专利名称：用于研究流道的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于研究(investigate)流道(流动管道，flow conduit)的装置。具 体地，本发明涉及可以适用于研究小尺寸的流道，如可灌注软材料样品或者小的可存活或 非存活生物脉管段的装置，如基于芯片的装置或芯片实验室(lab-on-a-chip)装置。
背景技术：
高血压是一种达到流行比例的致死性病症。高血压的全球负担预期增加60%，即 从 2000 年的 26. 4% (9. 72 亿人)增加到 2025 年的 29. 2% (15. 6 亿人)[Kearney,P. Μ. et al. , Lancet, 2005, 365 (9455) :P. 217-223] 尽管传统上认为高血压为老年性疾病，但是在 加速其发作和严重化的多种遗传和生活方式因素的影响下，现在在年轻人中也很常见。高 血压是许多疾病的主要风险因子，包括心脏病、中风和肾衰竭。由于目前我们对高血压的理 解仍然不涵盖其固有复杂性，所以绝大多数高血压患者都是根据症状进行治疗，而不是根 据病因进行治疗。应该推进对于高血压的认识以便改善这种情形。有一种正在提高的共识 在于，高血压主要与主要源于血管树末端部中的小阻力动脉而升高的外周血管阻力相关。关于血管结构和功能的现有认识主要来源于利用更易于进入的大的无阻力动脉 的实验。遗憾的是，在大管道和小阻力动脉之间以及在来自不同血管床的阻力血管之间存 在着功能性差异。研究小阻力血管，很大程度上是由于通过实验处理它们需要大量技术技 能。由于更好地理解调节阻力血管结构和功能的机制是改善治疗高血压策略的关键，所以 需要便于处理阻力动脉的技术。在利用这样的小动脉尝试进行其他研究时，例如在研究对 其他刺激(如药物)的结构反应中也遇到类似的挑战。这些挑战也存在于其他类似的流道 (如在肺、胰腺和其他器官中发现的小管)的研究中。目前的方法和过程利用基于细胞的筛选、遗传分析和药理学工具并结合动物模型 以鉴别、测试和评估潜在药物产品的安全性和效力。因此，该过程相对较长并且在进行人体 试验之前仅有约千分之一的临床前鉴别获得成功。目前的方法经常是费时的，需要管理和对于研究人员进行培训，并且经常导致可 用于研究的血管的百分比较低。对于研究这些小流道提供有效且标准化的方法仍然是个挑 战。可应用于其他生物学流道、以及人工或工程化流道对于这些难题的解决方案将是有用 的。

发明内容
人们期望提供一种解决上述挑战中的至少一些的能够用于研究流道的装置。如果 这样的技术能够成规模(根据比例改变大小，scalable)将是期望的。还期望一种用于监 测这些流道对于治疗的反应，例如它们对于药物化合物的反应的方法和装置。本发明描述了一种用于研究流道的装置。该装置使得流道，包括小的可存活或非 存活生物学管道(例如阻力动脉)能够在生理条件下被可逆地或不可逆地加载、固定和灌 注。该装置可使得人、动物和植物来源的流道或人工管道在芯片或微装置，例如微流体芯片或芯片实验室装置上进行固定和灌注。该装置可以提供对于流道的功能分析和器官培养相 对优化的微环境、相对困难的管道插管(carmulation)过程的自动化、以及利用小且脆弱 的管道进行常规研究的能力。该装置可以允许流道的结构和反应(响应，response)测试，例如在治疗产品的鉴 别中。该装置可以用来测试来自动物、人、植物和其他有机体的流道。流道可以来自任何 器官，并且可以包括人工或工程化管道。流道可以包括在有机体中发现的管道，如脂小管、 工程化血管、中空纤维、动脉、小动脉、静脉、小静脉、淋巴管、肠、输精管、输卵管、胆管、支气 管、细支气管、气管、或任何其他类似的结构，以及在植物中发现的结构。该装置也可以通过 利用它们的代表性管道而使得能够在对于某些药物、疾病、病症或治疗的筛选或评估中用 于一个个体或多组个体的靶向治疗或个性化治疗。该装置可以是根据比例改变大小的和/或多路复用的(multiplexed)，可由接受 相对最低程度培训的人员来处理并且与通常用于这些研究的其他装置相比可以降低每个 实验单元的成本。通过能够实施统一处理，不管使用者的技能如何，该装置都可以促进标准 化。相反，之前开发的用于阻力动脉分离和培养的传统实验程序[例如，如在Bolz SS et al. ，J Vasc Res, 2003. 40 (4) :ρ· 399—405 禾口 Bolz SS et al. ，Am J Physiol Heart Circ Physiol. ,2000. 279(3) :p. H1434-9中披露的]通常需要在显微解剖技术和专业化设备方 面接受过相对较高程度的培训的技术人员。在一些方面，提供了一种用于研究流道的装置，包括基座；以及在该基座中形成 的模块，该模块包括流道的主通道(main channel)，该主通道具有用于加载流道的加载入 口 ；用于流道的灌注和表面灌流(superfusion)中的至少一种的在主通道中的培养室；用 于在沿着流道长度的至少两个固定位置处提供流道固定的与主通道连通的至少两条固定 管线(fixation line)。在一些方面，提供了一种研究流道的方法，包括提供上述装置；将流道加载到主 通道中；将流道固定在主通道中，其中流道的至少一部分在培养室中；用生理溶液对该流 道进行灌注或表面灌流；以及随时间监测流道。所述装置可以包含多个模块(例如串联或并联布置)，并且可以另外地包括用于 溶解流道的至少一部分的溶解室(lysis chamber) 0该装置可以用于研究小血管的结构和 功能特性。另外，该装置可以用于研究血管发生和与血管有关的其他病症，以及其他生物学 流道或非生物流道。该装置可以用于个性化药剂，以及用于开发药物产品(pharmaceutical product)ο


现在将参考附图，其通过本发明的示例性实施方式示出，并且其中图1示出了在一种用于研究流道的装置的模块的示例性实施方式中加载流道的 示意性实例；图2示出了一种用于研究流道的装置的示例性实施方式的照片；图3示出了一种用于研究加载有动脉的流道的装置的示例性实施方式的照片；图4示出了一种用于研究在动脉灌注中使用的流道的装置的示例性实施方式的 照片；
图5示出了在一种用于研究流道的装置的示例性实施方式中的流道的固定的示 意性实例；图6示出了在一种用于研究流道的装置的示例性实施方式中的流道的固定的示 意性另一个实例；图7-图M示出了一种用于研究具有不同布图设计的流道的装置的示例性实施方 式；图25-图27示出了一种用于研究具有串联设计的流道的装置的示例性实施方 式；四示出了一种用于研究具有并排设计的流道的装置的示例性实施方 式；图30示出了一种用于研究具有集成光纤的流道的装置的示例性实施方式；图31示出了举例说明利用用于研究流道的装置测得的对苯肾上腺素的动脉反应 的图表；图32示出了举例说明在用于研究流道的装置中肠系膜血管的收缩的图表；以及图33示出了举例说明在用于研究流道的装置中在动脉上的比率测量值的图像和 图表。应当注意，在全部附图中，相同特征用相同的标号指明。
