专利名称：免疫组化二抗试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫组化二抗试剂盒，特别涉及一种包括三聚氯氰活化辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白的免疫组 化二抗试剂盒。
背景技术：
19世纪40年代，Coons首先建立了免疫组织化学法，随后被广泛应用到生物学的多个领域，包括细胞功能研究、肿瘤形成过程的研究，以及感染性疾病的检测等。近几年来，随着杂交技术及单克隆抗体技术的发展，使制备的诊断抗体具有更高的特异性和敏感性。免疫组化技术借助这些新技术的发展，在临床病理学、免疫学、微生物学诊断中发挥了巨大的实用价值。酶标抗体技术是通过共价键经适当方法将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶亲和抗体，其次要有良好的制备方法。辣根过氧化物酶是最常用的一种酶。抗体与酶连接的方法很多，目前较为常用的主要是戊二醛法和改良的过碘酸钠法。戊二醛是一种同型双功能偶联剂，其两个醛基可以与碱性氨基酸的氨基形成希夫碱或迈克尔加成复合物，也可以与胱氨酸的巯基、酪氨酸和组氨酸的苯环和咪唑环发生交联。抗体和辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶都是富含上述基团的生物分子，所以可以通戊二醛将两者连接起来。根据偶联反应中酶与抗体的反应的顺序，戊二醛法可以分为一步法和两步法。戊二醛一步法将偶联剂戊二醛、抗体和酶进行反应，该方法简单、省时、有效和重复性好等；缺点是交联反应速率不同，抗体蛋白的氨基酸数远较HRP为多，与戊二醛反应快，不易控制，易形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记；结合效率非常低，约为1%_5%，很难获得理想的酶标抗体。戊二醛二步法首先将偶联剂戊二醛与抗体或酶进行反应，待除去多余的偶联剂后，再与另一种物质反应；该比较简单，重复性好，能够减少自身聚合物的产生，缺点仍然是酶的利用率低，一般只有2 4%的酶与蛋白质结合。综上所述，戊二醛法HRP的活性效率和与IgG结合的效率都非常低，反应可控性差。简易过碘酸钠法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，经氧化形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连形成希夫碱，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。该方法所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，90%的IgG与酶结合，是目前最常用的方法。本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是过碘酸钠将HRP发挥主要功能的糖环打开，HRP活性降低；反应中需要NaBH4 (有毒)的参与，危险性
增加，切杂质不易去除。反应式如下
权利要求
1.一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于包括三聚氯氰活化的辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白，即CC-HRP-Ig; 所述CC-HRP-Ig由以下方法制得 (1)活化三聚氯氰与辣根过氧化物酶或免疫球蛋白反应，得活化的辣根过氧化物酶或活化的免疫球蛋白； (2)偶联所述活化的辣根过氧化物酶与免疫球蛋白偶联反应得CC-HRP-Ig，或所述活化的免疫球蛋白与辣根过氧化物酶偶联反应得CC-HRP-Ig ； 反应式如下
2.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于所述免疫球蛋白为免疫球蛋白G、单价免疫球蛋白片段Fab、双价免疫球蛋白片段F (ab) 2或免疫球蛋白M,所述三聚氯氰、辣根过氧化物酶与免疫球蛋白的质量比为I :(0. 1-10) (0. 1-10)。
3.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于步骤(I)中，所述反应温度为0°C -8°C，反应时间为2-8h。
4.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于步骤(2)中，所述反应温度为25°C -40°C，反应时间12h-24h。
5.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于所述CC-HRP-Ig存在于溶液中，所述溶液包括如下组分6-18mg/L CC-HRP-Ig，5-20g/L牛血清白蛋白，0.05-0. lg/L 硫柳汞和 pH 7. 0-7. 4 的 0. 01-0. lmol/L 磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于试剂盒还包括山羊血清溶液，所述山羊血清溶液包括体积百分浓度为1-10%的山羊血清，0. 05-0. lg/L硫柳汞和pH 7. 0-7. 4的0. 01-0. lmol/L磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于试剂盒还包括体积百分浓度为3-10%的双氧水水溶液。
8.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于试剂盒还包括二氨基联苯胺固体或二氨基联苯胺浓缩液，所述二氨基联苯胺浓缩液的浓度为30-100g/L。
9.根据权利要求I所述的一种免疫组化二抗试剂盒，其特征在于试剂盒还包括二氨基联苯胺反应底物，所述二氨基联苯胺反应底物为体积百分浓度为1-10%双氧水水溶液。
10.权利要求I所述的免疫组化二抗试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)活化三聚氯氰与辣根过氧化物酶或免疫球蛋白反应，得活化的辣根过氧化物酶或活化的免疫球蛋白； (2)偶联所述活化的辣根过氧化物酶与免疫球蛋白偶联反应得CC-HRP-Ig，或所述活化的免疫球蛋白与辣根过氧化物酶偶联反应得CC-HRP-Ig ； (3)免疫组化二抗试剂盒的制备利用所述CC-HRP-Ig制备免疫组化二抗试剂盒；反应式如下
全文摘要
本发明提供了一种免疫组化二抗试剂盒，包括三聚氯氰活化的辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白溶液，即CC-HRP-Ig。所述CC-HRP-Ig由以下方法制得步骤一活化，三聚氯氰与辣根过氧化物酶或免疫球蛋白反应，得活化的辣根过氧化物酶或活化的免疫球蛋白；步骤二偶联所述活化的辣根过氧化物酶与免疫球蛋白偶联反应，或所述活化的免疫球蛋白与辣根过氧化物酶偶联反应得CC-HRP-Ig。该免疫组化二抗试剂盒抗体效价高，灵敏度高，成本低。
文档编号G01N33/68GK102707069SQ20121018136
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者冯展波, 刘冬, 周军 申请人:南京巴傲得生物科技有限公司