专利名称：人胎盘泌乳素诊断试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断血球、单向免疫扩散板，具体地说是涉及人胎盘泌乳素(HPL)的诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法和应用。
人胎盘泌乳素(HPL)是由胎盘合体滋养层细胞分泌的，测定孕妇血中HPL的含量，能反映胎盘体积和功能的变化，目前多采用放射免疫法，虽测值可信，但由于放射性衰变和需要贵重的医疗设备，不易普及基层医院。
本发明的目的是提供一种在孕晚期、足月或过期妊娠情况下，测定HPL值的诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法和应用。
本发明中人胎盘泌乳素(HPL)诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法采用如下步骤1HPL的提纯1.1饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，离心3000-6000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，4000-10000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。
1.2 sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用HPL血球试剂检查各管浓度，收集HPL高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。
1.3 HPL偶联sepharose4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose4B10-40ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入HPL抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH6-8)洗脱，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。
1.4抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与HPL抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐HPL样品5ml加入抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为HPL纯品。
2．HPL抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴结周围多点注射，HPL抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml,(每千克体重50-400μgHPL抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。
3．人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％血球，将HPL IgG分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应1-3小时，经含有0.1-3％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出HPL冻干诊断血球。
5．将HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积煮沸后冷却40-70℃的1-4％琼脂液，混合均匀铺板。琼脂厚度1-4mm，打孔直径1-5mm，孔距0.5-3cm。
本发明制备的HPL的鉴定1.8％聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，常规制备分离胶与浓缩胶，取50μg提纯的HPL纯品进行聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，电流2mA/管，用1％氨基黑染色呈现一条带。
2．免疫电泳结果表明本室提纯的HPL只与HPL抗血清和妊娠全血清呈现一条免疫沉淀弧。
3．双向免疫交叉试验结果表明提纯的HPL与抗HCG，抗AFP，抗SP，抗人全血清无免疫沉淀线，而与抗HPL血清和抗妊娠全血清有明显的沉淀线，从而表明所提纯的HPL为胎盘泌乳素纯品。
以上三种方法按“实验免疫学技术”介绍的方法进行。
4．检查单向免疫扩散板非特异性取非孕妇女血清9份，男性血清9份，分别加入HPL单向免疫板琼脂孔内各30μl，放置37℃恒温24小时判定结果，均无沉淀环出现，说明HPL单向免疫板无非特异性反应。
5．稳定性检查将HPL单向免疫板存放4℃不同月份进行比较，每批均加入相同样品各30μl，放置37℃恒温24小时进行观察，发现放置6个月以内的免疫板，其沉淀环大小和清晰度无差别，而放置6个月以上的免疫板，沉淀环清晰度略差，由于免疫板放置时间过长，导致HPL抗血清失活。经观察比较，免疫板使用期限应在6个月以内为宜，每批使用前，均用HPL标准进行质量检测。
下面结合实施例详细叙述本发明。
1HPL的提纯1.1饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌30分钟，离心4000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，5000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。
1.2 sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速60ml/h以每管5ml分别收集洗脱液，应用HPL血球试剂检查各管浓度，收集HPL高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。
1.3HPL偶联sepharose4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose 4B30ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在11左右，反应10分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH9)透析的HPL抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入HPL抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4)洗脱，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集HPL高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。
1.4抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与HPL抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐HPL样品5ml加入抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为HPL纯品。