具体实施例方式描述了一种用于研究流道的装置。该装置可以至少提供(i)对于生物学流道的 功能分析和器官培养的相对优化微环境，(ii)其他相对困难血管插管过程的自动化，以及 (iii)常规地研究极小且脆弱的管道(如阻力动脉)的能力。通过世界范围内的实验室和 医院提供的(信息)，这些在构建基于人微循环的高血压数据库中可以是重要的要素。这种 装置可以在从微血管的数据收集中提供建立全球标准的潜在有效手段。一般而言，这种装置具有基座以及在基座中蚀刻、嵌入、模制、激光加工或其他方 式形成的模块。该模块包括流道的主通道、用于流道灌注和/或表面灌流的在主通道中的 培养室、以及用于沿其长度固定流道的与主通道连通的至少两条固定管线。主通道通常具 有用于加载流道的加载进口。在一些实施例中，加载进口连接于在装置上形成的加载孔 (loading well)，以有利于流道的加载。现在参考图1，其示出了一种用于研究流道的装置的模块的示意性示例性实施方 式，更具体地示出了将流道固定在模块中的示例性方法。还示出了显示在装置的不同点处 的压力的图表。a)示出了例如利用低压或抽吸方法，用于流道的可逆固定的示例性实施方 式的示意图。如上所述，模块具有带有加载进口 4的主通道1。有两对固定管线2，一对位 于培养室5的一端，用于固定流道6 (如小血管)的末端。这里，培养通道3可以向培养室 5供料和从培养室5供料，例如用于向流道6提供器官浴槽。培养通道3可以允许对流道6 进行表面灌流。在其他示例性实施方式中，培养室5可以具有向环境的开口并且可以直接 通过该开口进行供料，在这种情况下，培养通道3可以不是必需的。在这个实施例中，主通 道1、加载进口 4、固定管线2和/或培养通道3可以是微通道。该示意图旁边的压力分布图示出了作用于流道6上的相对压力。在这个实施例
7中，加载进口 4向环境压力Pa开放(例如，加载进口 4可以向培养皿(Petri dish)开放并 从该培养皿加载流道6)。可替换地，模块可以是密闭构造，对其可以实现P4 Φ Pa(例如，加 载进口 4可以连接于另一模块的通道，这将在下文中描述)。对于该实施例，流道6可以通过首先封闭培养通道3和固定管线2而加载。控 制血管加载和灌注过程的注射泵可以连接于主通道1，与加载进口 4相反，并且以“缩回 (withdraw)”或抽吸模式进行操作。流道6可以由此被拉向其在培养室5中的最终位置。 一旦流道6已到达期望位置，则可通过主通道1的充分变窄和/或停止通过主通道1的缩 回过程而防止其发生进一步的移动。然后可以关掉注射泵。在培养室5的两端处，可以通 过固定管线2施加(I^2)抽吸压力(其可以是预定的)。这可以是通过将固定管线2连接 至液体填充管(来实现)，该液体填充管连接于低于培养室5的液静压水平。考虑到流道 6的长度通常较短且灌注速度通常较慢，在血管6每一端处通常存在可忽略的压力差(即， P1 ^ P4) ο虽然可以在固定管线2处施加抽吸压力，但是压力差(即，P1-P2和P4-P2)会在两 个血管末端处提供相对有效且可逆的固定机制。因此，通过低压力、真空或抽吸就意味着在 固定管线2处施加的压力低于在流道内部和外部处(例如，在培养室中)的压力。这种方 法不必局限于使用真空或抽吸源。然后可以对流道6进行研究。例如，固定的流道6可以 经由培养通道3表面灌流和/或经由通过培养室5的液流(例如通过主通道1从进口 4流 入的液流)进行灌注。跨壁压(transmural pressure)(例如P1-P3)可以横跨流道6的壁 建立。为了从模块释放流道6，可以使固定管线2中的压力增大至Pp这可以在两个血管 末端处释放可逆密封并且可以通过加载进口 4卸载流道6。仍参考图1，b)和C)示出了用于不可逆加载流道，例如利用聚合或组织粘合剂进 行固定的装置的一个实例。b)和c)的模块也具有如上文所述的带有加载进口 4的主通道 1、具有培养通道3的培养室5。该模块具有如下文描述的稍微不同布置的固定管线加和 2b。不同于如a)中那样利用抽吸方法固定流道6如血管，b)和C)的实例可以利用不 可逆粘结剂，如聚合物(例如，暴露于光时发生交联的聚合物、与湿气接触时发生交联的聚 合物(组织粘合剂)、或温度改变时发生交联的聚合物(如纤维蛋白或Matrigel ))，或者 其他方式诱导的固化化学反应而不可逆地固定流道6。未固化的聚合物或组织粘合剂可以 通过固定管线2a(例如，在超过？工的压力下)引入，例如利用注射泵以恒定流速，导致升高 的进口压力。在该示例性实施方式中，为了防止其中培养室5中粘结剂溢出的情形，可以在 固定管线2b处除去恒定流速。这可以确保流道6仅固定在一个期望位置。粘结剂可以在 其接触流道6的情况下固化，例如通过在光聚合物上利用UV光，或者简单地通过与组织接 触。一旦固化开始，就可以停止从固定管线加的供料流。类似的程序可以用来固定流道6 的两端。然后可以研究流道6。对于这个示例性实施方式，流道6可以为不可从模块释放 的。例如，实施例b)和c)示出了粘结剂的引入，用于不可逆地固定流道6。b)示出了将粘 结剂(灰色)，如组织粘合剂引入到固定管线加中。c)示出了连续引入粘结剂及其通过固 定管线2b的去除。如c)中所示，粘结剂仅在不同点处选择性地接触流道6，以使得流道6 的内腔保持开放。粘结剂在接触点处可以发生硬化或固化，例如通过化学反应如在接触湿 气时，由此使流道6不可逆地固定。这种装置可以适用于研究动物和人中的各种流道，包括从脑、肺、内耳和其他器官
8分离(例如，通过生物活检)的血管。除了血管之外，其他流道可以利用该装置进行调节 (accommodate)或研究。其他可能的流道包括脂小管、工程化血管移植物、中空纤维、动脉、 小动脉、静脉、小静脉、淋巴管、肠(例如，十二指肠、空肠(jejunal)、回肠和结肠)、输精管、 输卵管、胆管、支气管、细支气管、气管导管、输尿管、尿道、胰管和肾小管。在植物如在木质 部中发现的脉管也可以利用该装置进行研究。也可以对人工或工程化流道(例如工程化血 管)进行研究。流道的尺寸范围可以为直径约3微米至约2，000微米，更具体地为约15微米至约 300微米，并且长度为约10微米至约1. 5厘米。这些流道可以分离自健康组织或患病组织， 例如为了研究梗塞的、缺血的、发炎的、硬化的、免疫缺乏的(immime-compromi sed)、来自肿 瘤的或转移组织的血管。流道可以以约0-500ml/hr的速度进行灌注，或者以约0_500ml/hr的速度表面灌 流。“灌注”是指流体通过流道内腔的移动；“表面灌流”是指流体沿着流道或在流道外部 上方的移动，不管是轴向地沿着流道的长度还是横向地围绕流道的圆周移动。两种类型的 流体移动都可以在培养室中存在。灌注和表面灌流可以用于在培养室中向流道提供和从流 道提供营养物和其他化合物(例如，可溶性因子、染料或药学试剂)。在一些情况下，灌注 或表面灌流之一可能是更优选的。所述装置可以包括传感和测量灌注和/或表面灌流的传 感器。例如，可将压降传感器集成在所述装置上(例如，利用压阻压力换能器)，其可以提 供灌注和/或表面灌流的指示。尽管所述装置被描述为提供用于流道的灌注和/或表面灌 流，但是应当理解，所述装置也可以在其中既没有灌注也没有表面灌流的情况下、或者其中 流道置于静流条件下的情况下使用。培养室也可以称为“灌注室”或“表面灌流室”，并且培 养通道也可以称为“灌注通道”或“表面灌流通道”；这样的称谓不会将所述装置的这些组件 的应用仅局限于灌注或表面灌流，也不会将培养通道和培养室局限于递送培养介质。模块可以利用常用制造方法如复型模制、热压印、注塑模制、光刻(例如，X-射线 光刻)、电镀、模塑(例如LIGA)、干法蚀刻和湿法蚀刻、喷砂工艺和激光加工蚀刻、嵌入、模 制或其他方式形成在基座中。其他标准软光刻技术也是合适的[例如，如在Xia，Y. N. et al. ,Annual Review ofMaterials Science, 1998. 28 :ρ· 153-184 中描述的]。标准软光刻技 术可以用于各种各样的材料，例如硅树脂(例如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS))。通常，模块的 通道和结构可以蚀刻、嵌入、模制或其他方式形成在基座的一半表面上。该表面然后可以粘 结抵靠在(against)基座的另一半上，例如，利用诸如等离子体中的自由基表面活化并随 后粘结、溶剂粘结、挤压粘结或阳极粘结(anodic bonding)的技术。