专利名称：一种降钙素原测试试剂盒及其测试方法
技术领域：
本发明涉及测定血清或血浆的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清或血浆中降钙素原含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术：
降钙素原(Procalcitonin，简称PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量为13kDa的糖蛋白，是血清降钙素(CT)的前体物，在人体内半衰期约为20-24小时，稳定性好。正常条件下，PCT在甲状腺C细胞中生成并裂解成降钙素，人血清PCT含量极低，约2.5pg/ml，在一些甲状腺损伤如由细菌感染引起的全身炎症反应、败血症或脓毒性休克、慢性肾衰等患者血清PCT及其组分均显著升高，血清PCT的可能的来源的生物学机制靶细胞(PBMC)等在LPS血类败血症相关因子作用下，应急分泌PCT，这种应急分泌超过细胞后转换过程(由PCT分解为CT)或后转换过程缺少必需的水解酶，从而导致实验室观察到的PCT成倍增长，而CT水平不变或稍增高；PCT作为一种新的、具有创新意义的严重细菌感染等疾病的实验指标，PCT提高了临床诊断的准确性，为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了极其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据；PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种降钙素原的测试试剂盒，采用该试剂盒进行PCT检测具备较高的灵敏度和特异性。
本发明的另一目的在于提供降钙素原的测试方法，该方法简单、精密度高。
为实现上述目的，本发明提供一种降钙素原测试试剂盒，其包含的试剂有分离试剂、发光标记物、荧光素标记物。
所述的分离试剂是纳米免疫磁性微珠。
所述的纳米免疫磁性微珠是包被羊抗FITC多克隆抗体，其里面包覆有Fe3O4或γ-Fe2O3，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基团的微珠。
所述的发光标记物是抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物。
所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI或ABEN。
所述的试剂盒还包括标准液、质控液和浓缩洗液。
所述的荧光素标记物是抗PCT单克隆抗体标记FITC。
本发明还提供一种降钙素原的测试方法，包括下列步骤(1)将标本、标准液、质控液与异鲁米诺衍生物标记的单克隆抗体，FITC标记的单克隆抗体，混匀孵育；(2)加入包被羊抗FITC抗体的纳米免疫磁性微珠，孵育；(3)外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物；(4)将所得试剂盒放入样品测量室，泵入发光底物，监测发出的相对光强度；(5)根据PCT浓度与RLU成一定的比例关系，得出PCT浓度。
所述的发光底物的主要成分是NaOH和H2O2。
与现有技术相比，本发明所带来的有效果是本发明所采用的试剂盒及测试方法与细菌感染的传统诊断指标如白细胞计数(WBC)、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、细菌培养等相比较，本发明的PCT测试试剂盒及其检测方法具备较高的灵敏度和特异性，PCT在细菌感染特别是脓毒症方面的诊断的特异性优于传统诊断指标，测试方法简单、准确率高；本发明所述的PCT检测具有如下技术特点1)疾病的早期诊断PCT通常在疾病发生的2-6小时内就升高，并可以检测到。
2)与病情发展呈正相关随着病情严重程度增加，血浆PCT浓度明显增高。PCT对严重脓毒症和脓毒性休克的诊断特异性明显高于CRP、WBC等等指标，特异性高达100％，这说明血浆PCT含量测定是多器官功能衰竭综合症(MODS)发生的预警指标。
3)疗效观察与疾病预后PCT水平下降表明炎性反应的降低及感染灶的清除，提示良好的预后。
4)PCT是一种用于诊断和监控严重细菌感染及脓毒血症、败血症等疾病的理想指标。
5)PCT优于其它现存的用于诊断细菌感染的指标(CRP和细胞因子等)。
6)PCT在脓毒血症、败血症患者其浓度显著增高，可达1000ng/ml，是正常人的2000倍。
7)PCT与炎症的严重程度高度相关，在SIRS/脓毒血症、败血症/严重脓毒血症/脓毒性休克病人的浓度有明显差异。
8)PCT可在感染后2个小时后检测到，对临床早期诊断具有重要意义。
9)PCT在感染后12-24小时达到高峰，体内、外稳定性好。
10)PCT在炎症消失后恢复正常、PCT-与局部感染无关，与病毒感染无关、PCT-不受外伤影响(多创伤或手术创伤)、PCT-不受慢性炎症或自动免疫疾病的影响、PCT不受临床用药影响(OKT3除外)。
具体实施例方式
本发明中分析测试方法所用的分析仪是，包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查讯等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线，所采用的系统是Maglumi系统。
本发明所述的纳米免疫磁性微珠溶液是包被羊抗FITC多克隆抗体，其表面基团的含量是0.05-0.5eqm/g，其保存时是溶于0.6％(W/V)TRIS缓冲液，所述的TRIS缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷，其中还加入0.2％NaN3作为防腐剂。所述的FITC是异硫氰酸荧光磺的简称。
所述的发光标记物异鲁米诺衍生物是抗PCT单克隆抗体标记ABEI、AHEI或ABEN，其保存于含牛血清蛋白中，加入0.2％NaN3的作为防腐剂。本发明所述的所述的异鲁米诺衍生物的结构式是 其中R1可以是C2H5、C3H7或C4H9，R2可以是NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10。
所述的荧光素标记物是抗PCT单克隆抗体标记FITC，其溶于含牛血清蛋白中保存，加入0.2％NaN3作为防腐剂。
所述的标准品和质控液是人血清制品或冻干人血清制品，加入0.2％NaN3作为防腐剂。
所述的浓缩洗液采用TRIS缓冲液，置室温保存。
PCT测试的标准参考范围如下

