专利名称：：一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法。
背景技术：
：宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性第二大的恶性肿瘤，大量的流行病学资料表明，高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变发病的必要条件，但是单一HPV感染并不足以引起宫颈上皮的恶性转化。微小RNAOnicroRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。许多研究证明，miRNA可以用以标记癌症，例如，美国俄亥俄州立大学的研究通过分析来自肺部、宫颈、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品540份，发现了由过量表达的大部分miRNA组成的实体癌症miRNA信号。而对于编码蛋白的肿瘤抑制子和致癌基因，这些miRNA差异表达作用的靶目标会大量富集，这说明miRNA在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用。提示其极有可能在HPV致宫颈癌的发生发展过程中发挥关键作用。近年来的研究已发现若干MicroRNA在宫颈癌中表达异常，因此利用实验生物学及生物信息学方法对与宫颈癌相关的MicroRNA进行研究是当前研究的热点之一。要了解MicroRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测MicroRNA基因的表达。成熟的MicroRNA—般只有二十几个碱基，同族的MicroRNA之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分MicroRNA在细胞中的表达水平都比较低，这些特性给传统的印迹杂交(northernblot)，生物芯片技术(microarray)和RT-PCR等常规手段带来了极大的困难和挑战。随着PolyART-PCR技术、尤其是stem-loopRT-PCR技术的发展，实时荧光定量PCR(real-timePCR)已经成为目前MicroRNA定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶MicroRNA，定量线性范围宽；而且可精确区分同一家族中序列高度同源的MicroRNA，能精确检测只有一个碱基差别的不同microRNA的表达水平。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别。以往对mRNA的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定。在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，盲目地使用内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。MicroRNA在细胞中的表达水平低仅占总RNA的0.01%，且其表达具有更大的组织特异性，所以选择合适的内参对目的MicroRNA的表达进行标准化就显得尤为重要。目前文献中用来作为MicroRNAQRT-PCR内参的分子主要有let_7a，MicroRNA-103a,MicroRNA-16,MicroRNA-191、MicroRNA-26b等和小分子RNA(RNU48、5S)，因所研究组织的不同其选择内参也不同。到目前为止，对宫颈病变相关的特异性microRNA的定量研究中多盲目的参照在其他肿瘤中使用过的内参分子(RNU48、5S、let-7a)，但对其在宫颈组织中表达的恒定性及其作为内参的适用性均未进行探究。
发明内容本发明的发明目的，在于针对现有宫颈组织中特异性MicroRNA的定量研究中内参使用的研究效果上的缺陷，提出了一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法；运用本发明方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其步骤为(1)利用MicroRNA芯片对人类MicroRNA探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的MicroRNA，作为候选的内参；(2)分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量PCR进行验证；(3)运用geNormsoftware及NormFinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织MicroRNA研究的内参分子。进一步的，所述步骤(2)中，所用标本均为临床阴道镜下活检的组织。进一步的，通过步骤(2)采集的若干份标本中，每份标本分两份，一份经液氮速冻后置液氮保存，另一份经甲醛固定后以石醋包埋。更进一步的，所述步骤(2)中，经液氮冻存组织用于MicroRNA芯片检查筛选内参分子及对候选的内参分子进行实时荧光定量PCR的验证。更进一步的，所述步骤(2)中，经石醋包埋后的组织用于进行组织学确认以验证是否发生病理学改变。本发明的有益效果在于本发明针对现有宫颈组织中特异性MicroRNA的定量研究中内参使用的研究效果上的缺陷，提出了一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法；运用本发明方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。