专利名称：农作物抗病蛋白质的检出法的制作方法
据国际有关部门统计，因病害全世界每年损失的农作物为总量的10%[1]，即每年约损失500亿美元。这个巨大的损失还是在化费了巨大的人力、物力的防治基础上。病害不仅使农作物减产，还常使农产品质量下降且防碍了国际上农产品的贸易及带来检疫上的麻烦。目前，防治农作物病害的最好方法之一就是利用基因工程技术培育出有良好性状的抗病新品种。要实现这基因工程的前提之一就是检出、分离抗病基因。如过果检出了抗病蛋白质就可以用常规方法从蛋白质中检出相应的抗病基因。不仅如此，抗病蛋白质的检出还将大大促进抗病分子生物学和抗病机理研究的发展。
虽经人们多年来多方的努力，农作物抗病蛋白质或抗病基因至今尚未检出成功。这个原因有方法学上的问题也有对抗病基因及抗病蛋白质的看法不正确。现就方法学上的问题加以述评。综合起来，人们提出的或应用于检出抗病基因或抗病蛋白质的方法大致有以下数种(a)克隆战略。即把抗病品种的基因全部克隆，然后分批逐次转化感病品种，根据转化后代的表型求出抗病基因在哪一批中。已知半倍体植物的平均基因组约5×106Kb，按50Kb每克隆就得要106克隆才能得好的复盖率。这么多的克隆，加上实际操作的问题，至今无成功的例子。(b)染色体步行法(Chromosome Walking)。由于农作物基因组内有众多的重复顺序DNA，走步又得双向进行;加上对抗病基因与附近的已知基因的认识了解太少，使得本法在实际上是行不通的。(c)可动元件标签法。应用此法已从细菌和昆虫中分离出未知基因。但对农作物内源可动元件和可动元件的形式、功能了解不多，加上测试手段的麻烦，至今未见成功的报导。人们对玉米的可动元件情况了解较多，即便为此Bennetzen[2]等人对RP1基因的检出研究就遇到了不少困难未获成功。(C)差比法。即比较感、抗两品种或诱导前后蛋白质的差异来寻找抗病蛋白质。农作物受诱导后有许多保卫基因的表达及与保卫基因有关连的基因也得到表达，这个方法易把别的蛋白质误认为抗病蛋白质。又如果比较感、抗两品种的蛋白质差别来寻找抗病蛋白质，按目前常规方法也是难以成功的。由于抗病蛋白质与感病蛋白质的高度相菩袁即使应用等基因系的感、抗两品种为材料也难以成功。Gabriel和Ellingboe[2]的工作就是一个例子。(e)激光法。此法是染色体工程加上激光技术的方法，在建立抗病附加系或置换系的基础上利用激光逐步破坏载有抗病基因的染色体，再从表型求得抗病基因。此法构思合理但费时费事，也未有成功的报导。
本发明提供了一个简便、可行的检出农作物抗病蛋白质的方法。从蛋白质信息到基因的检出已有常规方法可循。利用抗病或感病品种的蛋白质提取物或部分纯化的蛋白质提取物与各不同的原生理小种(生理型或菌株)之间的特异相互作用检出抗病蛋白质。
本发明提供了一个简易的纯化抗病蛋白质的步骤。由于抗病蛋白质或识别蛋白质是处在细胞的膜壁上，膜壁组分一般均含有脂质，可利用正辛醇的亲脂性把膜壁的碎片从上清液中富集在正辛醇层内，达到浓缩的目的。我们把上清液的蛋白质收集起来，并证明它不再含有抗病蛋白质。经此一步纯化后可使抗病蛋白质或感病蛋白质得到高度浓缩;这样，抗病蛋白质的检出成为简易可行。
本发明的内容在以下的实施例具体叙述。
实施例1.