用于制造微装置的其他 常用方法和变形可以是合适的。所述装置可以由单层设计制成，或由两层或多层设计制成， 其中每个层提供模块的至少一部分或者连接于该模块的通道的至少一部分。多层设计可 以用于减小装置的必要尺寸，并且可以利用任何合适的方法进行设计和制造，例如，如在美 国专利公开 No. 2001/0029983,2001/0033796,2001/0054778,2002/0029814,2003/0019833 中描述的方法。所述装置可以由聚合物(例如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚苯乙烯、聚(甲基丙 烯酸甲酯)(PMMA)和生物聚合物如纤维蛋白原、胶原、层粘连蛋白以及它们的组合)、玻璃、 半导体(例如，硅或砷化镓)、金属、陶瓷以及它们的组合制成。所述装置可以由生物可降 解材料制成。例如，所述装置可以由可以用于研究血管发生的生物聚合物(如Matrigel )制成。通常，当被固定在装置中时，流道的至少一部分是可观察或可检测的，以使该管道 的变化可以被监测和/或测量。模块通常被蚀刻、嵌入、模制或其他方式形成在基座中，使 得大部分模块被封装(例如，除了进口和出口外)，然而模块的一些部分也可以是开放的。 例如，培养室可以至少部分地是开放的，使得研究人员能够直接向流道施加化合物或通过 其他方式刺激流道。除了培养室之外，模块可以包括溶解室(未示出)。溶解室可以设置在主通道中， 与培养室串联。溶解室可以类似于培养室，具有各条固定管线和溶解通道。实践中，流道可 以从培养室释放(例如，在流道可逆地固定的情况下)并向下游驱动(例如，通过在加载进 口处施加高压)直到它到达溶解室，在这里它可以通过固定管线再次被固定。可替换地，溶 解室可以不具有各固定管线，但可以足够大以容纳整个流道。可替换地，溶解可以在流动中 形成(即，在没有固定流道的情况下)。流道可以通过经由溶解通道引入溶解化合物(例 如酶)而被溶解。然后通过主通道中的出口或者通过加载进口从该装置提取所得的细胞和 /或亚细胞材料。可替换地，流道的溶解可以在没有使用溶解室的情况下发生，例如通过将 溶解化合物引入到培养室中。溶解室也可以仅接收流道的一部分。例如，流道的一部分可 以被去除用于溶解，如通过激光加工、抽吸或其他合适方式去除。溶解室也可以适合于仅适 合于配合流道的一部分，使得仅溶解室中包含的部分被溶解。使得仅一部分的流道(被溶 解)可以用于研究流道的某些期望部分，例如，仅仅是流道的平滑肌细胞。所述装置可以对各种通道具有不同的深度。例如，在管道固定点和培养室处可以 有两个不同的通道深度。这可以防止管道中心部和装置内部的顶壁或底壁之间发生不希望 接触。所述装置可以与分析仪器，包括显微镜(例如荧光显微镜或亮视野显微镜)、质 谱、或电泳连接(interface)。所述装置还可以设计成与基于荧光强度和荧光寿命成像、光 学光谱法、芯片上溶解或质谱法的设备连接。例如，连接于主通道的加载进口或另一出口可 以被设计成易于连接至其他分析仪器，以使装置中的流道或溶解的材料可以被直接提取到 分析仪器中。通过将注射泵(例如，用于培养通道和/或进口 )连接至计算机(例如，利用串行 端口 RS232、RS423、RS485、火线(firewire)、USB等)，灌注和/或表面灌流过程可以被自 动化。流道的反应(例如，跨壁压和/或动脉收缩状态)可以直接记录在装置上，例如通过 在装置上设置处理器(例如，微处理器)和/或存储单元。这使得该装置是便携的并且可 利用其进行自主式研究和分析。所述装置可以包括温度控制单元(例如，热电元件或电阻 元件)、或用于恒温流体的交叉流动液流的通道，从而使得在装置中的流道的研究或培养期 间固定的流道的温度受到控制(例如，维持在生理水平)。利用固定在装置中的流道，温度 可以降低至例如4°C。这可以例如使得固定在装置中的流道在被研究之前或之后被运输。 装置的尺寸可以被减小，或者可以添加其他仪器和组件以用于提供另外的功能。在装置与 计算机或其他计算装置通信的情况下，流道的监测可以自动地实施。在装置包括存储器的 情况下，所记录的数据，例如来自流道监测或研究的数据可以存储在该装置中。这种存储的 数据可以有线或无线地传输到用于分析的外部装置，如工作站或外部计算机。该装置可以用于研究小流道(例如阻力动脉)或大流道(例如肠系膜动脉)。一些流道可能需要机械刺激以保持存活。例如，肠系膜动脉在培养期间需要纵向拉伸(例如， 对于Imm长的肠系膜动脉段拉伸多达200微米)。这样的机械刺激可以经由培养室提供。 流道的末端可以连接至操纵器，从而机械拉伸该流道。这样的操纵器可以与该装置集成或 在该装置外部。可替换地或另外地，机械致动器可以附着或嵌入在该装置上。在一个示例性实施方式中，装置的基座可以是相对适应性的(compliant)或弹性 的以使其可变形。在与固定流道的长度对齐的方向上基座的拉伸可以转换为流道的机械伸 展。基座的这种拉伸可以通过位于流道一端处并设计成弯曲远离该流道的集成压电弯曲致 动器提供，由此引起长度方向的伸展。这样的致动器可以制造在装置的基座中，或者可以附 着于装置的表面上。可以使用其他类似的机械致动器。这种装置可以在流道上方提供完全的环境控制，同时长时间(例如，10天或更长) 保持其结构和功能完整性。利用这种装置，可以监测和研究流道的性能，包括收缩性能、离 子性能、电性能、分子性能和/或结构性能。在一些示例性实施方式中，所述装置可以包括要给予到流道中的化合物。例如，该 装置可以包括随时间释放到培养室中的活性化合物。在其他实施例中，装置中的化合物可 以通过手动或自动化机制给予到固定的流道中。实施例单樽块装置的实施例现在参考图2，其示出了一种在与动脉段一起使用时用于研究流道的装置的示例 性实施方式的照片。在这个实施例中，利用多层软光刻技术制造所述装置。通过进口(其 可以连接于加载孔)引入长度约Imm的阻力动脉段。在这个实施例中，如图2a)中所示，圆筒形动脉段通过进口“Α”由压力驱动流引导 至培养室，或者动脉检查区。然后通过在固定管线“E”处施加抽吸压力而固定该动脉。随 后，通过以下(方式)使该动脉段经受模拟生理条件的微环境(i)在动脉壁外部用液流 “B — C”选择性地表面灌流(例如经由培养通道)，(ii)用液流“A — D”灌注动脉内部(即 内腔)(例如经由主通道)，(iii)控制横跨动脉壁的压差以及(iv)将温度调整至37°C。表 面灌流/灌注液流的流速、压力和组成能够独立地进行调整。通过固定管线“E”来防止灌 注和表面灌流管线之间发生串扰(crosstalk)。仍参考图2，b)示出了在之前分离的血管或血管段刚刚加载到培养室中时的装 置。注意到，血管被加压并且仍然充有血液。加压至IOOmmHg引发通过血管内腔的流动以 使得内腔的血液随着时间被盐水溶液置换。c)示出了在用盐水灌注之后和在施加确定的跨 壁压之后具有开放内腔的血管。在这个实施例中，该装置也被称为芯片，并且培养室也被称 为器官浴槽(organ bath, OB)。装置的这种示例性实施方式具有75mm(L) X25mm(W) X4mm(H)的外部尺寸，这通 常是允许用常见直立式或倒置亮视野或荧光显微镜进行检查的尺寸。利用标准软光刻技术 将微通道设计由计算机辅助设计(CAD)文件转换成印刷的透明掩模。负性光刻胶(在这个 实施例中，为SU8-25 和SU8-2050 ，获自MicroChem，Newton，MA)的旋涂层预烘烤、利用透 明掩模暴露、后烘烤以及随后显影。将该反置微通道图案转移至聚(二甲基硅氧烷)模具。 将该光学透明的弹性材料模具从母版(master)上剥离，切割、粘结至另一弹性体层或利用 O2等离子体预清洁的载片。多层光刻允许在固定点和培养室处容纳两个不同的通道深度。