胞溶解，并且形成样品混合物；(b)以在样品混合物中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量样品混合物的吸光度，并且使用获得的吸光度获得血液样品的表观血红蛋白浓度；(c)测量保留在样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小；(d)使用细胞颗粒的浓度和尺寸，去除细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响，以便获得血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及(e)报告血液样品的校正的血红蛋白浓度。术语“报告”应当被大致地解释为包括这样的动作制备打印输出纸；提供电子记录；在监视器(或者其它显示单元)上显示信息；将信息从一个仪器传送到另一个；或者其它等效的功能。在此使用的术语细胞颗粒指的是在将血液样品与溶解试剂混合之后保留在样品混合物中的各种颗粒，包括有核血细胞(诸如白细胞以及有核红细胞)、血小板、巨血小板、 血小板凝块、未溶解的红细胞、以及细胞碎屑。在这些细胞颗粒之中，白细胞通常是最充足的。在正常的血液样品中，白细胞或者白血球包括五个主要的亚群，淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞以及嗜碱细胞。后面三个类型的白细胞被总体地称为粒细胞。在异常的血液样品中，也可能存在各种临床上的异常的白血球种群，诸如胚细胞、未成熟的粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞、变异的淋巴细胞等等。根据在血液分析仪上使用的溶解试剂以及特殊反应条件，白细胞亚群的大小基本上可以改变。通常，当在相对温和的反应条件之下遭受相对温和的溶解试剂时，白细胞亚群的大小基本上可以被维持在它们天然的形状中。这通常是在执行白细胞的五分类分析时的情形，即，把白细胞分类成为上述五个主要的亚群。然而，当遭受强烈的溶解试剂时，白细胞也被局部地溶解。在这种情况下， 细胞膜被局部地损伤并且细胞质基本上被释放。这通常是在执行白细胞的三分类或者两分类分析时的情形，即，把白细胞分别分类成为淋巴细胞、单核细胞以及粒细胞，或者把白细胞分别分类成为淋巴样细胞和骨髓细胞。此外，当遭受非常强烈的溶解试剂时，白细胞可能瓦解而接近单个群体。在溶解情况下，有核红细胞典型的被局部溶解。它们的细胞膜被损伤并且细胞质被释放。这些局部溶解的细胞基本上处于它们的细胞核体积，这典型地小于白细胞。血小板基本上小于白细胞。在正常的血液样品中，血小板是从2到25毫微微升 (fL)。在溶解情况下，血小板在大小上典型地被进一步缩小。在如上所述的细胞颗粒之中， 血小板在被用于血红蛋白测量的样品混合物中的最小颗粒之中。然而巨血小板以及血小板凝块可能具有接近于白细胞的大小。另一方面，在丰度方面，在血液样品中的巨血小板以及血小板凝块基本上典型地不比白细胞充足。对于一些临床的样品，红细胞更加难以溶解，例如来自镰状细胞危机病人的血液样品、以及具有诸如胆固醇或者甘油三酯的高脂类含量的血液样品。因此，这些试样通常被称为难溶解样品。对于这些血液样品，用于血红蛋白测量的样品混合物常常包含未溶解的红细胞以及实质上的细胞碎屑的量。该细胞碎屑可能包括未溶解的细胞膜、细胞膜的凝聚物及其他细胞成分。在此使用的术语“表观血红蛋白浓度”指的是在如上所述的一个以上类型的细胞颗粒的情况下从样品混合物测量的血液样品的血红蛋白浓度。术语“血液样品的校正的血红蛋白浓度”是使用在下文中详细描述的本发明的校正处理而获得的血红蛋白浓度。在此使用的术语“参考血红蛋白浓度”指的是使用诸如CLSIH15-A3参考方法的参考方法而获得的血液样品的血红蛋白浓度。在此使用的术语“校正处理”指的是一个以上的样品分析处理，该样品分析处理校正由用于血红蛋白测量的样品混合物中的细胞颗粒对血红蛋白测量的影响。在此使用的术语“细胞颗粒的大小”指的是使用颗粒的体积、横截面面积、直径或者半径表示的颗粒大小。术语“横截面面积”指的是经过颗粒中心的颗粒的横截面的面积， 其中假定颗粒是球形的。在如上所述的处理中，当血液样品与溶解试剂混合时，红细胞完全地被溶解，并且血红蛋白分子被释放到样品混合物。