棉枯萎病抗病蛋白质的检出法。取50克棉花叶子加入150ml 0.5M Tris-Hcl，PH7.8的缓冲液(含1%Polyvinyl pyrolidone聚乙烯吡咯烷酮，1mM Phenyl Methyl sulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟)及2ml正辛醇。在捣碎机内匀浆。此匀浆在4℃下25000g离心30分钟。收集浮在离心液上的脂状物。弃去上清液及残渣，经分析此上清液中的蛋白质已不含有抗病蛋白质。在此脂状物中加入约5ml 0.05M Tris-Hcl PH7.8-1mM苯甲基磺酰氟，放在0℃下30分钟，时时振荡，抽提脂状物中的可溶物。再次离心收集上清液，此上清液中含有抗病蛋白质(从抗病品种)或感病蛋白质(从感病品种)。应用等电聚焦方法可纯化此抗病蛋白质及感病蛋白质。此抗病蛋白质R在7μg/ml时即能抑制不亲和病原菌孢子的萌发但不抑制亲和病原菌孢子的萌发。感病蛋白质S即使在40μg/ml的浓度下也不抑制孢子的萌发。蛋白质R还有杀伤Hela细胞的能力，其活性与蓖麻毒蛋白(ricin)基本均等。
检出抗病蛋白质的关键在于把部分纯化的制剂与孢子混合后，此蛋白质R能与不亲和的孢子相结合而在继后的等电聚焦电泳图谱上消失。但蛋白质S与亲和的孢子不相结合而仍出现在等电聚焦电泳图谱上。
3072棉种为52-128(抗)DNA+江苏1号(感)的选择后的稳定后代，我们也从3072中检出蛋白质R。
实施例2.
我们选用五个水稻品种(IR26，TN1，NG15，IR1545及DV85)和九个白叶枯病病原菌(Xanthomonas Campestris PV.Oxyzae)为试验材料，经反复交叉测试证明(1)在不亲和关系时(即寄主呈抗性，病原菌无毒)，各水稻中有一个蛋白质(多肽)能与菌体相结合而在亲和关系时(寄主感病，病原菌有毒)无此特异吸附作用。(2)NG15为一成株期抗性品种，即在成株期呈抗病而在幼苗期(或10叶期以下)呈感病。而我们的实验表明NG15中的此特异性蛋白质仅在成株期表达出来，在幼苗期不表达。(3)经典遗传学证明DV85含有二个抗病基因。而我们的体外检测也证明有二个特疫抗病蛋白质。由于体外检测(1)与抗病表型完全一致(无一例外)。(2)与不同生理发育时期的抗性表型一致。(3)与经典遗传学数据一致;因此我们认为由此法检出的抗病蛋白质是抗病基因的产物。
实施例3应用与实施例1及2的相同方法正辛醇纯化法及样品制剂与病原菌(或孢子)相作用的方法]检测出小麦赤霉病(ear scab of wheat)的抗病蛋白质和感病蛋白质。抗病品种的制剂能抑制病原菌的生长而感病品种的无此抑制现象。我们所采用的抗病小麦品种为苏麦3号及望水白，感病品种为宁麦6号。所用的菌株为F15(大丰)及F22(无锡)。
实施例4.
又应用上述方法，检测出棉花黄萎病(Verticillum-wilt in cotton)的抗病蛋白质。结果与实施例3相同。
实施例1、2是不亲和结合(Incompatible combination)模式，即宿主的抗病蛋白质(抗病基因产物)与无毒的病原菌相结合生成不亲和反应;反之生成亲和反应(即宿主感病、病原菌有毒)。实施例之3、4是属于亲和结合(compatible combination)模式，即宿主的感病蛋白质与有毒的病原菌相结合生成亲和反应;反之生成亲和反应(即宿主抗病、病原菌无毒)。因此，我们的抗病方法对农作物两个抗病模式均为适用。
参考文献[1]James e.Seed.Sci & Technol.(1981)G679-685.Bennetzen，J.L.etal.Nature(1988)332369-370)。Gabriel，D.W.& Ellingboe，A.H.Physiol Plant Pathology(1982)20349-357.倪万潮等小麦霉病品种特异性抗病蛋白质的初步鉴定。
中国农业科学(1990)，23第3期(出版中)。
权利要求
1.一种农作物抗病品种的检出方法，其特征在于用抗病或感病器种的蛋白质提取物或部分纯化的蛋白质提取物制剂与各不同的病原生理小种(生理性或菌株)之间的特异性相互作用，检出抗病蛋白质。
2.权利要求1中的抗病或感病蛋白质提取物或部分纯化的蛋白质提取物制剂，其特征在于用正辛醇的纯化步骤，使抗病或感病品种的蛋白质富集于正辛醇，达到检出方法简便可行。
全文摘要
本发明是一种农作物抗病蛋白质的检出方法。用简便有效的步骤使抗病蛋白质富集于制剂中，并将制剂与各不同的病原生理小种(生理型或菌株)产生特异性的相互作用，检出抗病蛋白质，用常规的方法可从抗病蛋白质检出相应的抗病基因。本发明可大大促进抗病新品种的培育和分子生物学的研究。
文档编号G01N33/50GK1054313SQ9010097
公开日1991年9月4日 申请日期1990年2月23日 优先权日1990年2月23日
发明者曾以申 申请人:中国科学院上海生物化学研究所