专利名称：在凝胶过滤介质上连接进行重复固相析出的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种全新的分离纯化方法，适用于多种物质的分离纯化，可以把一大类基本的分离纯化方法——液体溶液中的固相析出法提高到一个新水平。
固相析出法，包括沉淀法和结晶法，是一种非常基本的分离纯化方法。它是根据不同物质在同一溶液中溶解度不同，在固液两相分配的量不同进行分离的。操作上，使不同的物质在处于一定条件的溶液中发生固相析出，形成沉淀或结晶，然后用自然沉降、过滤或离心技术分离固液两相。
固相析出法具有简单、经济、处理量大、适应面广、浓缩倍数高的优点，广泛应用于各种物质的分离纯化过程中，在化学、化工、生物工程、生化、医学、制药、食品等众多学科与产业的分离纯化工作中，起非常重要的作用。
固相析出法一般一次就可除去大量杂质，但为提高产品纯度，常需进行重复操作，如有机小分子物质和无机物常用重结晶方法，蛋白质分离常可用重复盐析等。
重复固相析出法会明显改善分离效果，但因为单元操作体积和装置的接触面积不可能太小，造成损失大、收率低；又因重复析出一般是断续操作，步骤多而操作麻烦，实际应用中，重复析出的次数不可能过多，一般只重复两到三次；所以重复固相析出法在应用上受到严重的限制。
迄今为止，人们已设计出几种连续重复固相析出装置，但应用面都很窄，效率也不高。
如工业上应用的连续多级结晶器，用温度梯度实现重复结晶，固液分离靠螺旋刮刀等分离不彻底，效率较低。
在聚合物的淋洗分级装置中，也有一种连续重复沉淀的设计，通过温度梯度，使溶解了的沉淀又重新沉淀，沉淀物与溶液分离靠的是玻璃砂、铝箔等物质，固液分离也不彻底，效率不高。
Schwimmer在1953年(S.Schwimmer，Nature，1953，171，442)曾用过如下方法把CaSO4·1/2H2O介质填装在玻璃柱中，将含蛋白质的硫酸铵溶液流经柱体，介质的水合作用增加了盐的浓度，造成蛋白质的盐析，因溶液向前流动，盐浓度逐渐增高，可能造成反复沉淀。但此法条件很难控制，效率也不高。
已知的重复固相析出装置，都有应用面窄、装置较复杂、固液分离不彻底、效率低、操作条件较难控制的缺点，至今还没有一种较好的连续重复固相析出法广泛应用。
本发明的目的发明一种全新的，在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的方法，它分辨率高、回收率大、上样量大、设备简单、装置可以反复使用并适用于多种析出方法。
本发明的基本要点是本发明应用以下两点原理首先，在凝胶过滤层析中，小分子迁移慢，大分子迁移快，其次，一定范围大小的固体颗粒介质(一般大于5μm、小于50μm)可以充当助滤剂，拦阻固相析出物，起到过滤的作用，并提供高的流率。而一定细度的凝胶过滤介质可以起助滤剂作用。本发明利用第一点实现重复固相析出，利用第二点实现彻底的固液分离。
实施本发明的条件固相析出剂的分子量比被析出物的分子量要小，使得二者在凝胶过滤介质上，迁移时，有较明显的速率差异。
操作上，选择适当排阻范围和工作范围的，一定细度的凝胶过滤介质，填装在层析柱内，或铺成板准备层析，先将能使被分离物发生固相析出的溶液(称做析出剂或析出)流入柱或板内，达到一定体积，再将被分离物质以固相或溶解相上样，然后通入能使被分离物溶解的溶液或溶剂(称为溶解液或溶解剂)进行洗脱，以上装柱或铺板及上样洗脱的操作同于一般的层析操作。
