专利名称：一种转Bt基因作物抗性的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及农林科学中的一种分析测试方法，确切地说是一种转Bt基因作物抗性的快速检测方法。
背景技术：
转Bt基因作物是有效防治作物虫害的有效途径之一，而且有利于保护环境，维护生态平衡。目前，转Bt基因棉花(抗虫棉)已大规模种植，至1999年，全国累计推广种植抗虫棉达238万亩(贾士荣，郭三堆，安道昌，2001转基因棉花北京；科学出版社)。已研制成功或正在研制的转Bt基因作物和植物有水稻、玉米、杨树等。
转Bt基因作物抗性的检测是转Bt基因作物的研究、选育和种子生产的重要环节，对保证种质纯度有重要意义。国内外已对转Bt基因棉的抗性鉴定方法进行了大量的研究，提出了用ELISA法检测转Bt基因棉中Bt毒蛋白的含量(Benedict J H.Fieldperformance of cottons expressing transgenic Cry IA insecticidal proteins for resistance toHelicowerpa zea(Lepidoptera；Noctuidae)[C].J.Econ.Entomol.，1996，89230-238；Sachs ES，Benedict J H，Stelly D M，et al.Expression and segregation of genes encoding Cry IAinsecticidal proteins in cotton[J].Crop Sci.，1998，38(1)1-11；陈松，吴敬音，程德荣，等。转Br基因棉Bt毒蛋白的ELISA检测方法研究(英文)[J]。棉花学报，1999，11(5)259-267)，应用标记基因法检测转Bt基因棉的纯度(SUN Jing，TANG Can-ming，YUAN Xiao-ling，etal.Selection technique for transgenic Bt cotton using Kanamycin as an indirect identifyicationmarker[J].Acta Gossypii Sinica，2000，12(5)270-276；王坤波，张香娣，刘方等，子叶期卡那霉素快速鉴定转基因棉花[J].中国棉花，2000，27(12)20-21；祝建波，王爱英，吴刚等，转基因棉花的田间筛选技术研究[J]，棉花学报，2000，12(5)230-233；马丽华，许红霞，胡育昌，转Bt基因棉卡那霉素田间快速检测法[J]，中国棉花，2000，27(2)11-12)，以及采用田间自然发虫、网室接虫和室内生物测定(郭香墨，转Bt基因抗虫棉育种策略与效果[J]，棉花学报，1997，9(5)230-235；董双林，文绍贵，王月恒，棉铃虫幼虫对转基因棉的存活、生长及危害的影响[J]，棉花学报，1997，9(4)176-182；杨雪梅，王武刚，郭予元等，转Bt基因棉花抗棉铃虫的鉴定技术及其应用[J]，植物保护，1997，23(4)3-5；曹美莲，刘惠民，许琦等，Bt棉抗铃虫鉴定技术及抗虫性指标划分初探，中国棉花，1998，25(1)20-21)等方法进行转Bt基因棉抗虫性的鉴定。但这些方法都存在检测周期长，操作复杂等局限性。

发明内容
转Bt基因作物的抗性是由转移至作物中的Bt基因所表达的毒蛋白产生的，本检测就是检测Bt毒蛋白，使用免疫金斑点法。本检测方法包括试液和试样的制备，所述的试液是用胶体金溶液标记的免抗Bt毒蛋白多克隆抗体溶液，所述的试样是将待测样品点布在硝酸纤维素膜上、经洗涤、封闭处理后得到试样。测试时将试样置于试剂溶液中，25～35min后取出，试样未出现紫红色斑点者为阴性结果，表示Bt基因未转移至作物中；或者虽然转移，但未表达毒蛋白；出现紫红色斑点者为阳性结果，表示Bt基因已转移至作物中并表达了毒蛋白。
利用免疫斑点金染色法鉴定转Bt基因作物的抗性，操作十分简便，检测灵敏度高，检测周期很短，适合基层单位，个人及野外操作。可用于检测转Bt基因棉花，转Bt基因水稻，转Bt基因玉米，转Bt基因杨树等转Bt基因作物、植物的抗性。
具体实施例方式
(一)、试剂溶液的制备1、兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体的制备取Bacillus thuringiensis vari.Kurstaki HD-73进行培养，然后提取Bt前毒素蛋白，用胰蛋白酶水解，经Sephadex G-100凝胶过滤柱层析分离得电泳纯Bt毒蛋白。将Bt毒蛋白注入家兔体内，自兔抗血清中提取，分离得到兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体。
2、胶体金标记兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体的制备取四氯金酸制备胶体金溶液，pH7.2～7.5，金颗粒大小20～30nm。将兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体加入胶体金溶液中，混合均匀，即得金标兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体溶液。经纯化及浓缩，用稀释液稀释4倍后备用。
(二)、试样的制备1、待测样品的制备(以转Bt基因棉花为例)
取转Bt基因棉花苗期嫩叶3～5片，粉碎后置于0.05M、pH9.5的碳酸缓冲液中，搅拌均匀后，离心分离，取其上清液。
2、试样的制备取硝酸纤维素膜(Millpore产品，孔径为0.45μm)，在其上用铅笔划出0.8cm见方的格子若干，在格子中央点待测样品1μl，自然晾干后用0.01M pH7.2的PBS洗涤，再将硝酸纤维素膜(NC膜)置于封闭液中，室温孵育30min，最后分别用蒸馏水和0.01MpH7.2的PBS洗涤数次。
(三)、检测将硝酸纤维素膜(NC膜)试样浸泡于金标抗体溶液中，置于室温孵育30min，观察结果出现紫红色斑点为阳性结果，反之为阴性结果。
权利要求
1.一种转Bt基因作物抗性的快速检测方法，包括试液和试样的制备，其特征在于所述的试液是用pH7.2～7.5、20～30nm胶体金溶液标记的兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体溶液；所述的试样是将待测样品点布在硝酸纤维素膜上，经洗涤、封闭处理后得到的试样；将试样浸泡于试液中，25～35min后取出，试样上未出现紫红色斑点者为阴性结果。
全文摘要
本发明提供了一种转Bt基因作物抗性鉴定的方法，该方法利用免疫斑点金染色法鉴定转Bt基因的作物抗性。该方法是在先硝酸纤维素膜上包被待测样品，经洗涤封闭后置于金标抗体溶液中浸泡30min后即可见检测结果。出现紫红色斑点为阳性结果，反之为阴性结果。其中金标抗体溶液是20～30nm的胶体金溶液同由从HD－73菌种中分离纯化的Bt毒蛋白制备的兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体反应制成。本发明操作极其简便，检测周期非常短，特别适合基层部门及野外作业。
文档编号G01N33/544GK1700003SQ20051004054
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者王清, 魏梅生, 吴振廷, 林华峰 申请人:安徽农业大学