该释放的血红蛋白分子与配合基起反应并且形成稳定的色原。以可见区中的预定波长，典型地在400纳米和680纳米之间，通过光谱学测量血红蛋白色原。在血液分析仪上，在混合室或者液槽中，典型地以从大约50 1到大约300 1 的稀释比，制备样品混合物。典型地，通过真空力导致样品混合物经过比色皿，该比色皿在其一侧上具有光源，并且在相反侧上具有检测器。透射通过试管的光以预定波长被测量，该透射通过比色皿的光与经过血红蛋白色原的光的吸光度成反比，并且用于根据比尔朗伯定律计算血液样品的血红蛋白浓度。如在下文中进一步详细描述的，经过入射光的散射和吸收，保留在样品混合物中的细胞颗粒导致透射光的损失。因此，在该测量中获得的血红蛋白浓度在此被称为表观血红蛋白浓度，其包括由细胞颗粒对测量的干扰引起的某种程度的误差。在测量正常的以及大多数临床的血液样品中，白细胞处于每微升(μ L) 4 X IO3到9 X IO3 的浓度范围，由样品混合物中保留的白细胞引起的误差小于每分升(g/dL)0. 1克，这是在血红蛋白测量的误差范围之内并且被认为可以忽略的。因此，应当理解，当没有干扰时，在血液分析仪上获得的表观血红蛋白浓度是血液样品的真实的血红蛋白浓度。
为了本发明的目的，本领域中已知的各种溶解试剂可以被用于测量血红蛋白浓度。通常，用于血红蛋白测量的溶解试剂包含一个以上的溶解剂、足量的用以溶解样品混合物中的红细胞的典型的一个以上的表面活性剂、足量的用以形成具有血红蛋白的稳定色原的配合基或者血红蛋白稳定剂。对于一些溶解试剂，表面活性剂还可以形成具有用于测量的血红蛋白的稳定的色原。另外地，配合基被包含在与溶解试剂一起使用的血液稀释剂中。在一个实施例中，溶解试剂可以与血液稀释剂一起被使用，其中，首先利用等渗的血液稀释剂稀释血液样品，然后添加和混合溶解试剂被以便形成样品混合物。适当的溶解试剂包括但不局限于美国第 4，346，018,4, 962，038,5, 763，280,5, 834，315,6, 573，102 以及7，235，404号专利中描述的那些，通过引用将它们全部结合在此。适当的血液稀释剂包括但不局限于美国第4，521，518,4, 528，274,5, 935，857以及6，706，526号专利中描述的那些，通过引用将它们全部结合在此。另外地，单一的溶解试剂可用于稀释血液样品以及溶解红细胞。适当的溶解试剂包括但不局限于美国第5，882，934以及5，M2，832号专利以及W0/1995/024651中描述的那些，通过引用将它们全部结合在此。在一个实施例中，还使用用于如上所述的血红蛋白测量的相同的样品混合物来测量血液样品的白细胞浓度。在该测量中，典型地，通过真空力使得样品混合物经过一个以上的孔，并且白细胞通过检测器被逐个细胞地计数，以便获得血液样品的白细胞浓度。血液样品的白细胞浓度通常还被称为WBC计数。在进一步的实施例中，除了测量白细胞浓度之外，还使用用于如上所述的血红蛋白测量的相同的样品混合物来测量白细胞亚群的大小分布。执行白细胞亚群的分布的分类分析，以便将白细胞分类成为两个亚群(即，淋巴样细胞和骨髓细胞)、三个亚群(即，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)、或者五个亚群(即，淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞、和嗜碱细胞)。在一个实施例中，直流电(DC)阻抗测量被用于对白细胞的大小分布进行计数和测量。当悬浮在传导溶液中的颗粒或者血细胞经过聚焦流的流动细胞计数池或者非聚焦流的孔时，由于阻抗的增加，可以测量电信号或者脉冲。电脉冲被用于对血液样品的样品混合物中的白细胞的数量进行计数。另一方面，脉冲波形、高度以及宽度直接与颗粒的体积有关，并且可以被转换为测量的细胞的体积。当包含具有不同大小的两个以上血细胞亚群的样品混合物被测量时，从测量获得的直方图可以代表这些血细胞的大小分布。用于通过配备有DC阻抗测量装置的血液分析仪来对血细胞进行计数和量尺寸的检测方法以及设备一般在美国第2，656，508、 3，810，011以及5，125，737号专利中被描述，通过引用将它们全部结合在此。在此，短语“对血细胞量尺寸”指的是细胞大小或者体积测量。另外地，低角度光散射测量还可以被用于对血细胞进行计数以及量尺寸。在此，术语“低角度光散射”指的是在自入射光起小于10°的范围内测量的光散射信号。发明人已经发现，在用于血红蛋白测量的样品混合物中的细胞颗粒对吸光度测量的干扰取决于细胞颗粒的浓度以及这些颗粒的大小。换句话说，细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响是保留在样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小两者的函数。使用本发明的血红蛋白测量方法的一个示范性的实施例可以图解这个效果。