样品被溶解剂洗脱后，被分离物质分子以溶解状态迁移，迁移速率比前面的析出剂分子速率快，所以会逐渐赶上并相遇，进入析出剂里发生固相析出，析出物即被作为助滤剂的凝胶过滤介质过滤拦阻，而溶液中不析出的物质继续以原速率快速迁移，这样发生第一次固相析出分离。析出物被拦阻后，停止不动，当后续的溶解剂流过时，又重新溶解，以大的迁移速率追赶析出剂，重复析出，析出物又被拦阻，发生第二次固相析出分离，如此反复，只要层析柱或板有足够的长度，使以上的追赶过程实现，就可以继续重复。这样，就可以实现连续而多次重复的固相析出分离，直至被分离物流出柱或板为止。
以上所说的一定排阻范围，是指能使析出剂分子与被分离样品分子的迁移速率的有明显差别，而且差别越大越好，最好是析出剂完全渗透，样品分子完全排阻。比如在等电点沉淀蛋白质，一定pH值的缓冲液的分子属小分子，如NaAc-HAc缓冲液，而蛋白质分子分子量大于一万，所以用葡聚糖凝胶G-10，G-15，G-25，都可以满足最好的排阻范围要求。一定的细度指的是能够较好地拦阻析出物使固液分离彻底又有较好的流速，一般中粒或更小颗粒的凝胶过滤介质就可以较好地拦阻析出物。一定的工作范围，指在析出剂、溶解剂和样品溶液中介质操作性能良好。
凝胶过滤层析技术又称分子排阻层析，凝胶渗透层析，作为一种通用性的分离技术已广泛应用，其介质也不断推陈出新，有多种商品可供选择；如控孔玻璃微珠(Bio-glass)系列，葡聚糖(Sephadex)系列，琼脂糖(Bio-GelA、Sepharose)系列，聚丙烯酰胺(Bio-GelP)系列，聚合烯丙基葡聚糖(Sephacryl)系列、聚乙烯醇(Toyopearl)系列等，其分子排阻范围从百到数百万道尔顿，其粒度一般都有粗、中、细、超细四个等级，除粗粒外，中、细、超细胶作为助滤剂的性能很好，可以快速地过滤一般的固相析出物。工作范围也较宽，在水溶液操作性能良好，许多凝胶如Sephacryl，Toyopearl，可以在有机溶剂中操作，并可耐受一定强度的酸碱，机械生能与流速也非常好，总之，现代凝胶过滤层析技术已能为本发明提供多种排阻范围，细度和工作范围的凝胶，为本发明的可行性提供了充分的保证。
本发明可以很方便地在现有的层析装置上实施。同一般层析技术相似，可以采用阶段洗脱、梯度洗脱方式，也可以在一个柱上实现多种方式的不同机制的固相析出方法的连续重复操作。
阶段洗脱方式先在层析柱或板内流入析出液，然后上样， 再分别用不同强度的溶解剂分别按阶段进行洗脱。
梯度洗脱方式使析出液与样品同于阶段洗脱方式流入层析系统，而溶解剂则按梯度方式逐渐增强溶解生能。这种洗脱方式，会使样品得到一个连续的，分辨力更好的分级效果，在流出液中不同的物质将会有一个较窄的分布。
如果我们在层析系统中先流入一种析出方式的析出剂达一定体积，然后再流入另一种析出方式的析出剂达一定体积，两种析出剂的迁移速率相等或相近而不能相互混合干扰，而其体积不能太大，要让样品物质的速率能从后面追上来并发生一定次数的反复析出，那么我们就可以在一个柱或板上，实现两种析出方式的连续重复分离。
本发明所指的固相析出剂不一定是特定的沉淀剂，只要在某一溶液或溶剂中溶解度小，有析出就可以，甚至可以用蒸馏水等。
本发明将固相析出分离原理与凝胶过滤层析原理结合起来，创造了一种全新的连续重复固相析出技术，可简称“固相析出层析”，它与现有技术相比，有以下优点1.上样量大、分辨率高、回收率较好。可以将固相析出分离方法引入一个新水平。因为采用助滤剂过滤方法在介质上阻留析出物，不同与一般层析技术的保留机制，所以其上样量可以大于任何一种已知的层析技术而没有固定相吸附或分配等过程中所出现的饱合限制；因为是多次连续重复析出且固液分离彻底，故比一般的析出分离法分辨力高出许多；因本发明的固液分离机制特殊，其单元操作体积小、故回收率较好。
