专利名称：一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法
技术领域：
本发明提供一种检测农药克百威残留的免疫传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术：
近年来，农药残留引起的中毒事件屡屡发生，果蔬中的有害、剧毒农药的残留问题一直是人们关注的焦点，也是现今中国加入WTO后，农产品出口遭遇“绿色壁垒”的主要影响因素之一。克百威是氨基甲酸酯类杀虫剂主要品种之一，它作为一种光谱杀虫剂被广泛应用于当今农业中。该药剂具有内吸性，能通过根、茎、叶或种子吸收传导，并输送到植物体的各器官，也能通过径流渗透污染地下水。研究发现克百威的代谢物可引起细胞强烈的DNA单链断裂，具有明显的细胞毒性。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象。具有这样高毒性的农药残留超标的果蔬流入市场，必将会对人们健康造成严重危害，因此建立一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法迫在眉睫。传统的用于检测克百威残留的分析方法有气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫(ELISA)等，这些传统的方法虽然具有高选择性和灵敏度，但其受到样品前处理耗时、仪器设备昂贵、操作人员技术要求高、检测时间长等诸多因素的限制，只能局限于实验室操作，不能满足果蔬现场速测的要求。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器，与传统的分析方法相比，它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。而免疫传感器的制备过程中，增大电流的响应、抗原/抗体的固定化并保持其良好的生物活性以及空间排布是制约传感器制备的关键步骤，这些将直接影响免疫传感器的稳定性、重现性、灵敏度和选择性等主要性能。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药克百威残留的电流型免疫传感器的制备方法。其技术方案为一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于电流型免疫传感器的组装过程为自组装4’ 4-硫代联苯硫酚(DMDPSE)、电沉积纳米金(DpAu),重复第一步和第二步2遍,构建稳定的金硫体系,然后固定克百威单克隆抗体,最后用BSA封闭电流型免疫传感器制备结束，放入冰箱里4°C保存备用。所述的一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于实验条件的优化，主要包括电沉积纳米金的层数、测试底液的PH以及孵育时间；所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为％ Λ I = 16.676 + 8.7332 IgC (ng/mL);免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品回收率的测定。其制备原理为本发明采用4’ 4-硫代联苯硫酚、电沉积纳米金对金电极进行修饰，与传统的方法相比，采用4’ 4-硫代联苯硫酚两端的巯基以及其刚性结构，巯基一端通过金硫键连接裸金电极，巯基另一端通过金硫键连接电沉积的纳米金，并通过层层自组装的方法，构建了一种具有闻稳定性、闻度有序的金硫(Au-S)体系。由于纳米金较闻的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大免疫传感器的响应电流；与传统的滴涂纳米金胶的方法相比，电沉积的纳米金在电极表面具有更好的稳定性、均匀性，并且沉积过程简单、省时、可控。电沉积的纳米金为抗体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了抗体的生物活性以用来和农药有效的特异性结合。通过层层自组装，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。将经过上述步骤修饰过的金电极制成免疫传感器后，检测农药克百威的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的电流型免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药克百威残留的快速测定，直接对克百威农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。为达到以上目的，采取以下技术方案实现一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于(1)配置一系列的克百威标准液，用以得出上述制备的电流型免疫传感器的工作曲线、检测范围和检测限；⑵配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备电流型免疫传感器的选择性；[31通过循环伏安扫描多段验证上述免疫传感器的稳定性，通过解离抗原抗体免疫复合物和再次免疫检测其再生性能;(4丨通过检测实际蔬菜样品得出免疫传感器的加标回收率。本发明采用刚性双巯基物质4’ 4-硫代联苯硫酚、电沉积纳米金进行电极表面自组装修饰，与传统的自组装纳米金胶的方法相比增大了其稳定性、固定量，形成的金硫体系具有较高的稳定性和高度有序性，增大了传感器的电流响应并提高了传感器表面抗体的有效固定，从而增大了检测精度。所述电流型免疫传感器的制备工艺如下⑴将预处理好的金电极浸入通氮除氧的2.0 mM 4’4_硫代联苯硫酚的乙醇溶液中避光组装24h，并用氮气吹干。在5mL O. 3mM的含有O.1M氯化钾的氯金酸溶液中，在-O. 2V的电压下应用恒电位法电沉积200s。电沉积结束后用PH=7. 5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干。⑵重复步骤一和步骤二 η遍I I将上述制备好的电极浸于克百威单克隆抗体溶液中，4°C条件下浸泡12h，取出后冲去多余部分，晾干待用；四最后将上述制备好的电极最后`浸入2. 5%的BSA溶液中室温下静置lh，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。