图1是本发明的筛选步骤中总RNA电泳的数据图；图2是本发明的筛选步骤中，MiRNA的质检图；图3是正常宫颈组织与宫颈癌组织中的差异MicroRNA表达谱图4是miRNART-PCR产物大小定位电泳结果图；图5是MicroRNART-PCR产物序列确定-内参U6和has-mir_23a测序结果图；图6是MicroRNAreal-timePCR引物扩增标准曲线和溶解曲线图；图7是各候选内参分子在宫颈正常及宫颈癌组织中的表达差异数据图；图8是对候选内参基因进行geNormsoftware分析结果图。具体实施例方式下面结合附图对本发明进行进一步的解释和说明如图1-8所示本发明选用宫颈正常上皮组织及宫颈癌组织各30例，正常宫颈上皮来源采集于来浙江大学医学院附属妇产科医院进行宫颈疾病筛查的自愿者，宫颈癌组织来源于初次诊断的未经治疗的宫颈癌患者(鳞癌23例、腺鳞癌4例、腺癌3例)。所有标本均为阴道镜下活检的组织，每份标本分两份，一份经液氮速冻后置液氮保存，另一份4%甲醛固定后石醋包埋。液氮冻存组织用于MicroRNA芯片检查筛选内参分子及对候选的内参分子进行实时荧光定量PCR的验证。石醋切片用于进行组织学确认正常组织中没有病理改变，肿瘤组织中癌成份大于80%。临床分期参照2009年国际妇产科联盟(FIGO)，细胞分化程度按细胞形态分高、中和低分化。30例宫颈癌中I期22例、II期6例、II期以上2例，高分化5例、中分化21例、低分化4例。从液氮冻存组织中分别随机选取宫颈正常及癌组织标本各6例，总RNA提取成功后送至美国LCscience公司进行MicroRNA分离、质检及芯片(LCsciencemicroarray)扫描检测及芯片数据分析工作。对芯片结果按以下原则选择候选内参分子(1)在所有宫颈正常及癌组织中均高表达的MicroRNA;(2)按z-score及变异系数(CV)进行统计分析，在宫颈正常及癌组织中均表达恒定的MicroRNA;(3)在每一MicroRNA家族中选一最具有代表性的MicroRNA。目前被用来作为MicroRNAQRT-PCR内参的分子主要有let_7a，MicroRNA-103,MicroRNA-16,MicroRNA-19UMicroRNA-26b等和小分子RNA(RNU48、5S)，宫颈组织MicroRNAQRT-PCR研究中选用的内参分子有RNU48、5S、let_7a。合并芯片数据及文献检索结果，剔除在宫颈组织中表达低的分子，最终选取以下分子作为宫颈组织MicroRNA定量研究的候选内参MicroRNA23a、MicroRNA200c、MicroRNA26a、MicroRNA1979、let7a、MicroRNA191、MicroRNA103、RNU48and5S。从miRBase数据库(http://MicroRNA.sanger.ac.uk)获得各MicroRNA成熟体的序列，运用Iasergene6.0软件设计各MicroRNA相应的特异性的stem-loopRT及real-timePCR引物，引物的特异性均经BLAST搜索证实。取剩余的液氮冻存组织标本(正常组24例、肿瘤组24例)，分别进行RNA提取、质检、stem-loop法RT及荧光定量PCR(real-timePCR)的检测，随后PCR的产物行TA克隆并测序以确定其特异性。最后运用geNormsoftware及NormFinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织MicroRNA研究的内参分子。具体的实验步骤及结果如下1.标本的收集及分组1).标本的来源宫颈癌组织30例，均为初次诊断未经治疗的患者，其中鳞癌23例、腺鳞癌4例、腺癌3例；FIGO分期I期22例、II期6例、II期以上2例；高分化癌5例、中分化癌21例、低分化癌4例。宫颈正常上皮组织30例，均来自源于经宫颈疾病筛查均为阴性的自愿者。2).阴道镜下活检获取新鲜宫颈组织，每份标本分两份，一份经液氮速冻后置液氮保存，另一份4%甲醛固定后石醋包埋。石醋包埋标本制作成4μm的切片，分别进行HE染色和免疫组化二步法染色，进一步确定正常宫颈组织中无病理改变，肿瘤组织中癌组织>80%及其组织学类型。2.MicroRNA芯片检测及结果分析1).随机选取液氮中保存的新鲜宫颈组织12例(宫颈癌6例、正常宫颈6例)，提取总RNA，进行MicroRNA分离、质检及芯片(LCsciencemicroarray)扫描检测。符合MicroRNA芯片检测标准的总RNA及MicroRNA提取、质检(见图1，2)。2).MicroRNA芯片的检测结果及数据分析正常宫颈与宫颈癌筛查出差异表达的MicroRNA31个(见图3)，表达一致MicroRNA，按平均表达量高低排序后，用z-score及变异系数(CV)进行统计分析，筛选出候选内参MicroRNA分子(见表1)。z-score=Χ-μ/σ(X是指芯片中某MicroRNA在所有标本表达量的平均信号值，μ是X的平均数，σ是某MicroRNA在所有标本表达量标准误)。表1候选内参MicroRNA分子的平均信号值、CV及z_score值Meancvz-scoreRankhsa-let-7a32,9520.18804.18911hsa-let-7c29，5720.21614.62672hsa-let-7f25，2010.22544.43683hsa-let-7b24，7850.23354.28274hsa-miR-26a24,0890.23464.26185hsa-let-7d22，6820.25063.99076hsa-miR-23b20，6790.25283.95577hsa-miR-23a18,5680.26743.74018hsa-miR-200c10，2250.28773.47549hsa-let-7i8，2240.29103.436810hsa-let-7g9,0200.30863.240711hsa-miR-197920,0950.32553.0718123.