在该示范性的实施例中，使用制备的样品混合物，测量血液样品的血红蛋白浓度、 白细胞浓度以及白细胞亚群的三分类。更具体地，如实例1中描述的，首先在血液分析仪上的WBC液槽中利用等渗稀释剂稀释血液样品的等分试样，并且溶解试剂与稀释的样品混合以形成样品混合物，具有大约250 1的总的稀释比。样品混合物通过一组三个非聚焦流的孔被提取、并且使用DC阻抗测量而被测量，以获得具有预定阈值的总的颗粒计数，并且获得被称为白细胞分布直方图的细胞大小分布直方图。样品混合物进一步经过限定宽度的比色皿，该比色皿在一侧上具有光源，并且在相反的侧上具有光检测器。换句话说，样品混合物经过具有限定距离(例如0. 5或者1厘米)的光路。透射通过样品混合物的光在大约 540纳米被测量，并且被用于计算表观血红蛋白浓度(AHgb)。总的颗粒计数被用于计算白细胞浓度，并且使用白细胞分布直方图(进一步参见实例1中的详情)，白细胞被进一步分类成为淋巴细胞、单核细胞以及粒细胞。此外，该分布直方图进一步被用于识别超出检测阈值的其它细胞颗粒，诸如有核红细胞、巨血小板、血小板凝块以及细胞碎屑。如果其它细胞颗粒存在，则从白细胞去除它们以产生校正的白细胞浓度。图1显示在实例1中描述的血液分析仪上获得的正常的血液样品的白细胞分布直方图。如显示的，在该样品混合物中，淋巴细胞具有从大约30fL到大约IlOfL的大小，单核细胞具有从大约IlOfL到大约170fL的大小，以及粒细胞具有从大约170fL到大约450fL 的大小。从该直方图可以领会，在样品混合物中，不同的白细胞亚群在大小上实质上是可以不同的。如实例1中描述的，在实验的血液分析仪上分析从四个医院收集的143个全血样品。大约75%的这些血液样品具有从llX107yL到260X 103/yL的高的白细胞浓度。使用CLSI参考方法还测量这些相同的血液样品的血红蛋白浓度，利用该CLSI参考方法，全血样品经由0. 2μπι的过滤器被过滤，以在分光光度计上人工测量吸光度之前去除白细胞。图2图解获得的这些血液样品的表观血红蛋白浓度关于保留在样品混合物中的细胞颗粒的浓度以及大小的相关性。在图2中，在图表中，X轴是没有从白细胞(还称为原始的WBC)中去除其它细胞颗粒的总的颗粒浓度(Cp)；以及Y轴是表观血红蛋白浓度(表观 Hgb)和使用参考方法获得的血红蛋白浓度之间的差值，使用参考方法获得的血红蛋白浓度被称为参考血红蛋白浓度(参考Hgb)。表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度之间的差值主要归因于细胞颗粒的干扰，特别是这些高的WBC样品中的白细胞的干扰。注意，靠近图表的起点观察到的大约士0. 2g/dL的少量的差值是在血液分析仪上的方法的误差范围之内， 该误差范围典型的具有士0. 2g/dL的精确度；此外，人工的参考方法的误差范围比自动的血液分析仪的误差范围高。在图表下方的表中，提供具有超过100X 103/μ L的极高的白细胞浓度的八个血液样品的总的颗粒浓度(原始的WBC)以及亚群的百分比。在图表上接近相应的数据点处还显示用于这八个血液样品中的每个血液样品的样品编号。如图表中所示，表观血红蛋白浓度和参考血红蛋白浓度之间的差值随着总的颗粒浓度而增加。此外，使用表中所示的八个血液样品，可以清楚地领会干扰程度关于颗粒大小的相关性。更具体地，血液样品编号1、2和3具有分别为64. 1%、61.0(%和61.8(%的异常高的淋巴细胞百分比，以及分别为14.4%、14.7%和13. 2%的异常低的粒细胞百分比。在这三个样品之中，白细胞浓度从血液样品编号1到编号3增加，由此，差值(表观Hgb-参考 Hgb)在相同的方向上增加。