由此防止动脉中心部和装置的顶壁/底壁之间不希望的接触。装置制造不限于作为结构材料的PDMS/玻璃，也不限于作为微制造方法的软光 刻。可以利用如公知的任何合适的用于微制造材料和方法。可替换地，该装置可以利用半 导体材料来制造，例如利用已确立的大体积硅加工技术的硅来制造。利用玻璃的制造可以 通过利用湿法蚀刻和/或干法蚀刻以及激光加工技术完成。也可以利用大范围的各种聚合 物来制造，包括生物相容性和可降解聚合物基质。可能的聚合物装置制造技术包括复型模 塑、热压印、注塑模制、喷砂和激光加工。在这个实施例中，装置连接于1/16”外径(OD)聚合物(例如，Tygon ，PEEK， Teflon )管系统(tubing)，其包括通过环氧连接或可逆歧管(例如，压缩密封)的流体灌 注、表面灌流和废液管线。该1/16”的OD聚合物管进一步用可逆流体管接头(union)(如来 自Upchurch Scientific OakHarbor, WA)连接，以便方便地从其与装有流体的小瓶和/或 手动控制的注射泵的连接处取下所述装置。不同的流体管线允许将流道加载到该装置中， 以在培养室中通过流道内部提供灌注以及流道外壁的表面灌流。现在描述将流道(在这种情况下为动脉)加载到所述装置的这种示例性实施方式 中的一种示例性过程。起初用牛血清白蛋白(BSA)溶液冲洗装置以防止动脉与主通道或培 养室的壁发生任何不希望的粘附。通过200微米宽和150-200微米深加载进口(例如，在 装置布图不包括加载孔的情况下)或从加载孔(例如，在装置布图包括连接于进口的加载 孔的情况下)将之前分离的阻力动脉(通常长l_2mm且直径为30-200微米)加载到装置 中。作为这里使用的动脉的可逆固定的一种替换，如上所述，可以使用不可逆固定方法。在固定(例如，使用可逆固定方法)之后，动脉的内腔通过以灌注模式操作性连接 于培养通道进口的注射泵进行灌注。通过将培养通道的进口和出口连接至不同液静压水 平，实现了通过培养室的流动同时保持横跨动脉壁的确定跨壁压差。通过用以灌注模式操 作、在培养通道进口处连接的第二注射泵表面灌流培养室，实现了通过培养室的流动同时 保持确定的跨壁压差(即，图1中的P1-P3)。培养通道的出口由此导致降低的液静压水平。 动脉内壁和外壁经受确定的跨壁压并用包含确定浓度的活性分子的3-(N-吗啉基)丙磺酸 (MOPS缓冲液)进行灌注。图3示出了加载有动脉的装置的示例性实施方式的照片。a)示出了利用传统 方法在玻璃微量移液管上插入导管的肠系膜动脉，其用缝合线保持在适当位置，并加压至 45mmHg。b)示出了加载到示例性装置的培养室中的肠系膜动脉，加压至45mmHg，并用经由 固定管线施加的抽吸保持在适当位置，在这个实施例中固定管线是注射器控制的低压通 道。图4示出了证实其在动脉灌注中的应用的装置是示例性实施方式的照片。将阻力 动脉加载到装置中并通过动脉的内腔用罗丹明染料(其显示红色)灌注，并在培养浴槽中 用荧光素染料(其显示绿色)实施表面灌流。a)示出了在荧光素基线水平下的动脉。在第 0秒，使用注射泵以4mL/h流速将荧光素注入动脉。b)示出了在第4秒时的动脉，当荧光素 到达额外的内腔空间时。c)示出了在第5秒时的动脉，当动脉进一步暴露于荧光素时。d) 示出了在第6秒时的动脉，当动脉在荧光素中充分浸泡时。这些照片还证实了在血管内腔 空间中的液体流动(即，灌注)与血管外部的液体流动(即，表面灌流)的分离。示例性布图
对于这种装置已经制备了某些设计和布图并且在以下描述的图中示出。在恰当的 情况下，放大模块以示出细节。这些实施例仅用于举例说明的目的而不用于限制。在这里描述的实施例中，在有两层或更多层的情况下，外部连接(例如，至注射泵 或低压源)用具有“X”的孔指示、并且上层和下层之间的连接用孔指示。在这些示意图中， 至培养室的进口和出口可以称为“器官浴槽”或“灌注”或“排干”，至固定管线的进口和出 口可以称为“抽吸”。任何这些标记都不以任何方式限制这些进口和出口或它们的各种通道 的可能连接和功能。例如，标记为“抽吸”的进口可以用来施加用于可逆固定流道抽吸，但 也可以用来给予用于不可逆固定流道的粘结材料。尽管未示出，但是装置可以具有多层布图，其中多个层中的一个或多个蚀刻的通 道或室是接触的(touching)-即，上层和下层的通道或室不是分离的，而是在这些层之间 为连续的。这可以使得具有一些较深的通道或室并同时保持装置上的其他通道或室保持相 对较浅。这种设计的一种变形可以通过将层数增加至三或更多而使得能够具有甚至更深的 室和/或通道。图5示出了在装置的示例性实施方式中流道固定的示意性实例。这里，示出了可 逆固定技术，其中虚线圆圈标记固定位置。a)和b)示出了在培养室每个末端处具有单个固 定管线的设计的实例。c)和d)示出了在培养室每个(末端)处具有多条固定管线的设计 的实例。图6是其中流道可以被不可逆地固定在装置中的示例性装置布图的示意图。具体 地，在a)中，流道(1)可逆地固定在两端(4)处使得流道的内部和外部区域彼此分离。在外 部区域处，流道可以进一步被聚合物⑵包覆。聚焦光可以例如通过嵌入的波导管或光纤 进行导向，并集中到流道的一个部分上。这种布置可以用于来自流道的样品的选择性去除 和随后的分析，并且也可以用于研究在确定条件下健康和患病血管中的血管网络的形成， 如将在下午进一步详细描述的。图7是示例性装置布图的示意图，示出了在没有加载浴槽的情况下的单层布图。 流道通过延伸至装置底角的主通道进入装置。两条固定管线可以单独地或分别地访问(进 入，access)或寻址(addressible)。存在用于表面灌流液流的一个培养通道和用于灌注液 流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。表面灌流液流横跨流 道流动。图8是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层布 图。上图示出了装置的顶流体层，而下图示出了底流体层。流道通过主通道中的加载孔进 入装置的底层。在模块每个末端处的两个固定点分别寻址。存在用于表面灌流液流的一个 培养室和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。 表面灌流液流横跨流道流动。图9是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层布 图。上图示出了装置的顶流体层，而下图示出了底流体层。流道通过主通道中的加载孔进入 装置的底层。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流液流的一条培 养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。 表面灌流液流在两个子液流(substream)沿着流道流动之前首先分开，然后在分开的出口 中由装置引导。一般地，表面灌流液流可以分流成两个子液流，其然后可以被引导而同时进入培养室的左侧和右侧。这种设计可以确保相对快速，培养室中内容物的无梯度置换，并且 还可以允许刺激流道的两侧。图10是示例性装置布图的示意图，示出了没有加载浴槽情况下的两层布图。上图 示出了装置的底流体层，而下图示出了顶流体层。流道通过主通道在底侧处进入装置的底 层。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流液流的一条培养通道和 用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。表面灌流 液流在两个子液流沿着流道流动之前首先分开，然后在分开的出口中由装置引导。