目前可用来作为MicroRNAQRT-PCR内参的分子目前被用来作为MicroRNAQRT-PCR内参的分子主要有let_7a，MicroRNA-103，MicroRNA-16,MicroRNA-191、MicroRNA-26b等和小分子RNA(RNU48、5S)，宫颈组织miRNAQRT-PCR研究中选用的内参分子有RNU48、5S、let_7a。4.候选内参分子的real-timePCR检测合并芯片及文献检索结果最终选取以下分子作为宫颈组织MicroRNA定量研究的候选内参MicroRNA23a、MicroRNA200c、MicroRNA26a、MicroRNA1979、let7a、MicroRNA191、MicroRNA103a、RNU48和5S。1).从miRBase数据库(http//MicroRNA.sanger.ac.uk)获得各MicroRNA成熟体的序列2).运用Iasergene6.0软件设计各MicroRNA相应的特异性的stem-loopRT及real-timePCR引物，引物的特异性均经BLAST搜索证实。各引物见下表2。表2候选MicroRNA相应的特异性的stem-loopRT及real-timePCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>MicroRNAstem-loop法RT体系(10μ1)totalRNA500pgIOXRTBuffer(TaKaRaBiotechnology)2.0μ12.5mMdNTPs(TaKaRa)1.0μ15xRTPrimer(invitrogen)1·0μ140U/mLRNaseInhibitorProtein(TaKaRa)0.2μ1lOOU/ulwt-MMLV-RT(Ambion)0.5μRNA-freewaterupto10μ1RT循环参数如下16°CX30min—42°CX30min—85°CX5min.取上述RT产物，分别进行用AppliedBiosystems7900HT进行荧光定量PCR(real-timePCR)的检测。通过添加溶解曲线、产物的电泳及TA克隆测序以确定PCR产物的特异性。A.real-timePCR反应体系(20μ1)cDNA2μ1SYBRgreenI(TaKaRaBiotechnology)10μ150ΧROXStandard0.4μ1IOxPCRforwardprimer(invitrogen)0.5μ1IOxPCRreverseprimer(invitrogen)0.5μ1PCR循环参数如下95°C预变性IiTminI(95°CX10s，60°CX30s)X40个循环I72°C延伸IOminB.MicroRNART-PCR产物大小定位——电泳结果显示产物的大小在60_70bp，是所需扩增的目的片断，详见图4。C.MicroRNART-PCR产物序列确定-内参U6和has-mir_23a测序分析结果显示序列的符合率为100%。见图5=MicroRNART-PCR产物序列确定——内参TO和has-mir-23a测序结果。D.MicroRNAreal-timePCR引物扩增效率和特异性确定——标准曲线和溶解曲线检测。标准曲线示扩增效率达100%，溶解曲线示产物的特异性好。4)候选内参分子real-timePCR检测结果各候选内参分子在宫颈组织中表达的水平均用Ct值表示，其在宫颈正常及宫颈癌组织中的表达差异如图7所示，其在所有组织中表达的最大、最小Ct值及其表达的变动范围如表3所示。表3各候选内参分子在宫颈组织中表达的最大、最小Ct值及其变动范围<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5)运用geNormsoftware及NormFinder内参分析软件进行数据分析NormFinder的分析结果NormFinder的分析显示MicroRNA23a是宫颈组织MicroRNA研究的最稳定的内参，5s和MicroRNA191最佳的内参组合。4候选内参分子总体表达的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4候选内参分子在组内表达的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4候选内参分子在组间表达的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2)geNormsoftware分析结果该程序将某一内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M，对所有候选内参基因的表达稳定度进行排序，并对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目。▲候选内参基因按M值进行排序，M>1.5者认为不适合作内参，M值越小说明基因表达越稳定。geNorm分析显示最稳定的是MicroRNA23a和MicroRNA191(如图8所示)。经本发明筛选方法筛选得出的内参分子筛选结果MicroRNA23a是一种新发现的宫颈病变相关的特异性MicroRNA的定量研究中的合适的内参，其恒定性均优于以前常用的内参(RNU48、5S、let-7a)。下面通过试验方法来说明本发明的具体筛选过程例如以MicroRNA23a作为内参用实时荧光定量PCR法检测宫颈正常组织与宫颈癌组织中MicroRNA375的表达差异。实验操作过程1.宫颈组织MicroRNA的提取、质检1)每50IOOmg组织用ImlTrizol试剂对组织进行裂解后将Trizol裂解液转入EP管中，在室温1530C下放置5分钟；2)在上述EP管中，按照每ImlTrizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15°C30°C)放置23分钟后，12000g(2°C8°C)离心15分钟；3)取上层水相置于新EP管中，按照每ImlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15°C30°C)放置10分钟，12000g(2°C8°C)离心10分钟；4)弃上清，按照每ImlTRIZOL加Iml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2°C8°C)离心5分钟，弃上清；5)让沉淀的RNA在室温下自然干燥；6)利用分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测样本的RNA浓度及纯度。