2.操作简单，实施容易方便，与现有的层析设备兼容，介质可以反复使用，每次用后不需要再生，比其它的重复析出操作简单得多，且速度快。装置简单、体积小，可以连续自动进行重复析出，节省人力，并可自动跟踪检测。可省去一些离心和过滤的特殊设备，降低成本。可以在现有的实验室规模及工业规模的层析设备上直接应用。
3.应用非常广泛。溶液中的固相析出法是一大类的基本分离方法。只要满足析出剂的分子量比待分离物质的分子量小的条件，就可以应用本发明。而绝大多数的溶液析出法，都是用分子量较小的析出剂使分子量较大的物质发生固相析出而得以分离的。故本发明可以得到非常广泛的应用。凝胶过滤介质排阻范围可以从百至百万，只要满足重复析出的追赶条件，不论被分离物质是大分子还是小分子都可以实施本发明。
在理论上，本发明可以把固相析出法从初分离水平提高到一个较精确生产制备的水平，并为层析技术提供了一种全新的机制，还为寻找特定物质的析出条件提供一个全面而方便的方法。象聚乙二醇沉淀蛋白质等选择生较好的析出法应用本发明，尤其是梯度洗脱方式，得到了很高的分辨率，可以成为一类很有价值的方法。
在实践上，因为固相析出法广泛应用于初分离及工业生产，对这些生产工艺实施本发明，将会明显改善纯度，缩短工艺，节省人力和成本，将会使一系列的工艺得到改进。
下面列举一些适合实施本发明的一些固相析出方法对蛋白质和多肽的分离，有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶生非离子聚合物沉淀法、金属离子沉淀法、有机酸沉淀法、无机酸沉淀法、表面活生剂沉淀法、多聚电解质沉淀法等等。
对核酸、多糖、脂类等物质，有有机溶剂沉淀法、金属盐沉淀法、非离子聚合物沉淀法等。
对抗生素、氨基酸、维生素等有金属盐沉淀法，在特殊溶剂中的一些结晶法、盐析法等。结晶法也可以广泛实施尤其对一些有机物和分子量较大的无机物。
下面列举些可实施本发明得到改善的工艺胰岛素的盐析与等电点沉淀工艺、胃蛋白酶的重复盐析工艺、乙醇法及酚法处理核糖核酸的工艺、乙醇沉淀分离右旋糖酐的工艺、亚油酸的盐析工艺、胆固醇的丙酮提纯工艺、头孢菌素的二价重金属离子沉淀工艺，等等。
以下结合几个实施例对本发明作进一步说明实例1用连续重复盐析方法分离三种标准蛋白样品称取牛血清白蛋白12.0mg，鸡卵清蛋白12.0mg，核糖核酸酶13.0mg，混合在一起，用1.60ml蒸馏水溶解(三种标准蛋白都是上海生化所东风度试剂厂，电泳纯产品)。
层析介质选择瑞典Pharmacia公司生产的葡聚糖凝胶SephadexG-25细胶(Fine)，溶胀后装填于10mm×60cm柱中，填装55cm，用蒸馏水装柱。
盐析用溶液为用蒸馏水配制的，70％饱合度的硫酸铵溶液。
操作柱装好后，用70％硫酸铵溶液平衡两个柱床体积，然后上样1.60ml，再用直线梯度洗脱方式洗脱，搅拌瓶为75ml的70％硫酸铵溶液，贮存瓶为75ml蒸馏水，平衡与洗脱流速为24ml/小时。
用核酸蛋白检测仪在280nm于柱后检测，当梯度走完后，用蒸馏水洗脱，直至记录仪回复基线无吸收为止，共出现三个蛋白吸收峰。
以上操作在室温进行。
实施例2，用连续重复盐析法分离蛇毒样品称东北白眉蝮蛇毒冻干粉末100.0mg，用1.0ml蒸馏水溶解。
层析介质为瑞典Pharmacia公司生产的交联葡聚糖SephacrylS-200HR凝胶，用蒸馏水装填16mm×100cm的层析柱，柱中胶装至90cm高。
盐析溶液为55％饱合度的硫酸铵溶液，先用此溶液平衡1个柱床体积。
然后上样1ml，用盐浓度逐渐下降的直线梯度洗脱，贮存瓶为125ml蒸馏水，搅拌瓶为125ml的55％的硫酸铵溶液，流速32ml/小时。
用核酸蛋白检测仪检测并用记录仪记录，当梯度洗完后，再用蒸馏水继续洗脱，直至记录笔回复基线不再有吸收为止。
层析图谱在后部分显示较高的分辨力。