图11是示例性装置布图的示意图，示出了在没有加载浴槽情况下的单层布图。流 道通过主通道在底侧处进入装置的底层。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在 用于表面灌流液流的一条培养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可 以单独地进行调整/控制。表面灌流液流在两个子液流沿着流道流动之前首先分开，然后 在分开的出口中由装置引导。图12是示例性装置布图的示意图，示出了在没有加载浴槽情况下的两层布图。上 图示出了装置的顶流体层，而下图示出了底流体层。流道通过主通道在底侧处进入装置的 底层。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流液流的一条培养通道 和用于灌注液流的一个进出口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。表面 灌流液流在两个子液流沿着管道流动之前首先分开，然后在分开的出口中由装置引导。图13是示例性装置布图的示意图，示出了在没有加载浴槽情况下的单层布图。流 道通过主通道在底侧处进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表 面灌流液流的一条培养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独 地进行调整/控制。表面灌流液流横跨流道流动，然后在分开的出口中由装置引导。图14是示例性装置布图的示意图，示出了在没有加载浴槽情况下的单层布图。流 道通过主通道在底侧处进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表 面灌流液流的一条培养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独 地进行调整/控制。表面灌流液流在两个子液流沿着流道流动之前首先分开，然后在分开 的出口中由装置引导。图15是示例性装置的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的单层布图。 这个实施例可以适用于研究150 μ m的流道，如150 μ m的血管。流道通过主通道中的加载 孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流液流的一条培 养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行调整/控制。 两个表面灌流液流在它们分成两个相等子液流之前通过扩散首先混合，然后沿着流道外侧 液流流动并在接合出口(joint outlet)中由装置引导。图16是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽情况下 的单层布图。这个实施例可以适合于研究120 μ m的流道，如120 μ m的血管。流道通过主 通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流 液流的一条培养通道和用于灌注液流的一个进口。两种液流的流速和压力可以单独地进行 调整/控制。两个表面灌流液流在它们分成两个相等子液流之前通过扩散首先混合，然后 沿着流道外侧液流流动并在接合出口中由装置引导。图17是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层布图。左图示出了装置的底流体层，而右图示出了顶流体层。流道通过主通道中的加载孔 进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。存在用于表面灌流液流的两条培养 通道和用于灌注液流的一个进口。表面灌流/灌注液流的所有单独的流速以及所得到的总 表面灌流液流和灌注液流中的压力可以单独地进行调整/控制。两个表面灌流液流在它们 分成两个相等子液流之前通过扩散首先混合，然后沿着流道外侧液流流动并在接合出口中 由装置引导。图18是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的单层 布图。在这个实施例中，存在用于培养室的左右侧的一条共用灌注管线和两条单独的表面 灌流管线。流道通过主通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻 址。表面灌流/灌注液流的所有单独的流速以及所得到的总表面灌流液流和灌注液流中的 压力可以单独地进行调整/控制。沿着流道轴的每一侧上，两个表面灌流液流(其可以是 不同的)在它们沿着流道外侧在相对侧处流动至通过扩散首先混合。图19是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层 布图。在这个实施例中，存在用于培养室的左右侧的一条共用灌注管线和两条分开的表面 灌流管线。左图示出了装置的底流体层，而右图示出了顶流体层。流道通过包含在底层中 的主通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。表面灌流/灌 注液流的所有单独的流速以及所得到的总表面灌流液流和灌注液流中的压力可以单独地 进行调整/控制。在沿着流道的轴的每一侧上，两个表面灌流液流(其可以是不同的)在 它们沿着流道外侧在相对侧处流动之前通过扩散首先混合。图20是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的单层 布图。在这个实施例中，存在一条共用的灌注管线。这种布图可以允许在轴向上施加的表面 灌流液流的浓度逐渐变化。流道通过主通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两 个固定点单独寻址。表面灌流/灌注液流的所有单个的流速以及所得到的总表面灌流液流 和灌注液流中的压力可以单独地进行调整/控制。两个表面灌流液流(其可以是不同的) 在它们沿着流道的轴经过不同部分之前通过扩散首先混合。对于存活的流道，这种设计可 以允许产生在流道生理环境中不会被发现的微环境。图21是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层 布图。在这个实施例中，存在一条共用的灌注管线。这种布图可以允许在轴向上施加的表 面灌流液流的浓度逐渐变化。左图示出了装置的底流体层，而右图示出了顶流体层。流道 通过在位于底层中的主通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻 址。表面灌流/灌注液流的所有单独的流速以及所得到的总表面灌流液流和灌注液流中的 压力可以单独地进行调整/控制。两个表面灌流液流(其可以是不同的)在它们沿着流道 的轴经过不同部分之前通过扩散首先混合。对于存活的流道，这种设计可以允许产生在流 道生理环境中不会被发现的微环境。图22是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层 布图。在这个实施例中，存在一条共用的灌注管线。这种布图可以通过两个子液流的扩散 混合而允许表面灌流液流中的浓度随时间发生变化。左图示出了装置的底流体层，而右图 示出了顶流体层。流道通过在位于底层中的主通道中的加载孔进入装置。在模块每个末端 处的两个固定点单独寻址。表面灌流/灌注液流的所有单独的流速以及所得到的总表面灌流液流和灌注液流中的压力可以单独地进行调整/控制。两个单独的表面灌流液流在它们 到达(meet)流道外部之前通过扩散首先混合。