具体实施例方式实施例⑴裸金电极的清洗所述裸金电极修饰前，首先用O. 3 μ m、50nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6M的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气吹干；[2]裸金电极的活化彻底洗涤后，电极在O. 5M H2SO4溶液中用循环伏安法进行活化，扫描范围-O. 3 1. 5V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。[3]将预处理好的金电极浸入通氮除氧的2. O mM 4’4-硫代联苯硫酚的乙醇溶液中避光组装24h (记作DMDPSE/Au)，取出电极，用无水乙醇冲洗电极表面以去除没有吸附上的4’ 4-硫代联苯硫酚，并用氮气吹干。[4)在5mL O. 3mM的含有O.1M氯化钾的氯金酸溶液中，在-O. 2V的电压下应用恒电位法电沉积200s(记作DpAu/DMDPSE/Au)，电沉积结束后用PH=7. 5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干。丨5丨重复步骤一和步骤二 2遍(记作{DpAu/DMDPSE}2/Au),l6l将上述制备好的电极浸于克百威单克隆抗体溶液中，4°C条件下浸泡8h，取出后冲去多余部分，晾干待用；[7)最后将上述制备好的电极最后浸入1%的BSA溶液中室温下静置2h，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器制作完成(记作BSA/ant1-carbofuran/ { DpAu/DMDPSE }n/Au),保存在4°C条件下备用JGI从电沉积纳米金修饰层数、pH和孵育时间三方面对所制备的免疫传感器的实验条件进行优化，纳米金的修饰层数为1-3，pH的范围为5. 0-9. 0，孵育时间的范围为10-70min。Hl配置O. 1-1.0X106 ng/mL的克百威标准溶液，将上述制备好的电流型免疫传感器分别浸入不同浓度的克百威标准溶液，在常温下孵育30min，检测免疫前后电流变化得到其工作曲线Illll将电流型免疫传感器分别在1. O X IO3 ng/mL常混合使用的农药溶液中常温下孵育40min，以检测其选择性；选六根制备好的免疫传感器检测其重现性；连续7天依次检测相同浓度的克百威溶液以检测其稳定性；将免疫后的传这器用甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.8)解离克百威农药5min后再次免疫，检测其再生能力III丨把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置24h后，用PBS (pH 7. 5)做溶剂超声处理30min(换溶剂三次)，以检测实际样品的回收率。此种免疫传感器检测农药克百威残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力好和回收率符合要求，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
权利要求
1.一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于电流型免疫传感器的组状过程为自组装4’4-硫代联苯硫酚、电沉积纳米金，重复第一步和第二步2遍，自组装克百威单克隆抗体，自组装BSA封闭。
2.如权利要求1所述的一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于利用纳米金良好的导电性、大的比表面积和生物相容性用于改善电极性能和吸附蛋白A，利用蛋白A可以和抗体的Fe端特异性结合来定向固定抗体，以更有效的完成目标成分克百威的免疫检测。
3.如权利要求1所述的一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，免疫传感器的修饰及表征过程，有关实验参数的优化，所制备的免疫传感器的工作曲线为克百威浓度O. l-106ng/mL时，检测克百威农药的工作曲线为％ΛΙ = 16.676 + 8.7332 IgC (ng/mL)，检测限为O. 06ng/mL。
全文摘要
本发明涉及一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于自组装4’4-硫代联苯硫酚、电沉积纳米金，重复第一步和第二步2遍，与传统的方法相比，采用4’4-硫代联苯硫酚两端的巯基以及其刚性结构，巯基一端通过金硫键连接裸金电极，巯基另一端通过金硫键连接电沉积的纳米金，并通过层层自组装的方法，构建了一种具有高稳定性、高度有序的金硫体系。由于纳米金较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性；通过层层自组装，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量，从而使制备的电流型免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力好和回收率符合要求。
文档编号G01N27/327GK103063842SQ20131000066
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者孙霞, 朱盈, 王相友, 刘君峰, 翟晨 申请人:山东理工大学