专利名称：毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及利用毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，属于医学检测领域。
背景技术：
肾病是目前临床最常见的病症之一。肾小球或肾小管病变时都可出现蛋白尿，尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分蛋白类型，可在无损伤的情况下，协助临床判断损伤的部位。尿蛋白电泳主要用来区分蛋白尿的类型，如肾小球性蛋白尿、肾小管性蛋白尿及溢出性蛋白尿，有助于查明肾病综合征的病因，从而进行针对性的治疗。尿蛋白电泳后出现中、高分子量蛋白带，主要反映肾小球病变；出现低分子量蛋白带，常见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，表示肾小球及肾小管均受累及。
目前用于尿蛋白分离检测的常规方法主要有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳(SDS-AGE)，如Marshall等人曾用SDS-PAGE方法检测尿液(Marshall T，et al.Clin Chem.1993，39(11)2314-2318)，先向样品里加入SDS及巯基乙醇，95℃变性10分钟，电泳3-4小时，进行固定、染色及脱色，然后再扫描得到检测结果，因此SDS-PAGE方法的操作非常繁琐；SDS-AGE方法则依赖昂贵的仪器和试剂，检测成本很高，如法国Sebia公司生产的电泳仪，仪器价格昂贵，另外，需要配套的试剂盒，因此这些因素大大限制了其应用(Le Bricon T，et al.ClinChem.1998，441191-1197.)发明内容本发明的目的在于提供一种毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，是一种快速低成本的检测尿蛋白的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的首先通过微加工工艺制作石英介质的毛细管电泳芯片(有关芯片的制作方法已以“电泳微芯片的制作方法”名称提出了发明专利申请，申请号为02110584.7)，然后在管道中充入筛分介质，并在加样池中加入检测样品，最后将加样后的毛细管电泳芯片，置于光学检测平台上，各池中插入相应电极，施加适当时序和幅值的电压进行分离检测。
与常规尿蛋白分离检测技术相比，利用毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白具有样品和试剂消耗量少，分离检测速度快，检测成本低，检测装置易于实现微型化、集成化和自动化等优势。
具体的检测方法1尿蛋白样品收集与处理按常规方法进行样品收集、过滤与浓缩；并用电泳缓冲液按一定比例进行稀释，使蛋白终浓度为0.5mg/ml-5mg/ml。
2电泳缓冲液本方法中所用电泳缓冲液为极端缓冲液，即自行配制的PH9.5-10.5、75mM的硼酸缓冲液，经0.22um的滤膜过滤。
3毛细管电泳芯片本方法中所用芯片为未涂层芯片，芯片管道内径50-100μm，进样、分离管道分别长2-4cm和5-10cm。
在PH9.5-10.5、75mM的硼酸缓冲液中，石英玻璃毛细管表面因硅羟基解离会产生负的定域电荷，其结果是产生指向负极的电渗流。管道中蛋白分子的迁移速度是外加电场、溶剂阻力与电渗流作用的综合结果。由于电渗流的作用通常大于粒子所受电场力作用，所以样品中粒子在管道进行与电渗流方向一致的差速迁移。通过在通道末端安装上一种检测器，将各分离组分通过检测窗口的情况记录下来，就得到电泳谱图。
4 电泳检测将尿蛋白检测样品3-4ul加在毛细管电泳芯片的加样孔中，在其余三个孔里(缓冲液池、废液池1、废液池2)及各管道里加入硼酸缓冲液。进样电压500-600V，进样10s，然后停止加压；在分离管道加分离电压2000-3000V，分离2min，通过检测系统的信号收集、自动化处理及分析，即可得到相应的检测结果。进样通道和分解通道交叉或“十”字型，交叉处为样品进样口，检测窗口在废液池端的上面。
5 将微型分析系统检测结果与相应的临床资料结合分析，进一步确定检测结果。


图1为毛细管电泳芯片电压施加模式图，左图为进样电压模式，右图为分离电压模式，图中，A端为样品池，B端为样品废液池，C端为缓冲液池，D端为废液池；进样通道(AB通道)与分离通道(CD通道)交叉成“十”字型，交叉处为样品进样口(加样孔)，检测窗口设在D端上1cm处。
图2为多发性骨髓瘤病人的尿液样品的检测结果，在该类病人尿液中检测到大量免疫球蛋白及白蛋白；图3为肾病综合症病人的尿液样品的检测结果，在该类病人尿液中检测到大量白蛋白和及少量球蛋白；