两个分开的灌注液流在它们到达流道内部 之前通过扩散首先混合。图23是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的两层 布图。在这个实施例中，存在两条灌注管线，允许两条灌注液流在没有混合的情况下彼此接 触。这种布图可以通过两个子液流的扩散混合而允许表面灌流液流中的浓度随时间发生变 化。左图示出了装置的底流体层，而右图示出了顶流体层。流道通过在位于底层中的主通道 中的加载孔进入装置。在模块每个末端处的两个固定点单独寻址。表面灌流/灌注液流的 所有单个的流速以及所得到的总表面灌流液流和灌注液流中的压力可以单独地进行调整/ 控制。两个分开的表面灌流液流在它们到达流道外侧之前通过扩散首先混合。两个分开的 灌注液流在最小扩散混合的情况下在相对侧处到达流道内侧。对于存活的流道，这种设计 可以允许产生在流道生理环境中不会被发现的微环境。图M是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽的单层 布图。在这个实施例中，存在一条共用的灌注管线。可以有允许可以通过扩散而混合的不 同表面灌流液流的三条不同的表面灌流管线。流道通过主通道中的加载孔进入装置。在模 块每个末端处的两个固定点单独立寻址。表面灌流/灌注液流的所有单个的流速以及所得 到的总表面灌流液流和灌注液流中的压力可以单独地进行调整/控制。三个分开的表面灌 流液流在它们到达流道外侧之前通过扩散首先混合。多模块设计除了单个模块设计之外，可以在单个装置上设置多个模块。这些模块可以以串联 布置、并排布置、网状布置或其他多路布置形成在基座中。串联模块的实施例两个或更多个模块可以串联布置在装置上。除了具有共用的主通道和共用加载进 口外，每个模块可以在功能上类似于上述的单个模块。在一些示例性实施方式中，这些模块 可以在没有共享共用主通道或共用加载进口的情况下串联。流道可以依次加载到每个模块 中并利用在每个模块处的固定管线固定。每个模块可以共享相同的灌注泵、表面灌流泵和 /或低压源，以使每个模块中固定的流道可以基本上经受相同条件。可替换地，每个模块中 的流道可以经受不同的条件，如通过利用单独的灌注泵，其例如可以允许向一个模块的培 养室灌注化合物，但不向任何其他模块的培养室灌注。流道的加载、固定、研究和卸载可以与上文所述相同。通常，流道可以顺序加载，其 中在第一条流道加载和固定在离加载进口最远的模块中之后，将下一条流道加载到较近的 模块中。图25是示例性装置布图的示意图，示出了没有加载浴槽情况下的两层布图。有串 联的两个模块。两条短流道或在所有固定位置上延伸的一条长流道可以通过位于底层中的 主通道进入装置。在这个实施例中，有一条共用灌注管线、(多条)单独的固定管线和两条 分开的表面灌流管线。单条流道或相同流道的(多个)单独的部分(例如，在流道足够长 的情况下)可以横跨其轴进行表面灌流。图沈是示例性装置布图的示意图，示出了具有用于加载流道的加载浴槽情况下 的两层布图。有串联的两个模块。两条短流道或在所有固定位置上延伸的一条长流道可以通过在位于底层中的主通道中的加载浴槽进入装置。在这个实施例中，有一条共用灌注管 线、(多条)单独的固定管线和两条分开的表面灌流管线。单条流道或相同流道的(多个) 单独部分(例如，在流道足够长的情况下)可以横跨其轴进行表面灌流。图27示出了示例性装置布图的不同示意图，具有用于加载流道的加载浴槽情况 下的单层布图。这些示例性布图具有串联的两个模块。两条短流道或在所有固定位置上延 伸的一条长流道可以通过位于底层中的主通道进入装置。在这个实施例中，有一条共用灌 注管线、(多条)单独的固定管线和两条分开的表面灌流管线。单条流道或相同流道的(多 个)单独部分(例如，在流道足够长的情况下)可以横跨其轴进行表面灌流。尽管这些实施例示出了仅有两个模块串联，但是对于本领域技术人员来说应当清 楚，所述装置能够被设计成串联的更多个模块。在一些实施例中，串联的模块可以共用一个 共用培养室。即，一个共用的较长培养室可以利用沿着该培养室长度的多于两个的用于固 定多条流道或一条流道的多个部分的固定点加以使用。这种装置的串联设计例如可以用于实施生物测定，以及用于研究愈合过程。例如， 在生物测定中，药学试剂可以仅给予上游动脉(即，靠近加载进口的动脉)并且可以观察对 下游动脉(即，远离加载进口的动脉)的影像。对于研究动脉的愈合或接合，可将两个或更 多个单独的动脉加载到连续模块中并用相邻末端之间的小间隙固定。可以随着时间观察单 独的动脉末端的生长和接合，以及各种试剂在促进这样的生长中的效力。并联樽块的实施例两个或更多个模块可以平行并排布置在单个装置上。这些模块可以具有类似的连 接并且功能上可以与上述单个模块类似。这些模块可以共用相同的灌注泵、表面灌流泵和/ 或低压源，以使在每个模块中固定的流道可以基本上经受相同的条件。可替换地，每个模块 中的流道可以经受不同的条件，如通过利用单独的灌注泵，其例如可以允许向装置上的一 个模块的培养室灌注化合物，而不向任何其他模块的培养室灌注。这些模块可以共用一个 共用培养室和培养通道。即，这些模块的每一个的培养室和培养通道可以连接在一起。流 道的加载、固定、研究和卸载可以与上述相同。图观示出了示例性装置布图的不同示意图，具有在没有用于加载流道的加载浴 槽情况下的单层布图。这些示例性布图具有并联的两个模块。两条流道可以通过(多条) 单独的主通道进入装置。在这个实施例中，存在一条共用灌注管线、(多条)单独的固定管 线和(多条)分开的表面灌流管线。在每个模块中固定的两条流道可以横跨它们的轴用 (多个)单独的液流实施表面灌注。图四示出了示例性装置布图的不同示意图，具有在存在用于加载多个平行流道 的单独的相互连接的加载浴槽情况下的两层布图。流道可以通过位于底层中的(多条)单 独的主通道进行加载。这些示例性布图每一个具有并联的八个模块。尽管仅示出了并联的两个或八个模块，但是对于本领域技术人员来说应当清楚， 所述装置能够被设计成具有不同数量并联的模块。这种装置的并联设计可以用于确保被研究的流道在基本上相同时间经受相同条 件。例如，可以期望在基本上相同时间在相同条件(例如，培养基、流动条件)下从大量动 脉获得结果以用于统计目的。以并联布置在相同装置中固定所有的动脉可以在相同条件 下，允许所有这些动脉在相同时间一起测试。并联布置也可以用于使测试程序自动化，因为
17并联流道可以简单地通过一个接一个地驱动装置模块而在进程中通过一个接一个地步进 (例如，在自动化分析仪中)。除了上述串联和并联布置之外，其他多路布置也是可能的。例如，串联和并联布置 可以组合从而在单个装置上获得模块的矩阵布置。模块也可以以分支状网络、环状网络或 任何其他期望的布置进行布置。在所有情况下，一些或所有模块可以具有分开的培养室或 者它们可以共用培养室和培养通道。一些或所有模块可以具有单独的灌注泵、表面灌流泵、 低压源以及其他进口和出口，或者这些可以在一些或所有模块之间被共用。模块可以都采 用相同的固定方法(例如，可逆或不可逆的)，或者它们可以使用不同的固定方法。利用集成光纤的实施例图30示出了具有集成光纤的装置的示例性实施方式。这里，该实施例具有在有 加载浴槽情况下的单层布图。单模或多模光纤可以通过例如连接至装置一角的直通道 插入。小透镜可以嵌入到模块中(例如，如在“PDMS2D optical lens integrated with microfluidic channels !principle andcharacterization，，Camou S,Fujita H,Fujii T, Lab on a Chip 3 (1)，40-452003中描述的)，以将由光纤发射的光聚焦到主通道内的一个 位置。