另一方面，血液样品编号4具有与血液样品编号2类似的白细胞浓度，即，前者具有135. 5 X IO3/ μ L以及后者具有138. 6 X IO3/ μ L。然而，血液样品编号4具有96. 1 %的异常高的粒细胞百分比以及0.2%的异常低的淋巴细胞百分比。如图表中所示，在这两个样品之间，差值(表观Hgb-参考Hgb)实质上是不同的，血液样品编号4中的差值明显地较高。类似于血液样品编号4，血液样品编号7和8同样分别具有86. 2%和83. 的异常高的粒细胞百分比，以及分别具有0. 2%和0. 5%的异常低的淋巴细胞百分比。如图2的图表所示，血液样品编号4、7和8落在实线上，该实线反映出血红蛋白差值(表观Hgb-参考Hgb)和总的颗粒浓度之间的线性相关。另一方面，血液样品编号1、2 和3落在虚线上，该虚线同样反映出差值(表观Hgb-参考Hgb)和总的颗粒浓度之间的线性相关，但是具有比实线明显小的斜率。可以进一步领会，血液样品编号5和6具有异常高的单核细胞百分比以及减少的粒细胞百分比。注意，来自这两个样品的数据点落入实线和虚线之间。图3Α到3D分别显示血液样品编号1、2、4和7的白细胞直方图。如所示的，血液样品编号4和7基本上主要地含有比血液样品编号1和2更大的颗粒。图2中所示的实验结果清楚地表明细胞颗粒对血红蛋白测量的干扰，或者它们的浓度对表观血红蛋白浓度的干扰随着细胞颗粒的大小而增加。使用类似物模型进一步图解该大小相关性。如实例2中描述的，具有不同大小的两个不同类型的细胞类似物被用于评估对血红蛋白测量的干扰的尺寸影响。细胞类似物是淋巴细胞和粒细胞类似物，用于在实例1和2中描述的血液分析仪上为三分类分析进行参考控制。在该试验中，制备两组模拟的高白细胞样品。在第一组中，正常的全血样品的9个相同的等分试样被分配到试管中，然后以递增次序，预定量的淋巴细胞类似物悬液被添加到试管中，以产生仅仅具有模拟的淋巴细胞的模拟的高白细胞样品。类似地，在第二组中， 正常的全血样品的9个相同的等分试样被分配到试管中，然后以递增次序，预定量的粒细胞类似物悬液被添加到试管中，以产生仅仅具有模拟的粒细胞的模拟的高白细胞样品。注意，随着细胞类似物的量增加，由于由液体介质中悬浮的类似物的添加所引起的稀释，所以试管中的血红蛋白的浓度减小。然后如实例2中描述的，以分析血液样品的同样方式，在血液分析仪上分析这些试验样品。在图4中显示获得的表观血红蛋白浓度和白细胞浓度的相互关系。在图4中，X轴是类似物浓度并且Y轴是表观血红蛋白浓度。由实心符号(沿着上面两条线)表示的数据点是从两组试验样品中获得的表观血红蛋白浓度。由空心符号表示的数据点是根据由类似物悬浮液的添加引起的稀释度计算出的理论上的血红蛋白浓度。如图4所示，在考虑稀释之后，这两组试验样品的血红蛋白浓度应当以下面两条线中所示的顺序线性地减少。然而，因为由细胞类似物引起的干扰，所以获得的表观血红蛋白浓度基本上较高。如所示的，表观血红蛋白浓度随着类似物浓度的增加而增加。更重要地，表观血红蛋白浓度在包含粒细胞类似物的试验样品中基本上比在包含淋巴细胞类似物的试验样品中高。从图1和3A-3D图解的直方图中可以领会，每个血液样品可以具有不同的颗粒大小分布，尤其是对于各种临床上的异常的血液样品。然而，虽然在样品之中的复杂性和显著变化，但是本发明人已经出乎意料地发现，使用用于血红蛋白测量的样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小的函数，可以有效地校正细胞颗粒，尤其是有核血细胞，对表观血红蛋白浓度的影响。在一个实施例中，细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响被定义为影响的血红蛋白当量，这是用于血红蛋白测量的样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小的函数。更具体地， 影响的血红蛋白当量可以在数学上被表示为样品混合物中的细胞颗粒的浓度(Cp)和大小系数(Sf)与换算系数的乘积函数。在一个实施例中，可以通过使用下面的公式1来去除细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响Hgb = AHgb- β * Cp * Sf(1)其中，Hgb是血液样品的校正的血红蛋白浓度；AHgb是如上定义的表观血红蛋白浓度；β是换算系数，可以如下文中进一步描述的用实验方法确定；CP是由颗粒测量装置测量的样品混合物中的总的细胞颗粒浓度。