实施例1本发明的实施例提供一种降钙素原测试试剂盒，其包含的试剂有分离试剂、发光标记物、荧光素标记物。
本发明的实施例所述的分离试剂是纳米免疫磁性微珠，其是里面包覆有Fe3O4包被羊抗FITC多克隆抗体，表面含有-OH活性基团的微珠，所述的发光标记物是抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物，所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI，所述的试剂盒还包括有标准液、质控液和浓缩洗液，所述的荧光素标记物是抗PCT单克隆抗体标记FITC。
本实施例的测试方法是首先针对PCT的一株单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物，本实例的异鲁米诺衍生物采用ABEI，另一株标记FITC。
(1)取标准品、标本各加20μl，然后加发光物标记抗体20μl，再加荧光素标记抗体20μl，混匀，37℃水浴15分钟，形成“夹心三明治”；(2)加磁分离试剂包被羊抗FITC抗体的纳米免疫磁性微珠，40μl，混匀，37℃孵育5分钟；
(3)上磁分离器分离4分钟，倒去上清，用洗液清洗沉淀复合物；(4)加应用洗涤液400μl，混匀，上磁分离器分离4分钟，倒去上清；(5)重复一次步骤(4)；(6)直接进入样品测量室，仪器自动泵入发光底物1和2，自动监测3秒钟内发出的相对光强度(RLU)，PCT浓度与RLU成一定的比例关系，仪器自动拟合计算PCT浓度。
发光底物1是NaOH，发光底物2是H2O2。底物安装前，用干净二次水对泵1、泵2清洗10-20遍，移开二次水，排空管道内的二次水，将相应的底物直接放入仪器内，仔细清洗双手后，将泵管直接放入底物瓶内；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1500。若超过1500，需重新用二次水对管道和注射泵进行更多次清洗，直至空白值降至正常范围内。如果超过三天不做实验，需移开底物，并盖上瓶盖，以防蒸发。随后用二次水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀注射泵。
本实施例采用6个标准品进行曲线测试，所述的方法中所采用的仪器得到的一条定标曲线，自动地计算每一个样本的PCT浓度，测试结果如下表所示，单位以ng/ml表示。


根据上表，其测试结果的说明如下

本发明的性能特征如下1、准确率准确率实验是加纯PCT至已知量的标本中，测定加入前后的PCT值，再计算所加PCT的回收率，下表给出在血清样本中加入不同量的PCT得到的回收率的例子。