这种设计可以允许激光经由光纤被引导朝向固定的流道。例如，这样的构造可以 用于血管发生研究以将确定的损伤精确地设置为用于血管内腔外的内皮细胞随后生长的 必要条件或引发剂。在这个实施例中，单模或多模光纤或波导管30可以被嵌入到装置中以 将来自激光器的光引导到装置中。脉冲激光器(例如，脉冲Nd:YAG或超速脉冲激光器)或 连续式激光器是可能的激光源。离开光纤或波导管30的光可以通过装置中的透镜被聚焦 朝向血管壁，在那里它会精确地引起确定的损伤。^M本装置可以设置在芯片或微装置上，例如，作为微流体芯片或芯片实验室。这可以 使得许多测定和试验小型化和规模化(根据比例改变大小，scaling)，使其具有高通量。例 如，在WO 2003/078606 (Bolz)中描述的程序可以利用本装置实现，并且即使是接受过相对 较低程度培训的技术人员也可以相对较容易和更有效地实施。一般地，该装置可以用于研究流道。流道可以被加载到主通道中并利用培养室中 流道的至少一部分固定在适当位置。生理溶液(其可以包含感兴趣的化合物如生物学因 子)可以在流道上灌注或表面灌流。然后流道可以被监测仪研究任何反应。上述方法的任一种可以用来分析或监测流道，包括亮视野或荧光显微镜技术、基 于荧光强度和荧光寿命成像、光学光谱法、芯片上溶解和质谱法。监测也可以通过进行直径 测量，例如利用集成光学技术(如激光-光学技术)来完成。血管的研究该装置可以与成像技术如瞬间Ca2+成像组合以获得流道(如动脉)的收缩状态的 时间分辨的记录(时间解析记录，time-resolved recording)，以及Ca2+反应。该装置可以 包括如上所述的溶解能力，并且可以被设计成连接至质谱仪。血管的标准表征包括在倒置亮视野和荧光显微镜中实施的动脉正常伸缩性 (artery tone)和/或直径的测量。这种装置可以与各种类型的亮视野或荧光成像(包括 Ca2+成像)组合以获得动脉收缩状态的时间分辨记录以及Ca2+反应。该装置可以包括溶解能力以及与电泳、荧光光谱和质谱仪的自动化连接。一个研究方向是映射(反映，map)血管壁的血管平滑肌细胞中的胞内过程。 然而，培养物中的主要平滑肌细胞在收缩表型至合成表型的几个小时内趋于去分化 (de-differentiate)。所观察到的最显著变化之一是基于肌动蛋白的细胞骨架的重组。因 此，可以期望使用其中这种去分化作用不发生的细胞模型。还期望能够用于研究完整组织 (例如，微血管壁中充分分化的血管平滑肌细胞)中的运输过程的高级实验系统。相对于细 胞培养物模型，组织模型通常是优选的，因为它们更好地反映体内情形。转染的分离微血管 的实验模型可以提供一种独特的框架以将关于胞内运输机制的基于细胞的知识转化为完 整器官系统。然而，在现有构造中，分离的微血管的使用需要接受过微解剖技术培训的高度 熟练的技术人员、专业设备以及大量时间(例如，用于分离和插管过程)。本发明公开的装 置可以有利于实施基本实验程序并允许较高的通量。利用这种装置，研究人员可以更容易且更有效地利用分离的血管，例如用来(i) 在光学技术中实验新的发明和(ii)在复杂的多细胞环境中鉴别关键微血管运输蛋白及它 们的调节模式。联合进入人类组织，这使得研究人员可将单个疾病模式(例如，临床诊断) 与分离自患者生物活检的微血管中的胞内运输机制的变化关联起来。鍾所述装置可以用来研究生物学流道的反应。已经发现，利用该装置的研究所得到 的结果类似于通过其他常规方法产生的结果。例如，图31示出了举例说明利用所述装置测 得的去氧肾上腺素(PE)的动脉反应的图表。在该实例中，将PE施加至流道的外表面，并且 PE的剂量以步进方式变化。所测得的流道直径的变化在图表中示出。a)示出了利用传统 移液管插管装置测得的肠系膜动脉对PE的剂量依赖性反应。在这个实例中，最大外径收缩 为在3. 0 μ M PE下的44. 5+/-2. 5% (n = 5)。b)示出了利用所述装置测得的剂量依赖性 PE反应(这里，流道内外径改变)，其与利用常规插管装置的结果类似且基本上相同，其最 大外径收缩在3. 0 μ M PE下为42. 2+/-3. 8% (n = 5)。在另一实例中，所述装置用来研究肠系膜血管。图32示出了举例说明装置中肠 系膜的收缩的图表。在该实例中，使用小鼠肠系膜血管，并给予单剂量的PE。PE施加至流 道的外表面。a)是对3.0μΜ PE的肠系膜血管反应的代表性跟踪，在立即经受用PE进行 刺激的新鲜分离的动脉中测得的持续收缩为41.8%。b)是在测试对PE的反应之前在装置 上在保持培养M小时的单个肠系膜血管的代表性跟踪，表明了对3. 0 μ M PE的持续收缩为 41. 4%。利用该装置研究的血管在M小时后仍然是存活的并且没有表现出对PE的反应改 变。图33示出了一幅重构的荧光照片和举例说明在装置的示例性实施方式中的肠系 膜动脉上的参比测量的图表，其中利用作为钙敏感染料的FURA-2染料。将肠系膜动脉中的 平滑肌细胞染色。在这个实例中使用小鼠肠系膜动脉。a)示出了固定在装置上并加载有 FURA-2Ca2+参比染料的肠系膜动脉，表明了平滑肌细胞缠绕(或包裹，wrap)在血管周边周 围。b)是示出了固定的血管的FURA-2参比测量的图表，表明在用3.0μΜ PE刺激后FURA-2 比率增加，而在洗掉之后回到基线。该图表示出了血管中对于FURA-2的F34Qmi/F38Qmi之比增 加。血管发生测定
所述装置也可以用来研究存活生物学流道中的血管发生。例如，培养室可以用填 充有生物聚合物(例如，Matrigel ，纤维蛋白原等)，其中嵌入有生物学流道，如血管。血 管可以通过灌注而容纳培养基或其他化合物。可替换地或另外，生物聚合物可以通过培养 基或其他化合物表面灌流，并且然后这些物质扩散通过该生物聚合物而到达血管。在一些 情况下，可在生物聚合物的一个预定点处注入一批(a depot of)生长因子并使其慢慢扩散 通过生物聚合物。以这种方式建立的梯度可以向血管的向外生长细胞提供趋化性引导。如上所述，血管可以可逆或不可逆地固定在装置中。可以例如通过使血管经受血 管发生因子，或通过局部损伤血管，例如通过利用激光烧蚀仪器进行激光烧蚀，来诱导血管 发生。然后可以观察血管的愈合或血管发生活性。合适的血管发生因子可以包括内皮细胞 生长因子(ECGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、成血管原(angiogen)、低分子量内皮促分裂 原、内皮细胞趋化因子、脂质、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。其他应用可以包括用包含感兴趣的粒子或分子的流体灌注流道，并评价这些粒子 或分子运输通过流道的壁并监测毒性。所述装置也可以用来研究血脑屏障。例如，流道可以是来自大脑的微血管网络的 血管。可以被研究的流道包括脑管(brain conduit)、肺管、内耳管、脂小管、工程化血管、 中空纤维、动脉、小动脉、静脉、小静脉、淋巴管、肠、输精管、输卵管、胆管、支气管、小支气 管、气管、输尿管、尿道、胰管和肾小管等。流道可以具有待研究的生理条件，例如它可以为 梗塞的、缺血的、发炎的、硬化的、免疫缺陷的、带有肿瘤的或转移的流道。也可以研究人工 或工程化流道。研究和商业应用临床应用从基础科学到临床应用的知识转换基于对人类组织的了解(例如，分析来自生物 活检的微血管)。为了成功地实现转化方法，对于临床研究人员而言，联系到微血管研究领 域是所期望的。对人类样本以及他们的各种患者记录的访问，并联合本文中披露的装置和 本领域诊断技术状态，可以提供对于理解和治疗微血管疾病的突破的机会。这种装置可以 使微血管研究中实验方法的标准化，因为它可以提供(i)对于功能血管分析和器官培养 的优化的微环境；(ii)困难的血管插管过程的自动化；和/或(iii)常规地研究极小且脆 弱的动脉的能力。