应当理解的是，被测量的细胞颗粒超过颗粒测量装置的检测阈值，被测量的细胞颗粒没有包括低于阈值的较小的颗粒。可以理解的是，当没有其它细胞颗粒的明显的量时，Cp基本上是与血液样品的白细胞浓度相同。&是大小系数，是由在血液分析仪上使用的颗粒测量装置测量的所有细胞颗粒的大小的函数。可以领会，细胞颗粒的大小可以由不同的参数表示，诸如由颗粒的体积、横截面面积或者直径表示。使用DC阻抗测量，由细胞颗粒产生的电脉冲形状、高度和宽度直接与颗粒的体积相关，并且可以被转换为颗粒的体积。如图1所示，传统上以毫微微升报告细胞颗粒的测量体积。可以理解，样品混合物中的白细胞可以不完全是球状。然而，为了本发明， 细胞颗粒可以近似为球状颗粒。因此，当使用不同的参数表示细胞颗粒的大小时，可以使用球状颗粒的体积、横截面面积、直径以及半径之间的关系。在一个实施例中，由样品混合物中的细胞颗粒的平均体积(Vm)定义&。因此，上述的公式1可以被如下表示Hgb = AHgb- β v * Cp * Vm(2)在公式2中，β v是可以如下所述用实验方法确定的换算系数；并且Cp是在上面定义的样品混合物中的总的细胞颗粒浓度。该平均体积(Vm)包括细胞颗粒的加权平均体积、 几何平均体积、模体积、中值体积或者其它适当的体积的平均值。更好地，Vm是样品混合物中的细胞颗粒的加权平均体积，相应地可以从以下公式
获得其中，i是在白细胞分布直方图上的通道(channel)的索引Ji是第i个通道中的细胞颗粒的体积；fi是第i个通道中的脉冲频率，表示第i个通道中的颗粒数；以及N是在白细胞分布直方图上的通道的总数。在细胞颗粒的大小分布的测量中，诸如如上所述的白细胞的分类分析中，使用具有典型的256个通道的预定分辨率的通道化器(channelize!·)。由颗粒产生电脉冲的振幅对应于颗粒的大小。当用已知体积的参考颗粒校准仪器时，则每个通道对应于已知体积。 因此，根据颗粒的大小，在不同的通道中收集在样品混合物的测量期间的电脉冲。如图1所示，从白细胞的测量可以领会，其中，256个通道被用于测量具有从30fL到450fL的大小范围的白细胞。可以理解的是，使用上述公式3，获得的细胞颗粒的加权平均体积考虑来自样品混合物中测量的所有颗粒的影响。另外地，Vm还可以由细胞颗粒的几何平均体积、模体积、中值体积或者其它适当的体积的平均值表示。这些参数是细胞颗粒的平均体积的不同的表示法，并且可以从血液样品的白细胞分布直方图中被确定。换算系数可以用实验方法被确定。上述公式2可以如下所示被重新整理βν = (AHgb-Hgb)/(Cp * Vm)(4)如公式4中所示，AHgb、Vm和Cp可以如上所述在血液分析仪上被确定，并且可以使用参考方法确定Hgb。数学上，β 7是AHgb-Hgb KCp*Vm的相关曲线的斜率。因此，可以从包括具有高的白细胞浓度的多个血液样品的测量中得到β ν。注意，细胞颗粒浓度Cp还可以以相当于血液样品中的颗粒的浓度的单位被表示。 因为在血液分析仪上，白细胞浓度总是被报告为全血中的细胞的浓度，所以在考虑测量中进行的稀释之后，可以以同样方式表示样品混合物中的总的细胞颗粒浓度。只要β按照Cp 的单位被获得并且用于校正，颗粒浓度和它在血红蛋白上的效果之间的关系保持相同。在另一个实施例中，由样品混合物中的细胞颗粒的平均横截面面积(Am)定义Sf。 因此，上述的公式1可以被如下公式5表示Hgb = AHgb- β A * Cp * Am(5)在公式5中，β 4是可以如下所述用实验方法确定的换算系数；并且Cp是如上面定义的样品混合物中的总的细胞颗粒浓度。该平均横截面面积(Am)包括细胞颗粒的加权平均横截面面积、几何平均横截面面积、众数横截面面积、中值的横截面面积或者其它适当的横截面面积的平均值。更好地，Am是样品混合物中的细胞颗粒的加权平均横截面面积，相应地可以从以下公式获得
权利要求