2、精密度选取三个样本，根据本实施例的方法一次实验中重复20次；在20次实验中测定其结果，分别计算其平均偏差C.V.值％，结果如下

根据上表可知，C.V.值％在产品标准范围内。
3、分析灵敏度分析灵敏度的定义为对20次零标准品的测定，求其2倍的平均偏差，其从标准曲线上所对应的浓度即是分析灵敏度.该试剂盒的分析灵敏度为＜0.05ng/ml。
4、特异性任何与CT的交叉反应均在生理学允许的浓度范围内。
5、相关性
X＝Maglumi，Y＝RIAY＝1.24X-2.9R＝0.953X为Maglumi系统测定结果，Y为放免测定结果实施例2本发明的实施例提供一种降钙素原测试试剂盒，其包含的试剂有纳米免疫磁性微珠、发光标记物、荧光素标记物。
本发明的实施例所述的分离试剂是纳米免疫磁性微珠，其是里面包覆有γ-Fe2O3包被羊抗FITC多克隆抗体，表面含有-OH活性基团的微珠，所述的发光标记物是抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物AHEI，所述的试剂盒还包括标准液、质控液和浓缩洗液，所述的荧光素标记物是抗PCT单克隆抗体标记FITC。
本实施例的方法是首先针对PCT的一株单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物，本实例的异鲁米诺衍生物采用ABEI，另一株标记FITC。
(1)将标本、标准液、质控液与异鲁米诺衍生物AHEI标记的单克隆抗体，FITC标记的单克隆抗体各20μl，混匀37℃水浴15分钟，形成“夹心三明治”；(2)加入包被羊抗FITC抗体的纳米免疫磁性微珠40μl，37℃孵育5分钟；(3)外加磁场沉淀，即上磁分离仪进行分离4分钟，倒去上清，用洗液清洗沉淀复合物；(4)加应用洗涤液400μl，混匀，上磁分离器分离4分钟，倒去上清，(5)再重复一次(4)步骤的操作；(6)将所得试剂盒放入样品测量室，自动泵入发光底物1和2，监测发出的相对光强度RLU；根据PCT浓度与RLU成一定的比例关系，仪器自动拟合计算PCT浓度，PCT浓度与RLU成一定的比例关系。
本实施例所述的方法所采用的发光底物1是NaOH，发光底物2 H2O2。
本实施例采用所述的试剂盒及其测试方法所得到的结果与实施例1相同。
权利要求
1.一种降钙素原测试试剂盒，其包含的试剂有分离试剂、发光标记物、荧光素标记物。
2.根据权利要求1所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的分离试剂是纳米免疫磁性微珠。
3.根据权利要求2所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的纳米免疫磁性微珠是包被羊抗FITC多克隆抗体，其里面包覆有Fe3O4或γ-Fe2O3，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基团的微珠。
4.根据权利要求1-3之一所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的发光标记物是抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物。
5.根据权利要求4所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI或ABEN。
6.根据权利要求1-3之一所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括标准液、质控液和浓缩洗液。
7.根据权利要求1-3之一所述的降钙素原测试试剂盒，其特征在于所述的荧光素标记物是抗PCT单克隆抗体标记FITC。
8.一种降钙素原的测试方法，包括下列步骤(1)将标本、标准液、质控液与异鲁米诺衍生物标记的单克隆抗体，FITC标记的单克隆抗体，混匀孵育；(2)加入包被羊抗FITC抗体的纳米免疫磁性微珠，孵育；(3)外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物；(4)将所得试剂盒放入样品测量室，泵入发光底物，监测发出的相对光强度RLU；(5)根据PCT浓度与相对光强度RLU成一定的比例关系，得出PCT浓度。
9.根据权利要求8所述的降钙素原的测试方法，其特征在于所述的发光底物的主要成分是NaOH和H2O2。
全文摘要
本发明涉及一种降钙素原测试试剂盒，其包含的试剂有分离试剂、发光标记物、荧光素标记物，本发明还涉及一种采用所述的试剂盒测试降钙素原的方法，该方法采用纳米免疫磁性微珠进行作为分离试剂，发光标记物采用抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物，采用本发明所述的PCT试剂盒及其测试方法，其PCT检测具备较高的灵敏度和特异性，PCT在细菌感染特别是脓毒症方面的诊断的特异性优于传统诊断指标。
文档编号G01N21/76GK101029897SQ200710073309
公开日2007年9月5日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者饶微, 宋洪涛, 李婷华, 邵佳, 阎颖, 刘海燕 申请人:深圳市新产业生物医学工程有限公司