2．HPL抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗20mg,10天后向淋巴结周围多点注射，HPL抗原加福氏完全佐剂2ml,(每千克体重150μgHPL抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。
3．人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成5％血球，将HPLIgG分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在45℃恒温振荡水浴下反应1.5小时，经含有1％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出HPL冻干诊断血球。
5．将HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积煮沸后冷却56℃的2.4％琼脂液，混合均匀铺板。琼脂厚度3.0mm，打孔直径4.0mm，孔距1.5cm。
本发明应用实施例取10μl孕妇血清用1ml盐水稀释成100倍等待检测用，在V型微量血凝板上，从第1孔到第5孔各加样品稀释水25μl，取100倍稀释的血清25μl加到第1孔，用微量加样器从第1孔起依次做2倍稀释到第4孔，第5孔为空白对照，冻干HPL诊断血球用血球稀释水2ml溶解并摇匀，4℃过夜放置后应用，取25μl稀释血球从第1孔到第5孔各加25μl，震匀后放37℃，1小时取出判定结果。
判定标准孕妇血清中HPL能与HPL抗体致敏血球出现凝集反应(阳性)，反之，如血清中不含有或浓度较低，则不出现凝集(阴性)，依据出现血球凝集的血清最大稀释倍数乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可确定血清中HPL的浓度。
判定方法血球全部沉入孔底为阴性，根据凝集程度分为1-4各阶段，凝集在2以上可判定为阳性。
计算公式血清中HPL含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀释倍数×诊断血球的敏感度(μg/ml)。
用毛细玻璃管取孕妇耳垂血0.1ml，分离出血清，用微量加样器吸取15微升加入琼脂孔内(注意不要溢出孔外)，加样完毕后，放置20-30分钟，待孔内血清沉淀完后再补加15微升血清，总计为30微升，盖好塑料板，水平放人温盒内，在37℃条件下扩散24小时观察结果，分别记录所测样品的免疫沉淀环直径(mm)，从标准曲线上可查出HPL值，即得该样品的HPL含量。通过应用HPL标准品标定出血球敏感度为0.025μg/ml，确定孕38周以上大于5μg/ml为正常值，5μg/ml为警界值，小于5μg/ml为危险值。其中标准曲线的制备方法是在琼脂板孔内分别加入4个不同浓度的HPL标准液，每孔加样30μl，放人37℃恒温24小时后观察沉淀环直径，发现选择150倍稀释后所做的琼脂板，免疫沉淀环直径比较清晰，其扩散环直径分别为9mm、6.5mm、5.2mm、4.7mm，以标准含量为横坐标，标准液免疫沉淀环直径为纵坐标，绘制标准工作曲线。(参考德国Benring研究所的HPL标准)
权利要求
1.一种人胎盘泌乳素诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法，该方法采用如下步骤(1)HPL的提纯(1.1)饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，离心3000-6000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，4000-10000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。(1.2)sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用HPL血球试剂检查各管浓度，收集HPL高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。(1.3)HPL偶联sepharose4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose4B10-40ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入HPL抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH6-8)洗脱，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。(1.4)抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与HPL抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐HPL样品5ml加入抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为HPL纯品。(2)HPL抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴结周围多点注射，HPL抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml,(每千克体重50-400μgHPL抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。(3)人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。(4)HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％血球，将HPLIgG分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应1-3小时，经含有0.1-3％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出HPL冻干诊断血球。(5)将HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加人等体积煮沸后冷却40-70℃的1-4％琼脂液，混合均匀铺板。琼脂厚度1-4mm，打孔直径1-5mm，孔距0.5-3cm。
2.一种人胎盘泌乳素诊断血球、单向免疫扩散板在判定胎盘功能方面的应用。
全文摘要
一种人胎盘泌乳素诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法和应用,是应用免疫学原理,从人胎盘提取HPL,经两次亲和层析后获得高纯度的HPL,分别制成诊断血球和扩散板,本发明的HPL纯品为单一成份,无非特异性,并与HPL抗血清有免疫反应,而与抗HCG、抗AFP、抗人全血清无免疫反应,应用本发明,方法简单,操作方便,性能稳定,结果准确,一般实验室均可操作,在临床上对妊娠高血压综合症、胎儿发育迟缓、死胎、过期妊娠等异常疾病的诊断有较大参考意义,是围产期监护的最佳诊断试剂。
文档编号G01N33/554GK1289926SQ99113260
公开日2001年4月4日 申请日期1999年9月24日 优先权日1999年9月24日
发明者王晓东 申请人:吉林省计划生育科学技术研究所