1.一种对血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的校正的方法，其特征在于，所述方法包括(a)将血液样品的等分试样与溶解试剂混合以使红细胞溶解，并且形成样品混合物；(b)以在所述样品混合物中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量所述样品混合物的吸光度，并且使用获得的吸光度获得所述血液样品的表观血红蛋白浓度；(c)测量保留在所述样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小；(d)使用所述细胞颗粒的所述浓度和所述大小来去除所述细胞颗粒对所述表观血红蛋白浓度的影响，以获得所述血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及(e)报告所述血液样品的所述校正的血红蛋白浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒对所述表观血红蛋白浓度的所述影响被定义为所述细胞颗粒的所述浓度和大小系数的函数。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大小系数由所述细胞颗粒的平均体积定义。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述平均体积包括从所述细胞颗粒的大小分布确定的加权平均体积、几何平均体积、众数体积或者中值体积。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述大小系数由所述样品混合物中的所述细胞颗粒的平均横截面面积定义。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述平均横截面面积包括从所述细胞颗粒的大小分布确定的加权平均横截面面积、几何平均横截面面积、众数横截面面积或者中值横截面面积。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述大小系数由所述样品混合物中的所述细胞颗粒的平均直径定义。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述平均直径包括从所述细胞颗粒的大小分布确定的加权平均直径、几何平均直径、众数直径或者中值直径。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒的所述大小系数由包含所述样品混合物中的所述细胞颗粒的平均体积、平均横截面面积、平均直径以及它们的组合的组中的一个以上的组成部分定义。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述函数进一步包括换算系数；并且通过从所述表观血红蛋白浓度中减去所述函数来获得所述校正的血红蛋白浓度。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量所述细胞颗粒的浓度和大小进一步包括确定所述细胞颗粒的亚群的浓度和大小。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒对所述表观血红蛋白浓度的所述影响被定义为所述细胞颗粒的所述亚群的所述浓度和大小系数的函数。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过DC阻抗测量来测量细胞颗粒的所述浓度和大小。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过光散射测量来测量细胞颗粒的所述浓度和大小。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定波长是380纳米-770纳米。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定波长是处于大约540纳米。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞颗粒包含白细胞、有核红细胞、血小板、巨血小板、血小板凝块、未溶解的红细胞或者细胞碎屑。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含在(c)之后，将(c)中获得的细胞颗粒的所述浓度与预定标准相比较；并且当细胞颗粒的所述浓度超过所述预定标准时， 开始(d)。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括(f)将所述血液样品的另一个等分试样与稀释剂混合以形成另一个样品混合物；(g)测量在所述另一个样品混合物中的红细胞的浓度和平均细胞体积；(h)使用(d)中获得的所述校正的血红蛋白浓度以及(g)中获得的所述红细胞的所述浓度来获得校正的平均红细胞血红蛋白(MCH)；以及(i)使用(d)中获得的所述校正的血红蛋白浓度、(g)中获得的所述红细胞的浓度和所述平均细胞体积来获得校正的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。