具体实施例方式
实施例1毛细管电泳芯片分析多发性骨髓瘤病人的尿液样品(14号样品)1 取500ul多发性骨髓瘤病人的尿液，浓缩、稀释，使蛋白终浓度为4mg/ml；2 电泳缓冲液自行配制的PH10.5、75mM的硼酸缓冲液，经0.22um的滤膜过滤。
3 毛细管电泳芯片所用芯片为未涂层芯片，芯片管道内径50μm，进样、分离管道分别长2cm和6cm。
4 电泳检测将按步骤1处理过的样品3ul加在毛细管电泳芯片的加样池里，在其余三个池里(缓冲液池、废液池1、废液池2)及管道里加入硼酸缓冲液。进样电压500V，进样10s，然后停止加压；在分离管道加分离电压2000V，分离2min，通过检测系统的信号收集、自动化处理及分析，即可得到相应的检测结果。
5 检测结果经检测，在该多发性骨髓瘤病人的尿液中有大量免疫球蛋白及白蛋白。而在正常人的尿液里是检测不到蛋白质的。经临床上其他方法的检测，证实多发性骨髓瘤病人由于骨髓瘤浸润肾脏，引起骨髓瘤肾病，导致尿液中含有大量蛋白质，主要成分为免疫球蛋白及白蛋白。
实施例2毛细管电泳芯片分析肾病综合症病人的尿液样品(16号样品)
1 取500ul肾病综合征病人的尿液，浓缩、稀释，使蛋白终浓度为4mg/ml；2 电泳缓冲液自行配制的PH10.5、75mM的硼酸缓冲液，经0.22um的滤膜过滤。
3 毛细管电泳芯片所用芯片为未涂层芯片，芯片管道内径70μm，进样、分离管道分别长2cm和5cm。
4 电泳检测将按步骤1处理过的检测样品3ul加在毛细管电泳芯片的加样池里，在其余三个池(缓冲液池、废液池1、废液池2)及管道里加入硼酸缓冲液。进样电压500V，进样10s，然后停止加压；在分离管道加分离电压2000V，分离2min，通过检测系统的信号收集、自动化处理及分析，即可得到相应的检测结果。
5 检测结果经检测，在该肾病综合症病人的尿液中有大量白蛋白及少量球蛋白，经临床上其他方法的检测，证实在肾病综合症病人体内，由于多种原因导致大量蛋白尿，尿中主要蛋白成分为白蛋白及球蛋白。
权利要求
1 一种毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，其特征在于首先通过微加工工艺制作石英介质的毛细管电泳芯片，然后在管道中冲入筛分介质，并在加样池中加入检测样品，最后将加样后的毛细管电泳芯片置于光学检测平台上，各池中插入相应电极，施加适当时序和幅值的电压进行分离检测。
2 权利要求1所述的毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，包括按常规方法进行样品收集、过滤与浓缩，其特征在于(1)用极端电泳缓冲液按比例稀释样品；使蛋白的浓度为0.5-5mg/ml；(2)使用的毛细管电泳芯片为未涂层芯片，芯片管道内径50-100um，进样、分离管道分别长2-4cm和5-10cm；(3)将尿蛋白检测样品3-4ul加在毛细管电泳芯片的加样孔中，在缓冲液池、废液池1、废液池2及管道里加入硼酸缓冲液。进样电压500-600V，进样10s，然后停止加压；在分离管道加分离电压2000-3000V，分离2min，通过检测系统的信号收集、自动化处理及分析，即可得到相应的检测结果。
3 按权利要求2所述的毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，其特征在于所述的极端缓冲液为PH9.5-10.5mM的硼酸缓冲液，并经0.22um滤膜过滤。
4 按权利要求2所述的毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，其特征在于加样孔位于进样通道和分解通道的十字型交叉处；检测窗口位于废液池端的上面。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管电泳芯片分离检测尿蛋白的方法，其特征在于首先通过微加工工艺制作石英介质的毛细管电泳芯片，然后在管道中冲入筛分介质，并在加样池中加入检测样品，最后将加样后的毛细管电泳芯片置于光学检测平台上，各池中插入相应电极，施加适当时序和幅值的电压进行分离检测。与常规尿蛋白分离检测技术相比，本发明具有样品和试剂消耗量少，检测速度快，成本低等优点。
文档编号G01N33/493GK1554947SQ20031012286
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者赵建龙, 贾春平, 李刚, 庄贵生, 王惠民, 孙承龙, 王跃国, 徐良基, 刘菁, 金庆辉, 韩志勇, 王聿佶, 陈翔 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所, 南通医学院附属医院, 中国科学院上海微系统与信息技术研究