实施例3用等电点沉淀法分离酪蛋白样品市售500g包装的酪蛋白，取500mg，溶于5ml的0.1mol/L的醋酸钠溶液中。
层析介质用瑞典Pharmacia公司生产的葡聚糖凝胶SephadexG-75中粒凝胶，溶胀后，用蒸馏水装填于26mm×30cm的层析柱中。
用4mmol/L的PH4.70的HAc-NaAc缓冲液为沉淀剂平衡2个柱床体积，再上样5ml，然后用0.1mol/L的pH为7.9的Tris-HCl缓冲液作溶解剂洗脱。
平衡与洗脱流速皆为100ml/小时。
用核酸蛋白检测仪在280nm连续检测，并用记录仪记录。用溶解剂洗至不再有蛋白吸收。
上样后，洗脱10ml左右，即可在微透明的凝胶中看到出现白色的沉淀带，随溶解剂不断流入，白色沉淀带逐渐前移，并渐渐加宽，直至出柱。
实施例4用连续重复有机溶剂沉淀法分离人血浆样品1ml新鲜的人抗凝血浆层析介质用Sephacryl S-200HR，用蒸馏水装填26m×30cm的层析柱。
用50％的乙醇-蒸馏水溶液作沉淀剂，配法向1000ml95％乙醇中加入960ml蒸馏水，混匀。
先用50％乙醇溶液平衡柱子1个柱床体积后上样1ml，用乙醇浓度逐渐下降的直线梯度进行洗脱，贮存瓶为150ml蒸馏水，搅拌瓶为150ml50％乙醇溶液。
平衡与洗脱流速为30ml/小时，用核酸蛋白检测仪在280mm连续检测并记录，梯度洗完后，用蒸馏水洗至记录笔回到基线并稳定，不再有吸收为止。
权利要求
1.一种在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其特征在于选择适当排阻范围和工作范围的，一定细度的凝胶过滤介质，填装在层析系统内，先将能使被分离物发生固相析出的溶液或溶剂(称做析出液或析出剂)流入系统内，达到一定体积，再将被分离物质以固相或溶解相上样，然后通入能使被分离物溶解的溶液或溶剂(称为溶解液或溶解剂)进行洗脱。
2.按照权利要求1所述的在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其中析出液或析出剂分子与被分离物质的分子在分子大小或形状上有较明显差别，造成前者在层析系统上的迁移速率明显慢于后者选择适当排阻范围指的是在这种排阻范围的凝胶过滤介质上，迁移速率差别越大越好。
3.按照权利要求1所述的在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其中一定细度指的是该凝胶过滤介质能较好地过滤拦阻析出物，实现固液分离。
4.按照权利要求1所述的在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其中析出液或析出剂指的是在其中能使被分离物质发生析出的溶液或溶剂，甚至是蒸馏水也可以，不一定是特殊的析出溶液或溶剂。
5.按照权利要求1所述的在凝胶过滤介质上连续进行重复固相析出的分离纯化方法，其中层析系统可以是柱或板等，洗脱方式可以与普通层析一致，比如可以用阶段与梯度洗脱方式等。
全文摘要
本发明涉及一种全新而基本的分离纯化方法，适合多种物质的沉淀与结晶分离纯化过程。该方法通过将一定体积的固相析出溶液或溶剂流入适当的凝胶过滤层析系统，再上样洗脱，实现了连续重复的固相析出分离纯化过程。本方法的特点是分辨率高，上样量大，损失小，操作简便，适用面极广，可以使一系列的沉淀、结晶的分离纯化方法和工艺得到明显改进，具有很大的应用推广价值，尤其适合于实验室制备与工业化生产。
文档编号G01N1/34GK1153298SQ9511403
公开日1997年7月2日 申请日期1995年12月26日 优先权日1995年12月26日
发明者黄潮 申请人:黄潮