20.—种在血液分析仪上用于校正对血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的自动的处理，其特征在于，所述处理包括(a)使第一样品混合物部分通过光路，以在所述第一样品混合物部分中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量所述第一样品混合物部分的吸光度以获得所述血液样品的表观血红蛋白浓度，以及在第一存储器中存储所述表观血红蛋白浓度；(b)使第二样品混合物部分通过颗粒测量装置，对所述第二样品混合物部分中的细胞颗粒的数量进行计数以获得所述细胞颗粒的浓度，以及在第二存储器中存储所述浓度；(c)使用所述细胞颗粒的所述浓度和大小的函数来确定影响的血红蛋白当量；(d)从所述表观血红蛋白浓度中去除获得的影响的血红蛋白当量以获得所述血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及(e)报告所述血液样品的所述校正的血红蛋白浓度。
21.如权利要求20所述的处理，其特征在于，通过将所述血液样品的一个等分试样与溶解试剂混合以溶解其中的红细胞，来一起制备所述第一样品混合物部分以及所述第二样品混合物部分。
22.如权利要求20所述的处理，其特征在于，通过将所述血液样品的第一等分试样与第一溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备所述第一样品混合物部分，以及通过将所述血液样品的第二等分试样与第二溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备所述第二样品混合物部分。
23.如权利要求20所述的处理，其特征在于，通过将所述血液样品的第一等分试样与第一溶解试剂混合以溶解其中的红细胞来制备所述第一样品混合物部分，以及通过将所述血液样品的第二等分试样与用于测量血小板的稀释剂混合来制备所述第二样品混合物部分。
24.如权利要求20所述的处理，其特征在于，所述细胞颗粒的所述浓度包括所述细胞颗粒的每个亚群的浓度。
25.如权利要求M所述的处理，其特征在于，所述确定影响的血红蛋白当量包括使用所述每个亚群的所述浓度以及预定的亚群大小系数来确定亚群影响的血红蛋白当量。
26.如权利要求25所述的处理，其特征在于，所述去除获得的影响的血红蛋白当量包括从所述表观血红蛋白浓度中减去所述每个亚群的所述亚群影响的血红蛋白当量。
27.如权利要求20所述的处理，其特征在于，进一步包含在(c)之前，将所述细胞颗粒的所述浓度与预定标准相比较，并且当所述细胞颗粒的所述浓度超过所述预定标准时，开始(c)。
28.如权利要求20所述的处理，其特征在于，所述细胞颗粒包含白细胞、有核红细胞、 血小板、巨血小板、血小板凝块、未溶解的红细胞或者细胞碎屑。
全文摘要
提供一种用于校正对血液分析仪上的血液样品的血红蛋白测量的颗粒干扰的方法。该方法包括将血液样品的等分试样与溶解试剂混合以使红细胞溶解，并且形成样品混合物；以在样品混合物中形成的血红蛋白色原的预定波长，测量样品混合物的吸光度，并且使用获得的吸光度获得血液样品的表观血红蛋白浓度；测量保留在样品混合物中的细胞颗粒的浓度和大小；使用细胞颗粒的浓度和大小，去除细胞颗粒对表观血红蛋白浓度的影响，以便获得血液样品的校正的血红蛋白浓度；以及报告血液样品的校正的血红蛋白浓度。
文档编号G01N33/72GK102282467SQ200980154480
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月11日 优先权日2008年11月13日
发明者埃里克·M·格雷斯, 张舒良, 李静, 特德·W·布里顿, 郑敏, 陆久留, 马里察·拉维恩 申请人:贝克曼考尔特公司