专利名称：一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒及其制备方法，特别是小粒径的 勻相溶胶颗粒型胱抑素C免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制 剂(cysteine proteinase inhibitor，CPI)，后被命名为胱抑素 C (CysC)。胱抑素 C 是一 种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为Y-微量蛋白及Y-后球蛋白，属非糖基化的碱性蛋白 质，分子量约为13KD，几乎所有的有核细胞均能产生，经由肾小球滤过并几乎全部被近曲小 管重吸收和分解，产生率多处在相对衡定状态。胱抑素C是一种比较接近理想的反映肾小 球率过滤的内源性标志物，研究表明该物质不受生理、性别、年龄、炎症等因素影响，体内含 量恒定，能早期敏感提示肾功能损害，是近几年新发现用来诊断肾脏疾病的一个理想指标。研究资料已表明，胱抑素C较血清BUN、Cr有更高的敏感性和特异性，对于评价肾 小球滤过率有非常重要的价值。目前对于胱抑素C的检测方法比较常用的有颗粒增强免疫 比浊法和勻相溶胶颗粒型免疫测定法。由于颗粒增强免疫比浊法测定时间短，而且可以在 自动生化分析仪上进行，所以成为胱抑素C检测的常规应用技术，但是上述方法反应后会 产生沉淀，不利于生化仪的清洗。而后者不仅具有前者的那些优点，也不会产生沉淀，所以 在胱抑素C的常规临床应用中可以优先选择勻相溶胶颗粒型免疫测定法。目前该技术已趋 于成熟，而且操作简便，干扰因素少，对各种疾病的诊断及病情观察具有重要的临床意勻相溶胶颗粒型免疫测定法的基本原理是采用标记了抗胱抑素C抗体的胶体 金，与待测标本中的胱抑素C发生凝聚反应使胶体金颜色发生变化，用540nm检测这种变 化，以胱抑素C标准品的标准曲线测出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。

发明内容
本发明要解决的问题是建立一种小粒径勻相溶胶颗粒型胱抑素C检测试剂盒，提 供一种特异性的高稳定性的勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，可以测定0. 027mg/L的胱抑 素C含量。另外，本发明的目的还在于提供使用本发明勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒测 定胱抑素C含量的方法。为了解决上述问题，本发明采用^-32nm胶体金颗粒标记于抗胱抑素C抗体，通过 勻相溶胶颗粒免疫测定法检测血清或血浆中胱抑素C含量。采用开瓶稳定性实验检测了该 试剂盒与国际知名企业相关产品的的稳定性差异。本发明提供以下的技术方案。1.根据权利要求1-3记载的一种小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其用于 测定胱抑素C的含量，该试剂盒包含试剂Rl和试剂R2以及胱抑素C标准品，试剂Rl和试 剂R2的体积比为4 1，所述试剂Rl为含有多聚物的缓冲溶液，所述试剂R2为结合有抗人胱抑素C抗体的胶体金的缓冲溶液，其中胶体金颗粒的直径为^-32nm。2.根据权利要求4-5记载的小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在 于，我们利用开瓶实验检测了本发明和某国际知名品牌试剂盒的稳定性相比较为优。我们使用本发明的方法灵敏度高，能够检测极低水平(约0. 027mg/L)的胱抑素C， 具有很高的临床实用价值。另外，本发明的试剂盒为液体双试剂，因此具有特异性好，灵敏 度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，可用于检测血清或血浆中胱抑素C的浓度，适用于 临床全自动生化分析仪。


图1显示6种不同含量的胱抑素C参考标准的标准曲线，每个点代表不同含量的 胱抑素C参考标准，其中，X轴表示胱抑素C的含量，y轴表示吸光度。图2显示本发明的试剂和对照试剂(某国际知名公司胱抑素C试剂盒)的相关性。 图中的X、Y轴均为测定值(胱抑素C含量mg/L)。
具体实施例方式实施例1一种小粒径勻相溶胶颗粒型胱抑素C测定试剂盒及其制备方法。1.本发明试剂Rl的配制按照常规方法进行制备。2.本发明试剂R2的配制I.胶体金溶液的制备(1)用超纯水配制氯金酸和10%柠檬酸三钠；(2)超纯水配制万分之四氯金酸500ml (20ml 氯金酸加480ml超纯水)；(3)加热搅拌至微沸，快速加入与氯金酸质量比为1. 2 1的柠檬酸三钠(即細1 10%柠檬酸三钠)；(5)加热搅拌至颜色变为酒红色，继续加热搅拌5-8min后停止；(6)用紫外分光光度计检测500nm-560nm处的吸光度值，根据吸光度值分析出波 峰的位置，以此大致确定金颗粒的粒径。II.抗体标记(以标记IOOml胶体金为例)(1) IOOml胶体金加IOml 0. IM ρΗ8· 4硼酸盐缓冲液再加2mg lmg/ml CysC多抗， 混勻放置30min ；(2)加 IOml 10% BSA，混勻放置 30min ；(3) 1 IOOOrpm 离心 30min ；(4)去上清，用含 0. 4 % PEG8000 的 Tris 缓冲液(10mM/L，PH7. 5)重悬，离心 30min ；(5)同上重复洗涤两次；(6)用上述缓冲液复溶至30ml。实施例2工作曲线测定本发明的用量本发明试剂Rl和本发明试剂R2用量分别为160ul和40ul，样本用量为2ul。本发明采用终点法进行测定160ul Rl加入2ul样本，于37°C 5min后加入40ul 试剂R2，即开始读点，反应5min后再次读点，得到吸光度差值。制作本发明的标准曲线采用本发明的标准品(选择6点校准，校准品胱抑素C含 量分别为0. 0,0. 5,1. 0,2. 0,4. 0,8. Omg/ml)，使用迈瑞BS300全自动生化仪，检测主波长为 546nm,副波长为660nm ；按照上述测定步骤测得本发明胱抑素C标准品的标准曲线(如图1所示)。图1 中曲线上的每个点代表一个含量的标准品。其中X轴表示胱抑素C的含量，y轴表示吸光度。实施例3准确性、精密度测定利用中国九强公司提供的质控品，选取了两个浓度(较低和较高浓度)，用本发明 的试剂盒进行测定，结果如下表。表 权利要求
1.一种小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其用于测定胱抑素C的含量。
2.根据权利要求1记载的小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，它是 基于免疫胶体金法定量检测样本中胱抑素C含量的试剂盒。
3.根据权利要求1记载的小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，其中 胶体金颗粒直径为26-32nm。
4.根据权利要求1记载的小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，该试 剂盒性能比国际上知名的勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒较优。
5.根据权利要求4记载的小粒径勻相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，该试 剂盒的优异性能包括但不限于试剂盒的稳定性等。
全文摘要
本发明提供一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫测定试剂盒及其制备方法。使用本发明的试剂盒能检测血清或血浆中胱抑素C的含量。所述的匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫测定试剂盒，其胶体金颗粒直径为26-32nm。本发明的试剂盒具有高灵敏度及高稳定性的特点。
文档编号G01N33/68GK102147413SQ201010583920
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者华权高, 周*, 沈鹤霄, 许可 申请人:武汉生之源生物科技有限公司