(合格的标准为OD260/280^2(1.9to2.2)，28S/18Sratio彡1.7)2.MicroRNA23a及MicroRNA375特异性的stem-loopRT及实时荧光定量PCR引物的设计1)从miRBase数据库(http//MicroRNA.sanger.ac.uk)获得各MicroRNA成熟体的序列2)运用Iasergene6.O软件设计各MicroRNA相应的特异性的stem-loopRT及real-timePCR引物，引物的特异性均经BLAST搜索证实。3.对宫颈组织中的MicroRNA23a及MicroRNA375分别用stem-loop法进行逆转录MicroRNAstem-loop法RT体系(10μ1)totalRNA500pgIOXRTBuffer(TaKaRaBiotechnology)2.01μ12.5mMdNTPs(TaKaRa)1·Oμ15xRTPrimer(invitrogen)1.Ομ140U/mLRNaseInhibitorProtein(TaKaRa)0.2μ1lOOU/ulwt-MMLV-RT(Ambion)0.5μRNA-freewaterupto10μ1RT循环参数如下16°CX30min—42°CX30min—85°CX5min.仪器(48_wellGeneAmpPCRSystem9700)4.取上述RT产物，分别进行荧光定量PCR(real-timePCR)的检测real-timePCR反应体系(20μ1)cDNA2μ1SYBRgreenl(TaKaRaBiotechnology)10μ150ΧROXStandard0.4μ1IOxPCRforwardprimer(invitrogen)0.5μ1IOxPCRreverseprimer(invitrogen)0.5μ1PCR循环参数如下95°C预变性IiTminI(95°CX10s，60°CX30s)X40个循环I72°C延伸IOmin仪器AppliedBiosystems7900HT5.数据分析利用SPSS16.0统计学软件，以MicroRNA23a为内参利用2(-DeltaCT)methods统计分析宫颈正常组与宫颈癌组间MicroRNA375表达的差异性。值得注意的是，具体实施方式仅是对本发明的说明，不应将其视为对本发明的技术方案的限制和限定，因此，采用本发明的实质内容而仅做局部改变的，仍应落入本发明的保护范围内。权利要求一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于，该筛选方法的步骤为(1)利用MicroRNA芯片对人类MicroRNA探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的MicroRNA，作为候选的内参；(2)分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量PCR进行验证(3)运用geNormsoftware及NormFinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织MicroRNA研究的内参分子。2.根据权利要求1所述的一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中，所用标本均为临床阴道镜下活检的组3.根据权利要求1所述的一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于通过步骤(2)采集的若干份标本中，每份标本分两份，一份经液氮速冻后置液氮保存，另一份经甲醛固定后以石醋包埋。4.根据权利要求1或3所述的一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中，经液氮冻存组织用于MicroRNA芯片检查筛选内参分子及对候选的内参分子进行实时荧光定量PCR的验证。5.根据权利要求1或3所述的一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中，经石醋包埋后的组织进行组织学确认以验证是否发生病理学改变。全文摘要本发明公开了一种适用于宫颈组织microRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法；本发明采用的技术步骤为利用MicroRNA芯片对人类MicroRNA探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的MicroRNA，作为候选的内参；分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量PCR进行验证；运用geNormsoftware及NormFinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织MicroRNA研究的内参分子，运用本发明方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。文档编号G01N21/64GK101818202SQ20101015587公开日2010年9月1日申请日期2010年4月26日优先权日2010年4月26日发明者万小云,叶枫,吕卫国,李阳,沈源明,王芬芬,谢幸申请人:浙江大学医学院附属妇产科医院