例如，这些在通过世界范围的实验室和医院提供的信息来构建基于人微 循环高血压数据库中都是有用的要素。利用这种装置的标准化实验过程的简易化可以吸引 更多的临床人员积极参与到其中。治疗开发这种装置可以提供用于在器官、膜和血管管道对药物产品治疗的高通量筛选反 应。对血管的研究具有改善生活质量的潜力，并且增大经济活力。可以有助于加速 主要贡献于系统血压调节的阻力动脉中的正常伸缩性和/或直径调整的遗传、外遗传 (印igenetic)、蛋白质组(proteomic)、细胞和分子机制的鉴别。血压的控制可用于防止形 成心血管疾病。理解其潜在分子机制可以显著影响新治疗策略的开发。关于高血压和相关 分子机制的认识的改进可以得益于尽可能准确地刺激体内情形的研究模型。这种装置就可 以提供这样的模型。可以有助于鉴别用于治疗的新靶标并且可以允许它们在相同平台上立即进行验证。因此，这种装置可以在较短时间内使基础科学发现转化为它们的临床应用。这种装置也可以使基本实验程序易于变为高通量。因此，这种装置可以是用于在 药物开发过程中的靶标鉴别、靶标确认、药物设计和高通量筛选的有吸引力的工具。这种装 置可以用于研究基于动物和人的样本。该装置也可以用于诊断工具中，例如用来使给定患 者的心血管健康状态直接关联于他/她的微循环的功能状态。这可以为微血管病症的诊断 和具体治疗提供个性化的方法，由此将基础科学知识转化成临床应用。因此，该装置可以有 助于实现个性化给药。这种装置能够用于进行流道的结构和反应测试，例如在治疗产品的鉴别中。这种 装置可以用来测试来自动物、人、植物和其他有机体的流道。流道可以来自任何器官，并且 也可以包括人工或工程化流道。所述装置可以在筛选或评价某些药物、疾病、病症或治疗中 通过利用它们的代表性流道而使得能够对个体或个体组实施靶向治疗。 重要的挽救生命的新药产品能够迅速获得法规批准以便投入市场是合乎需要的。 快速跟踪临床试验和注册是确保效力和安全性的过程的关键部分。以接近体内条件的代表 性水平筛选时快速确定目标产品的装置和方法是可以促进该过程的一个方面。例如，可以 得益于药物开发中更多代表性治疗评估的健康护理的一个方面是治疗高血压。这种装置可 以提供满足这种需要的平台。类似地，这种装置可以有助于开发在植物和动物中使用的化合物，因为它提供用 于测试在各种流道中的实验化合物或新化合物的平台。Mli本文所披露的装置使得研究人员可以尽可能宽地靶向血管问题，如微血管功能障 碍的问题、其细胞和分子机制以及其对于种群健康的固有风险。所涉及的技术可以代表研 究的新领域中的范例和标准的变化。它可以为招募和培训各种水平的研究受训人员提供机 会，包括在微血管研究的高度专业领域的在校生和毕业生。通过这种培训而获得的技术和 基本技能在大学、生命科学研究所和医学研究所、以及生物技术工业中是大量需要的。如上所述，所述装置可以包括多种变形，如血管的可逆固定(例如，使用抽吸方 法)或血管的永久固定(例如，使用光可固化聚合物或组织胶合方法)。装置的管状结构或 通道可以是脂小管、中空纤维、或其他合适的结构。所述装置也可以设计成可以复杂流体网 络形式是互连。所述装置可以被设计成具有各种布图、具有(一个或多个)模块和通道的 各种布置。这种装置可以用于药学工业，用于新药的靶标鉴别、靶标确认、分子药物设计和优 化、早期毒性试验、和/或观点的论证。对于这种装置的临床应用包括个性化给药、从患者 生物活检的动脉和小静脉分离以确定血管收缩状态(例如，用于评价单个血管的结构和功 能特性，包括与单个患者病史的关联)、以及药物遗传学。所述装置还可以用来评估靶标个 体或个体组对药物产物的治疗或在评估中通过利用个体或个体的代表组的治疗流道的治 疗，如在药物遗传学中。这种装置也可以用于作物保护工业，用于植物和植物化合物的高通 量测试。上述的本发明内容的示例性实施方式仅仅是示例性的。在不背离本发明披露内容 要求保护的范围的前提下，本领域技术人员可以对这些具体示例性实施方式进行改变、更 改和变形。具体而言，可从上述示例性实施方式中的一个或多个选择的特征进行组合来产
21生没有具体描述的可替换示例性实施方式，适于这样的组合的特征对于本领域技术人员来 说是很明显的。在所附权利要求中本文中描述的主题覆盖和包括所有技术上合适的变化。 所提及的所有参考文献以其整体以引用方式结合于本文。
权利要求
1.一种用于研究流道的装置，包括基座；以及在所述基座中形成的模块，所述模块包括所述流道的主通道，所述主通道具有用于加载所述流道的加载进口 ；所述主通道中的培养室，用于所述流道的灌注和表面灌流中的至少一种；与所述主通道连通的至少两条固定管线，用于在沿着所述流道的长度的至少两个固定 位置处提供所述流道的固定。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，有多个在所述基座中形成的模块。
3.根据权利要求2所述的装置，其中，所述模块串联布置，并且所述模块共用一个共用 主通道。
4.根据权利要求2所述的装置，其中，所述模块并联布置，并且所述模块共用一个共用培养室ο
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，进一步包括嵌入在所述基座中的致动器， 其中所述致动器至少在所述两个固定位置之间产生所述基座的变形。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置，进一步包括在所述主通道中的溶解室，所 述溶解室与所述培养室串联并且适于接收来自所述培养室的所述流道的至少一部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其中，所述至少两条固定管线使得能够可 逆固定所述流道。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其中，所述至少两条固定管线使得能够不 可逆固定所述流道。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的装置，其中，所述主通道具有用于提取所述流道 以进行分析的出口。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的装置，其中，所述模块容纳直径范围为约3微 米至约2，000微米的流道。
11.根据权利要求10所述的装置，其中，所述模块容纳直径范围为约15微米至约300 微米的流道。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的装置，其中，所述模块容纳长度范围为约10 微米至约1. 5厘米的流道。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的装置，其中，所述装置包含随着时间释放的活 性化合物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的装置，其中，所述基座包含可生物降解材料。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的装置，其中，所述基座包含选自由以下材料组 成的组中的材料聚合物、生物聚合物、玻璃、半导体、金属、陶瓷、以及它们的组合。
16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述聚合物选自由以下组成的组中聚(二甲 基硅氧烷)、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、以及它们的组合。
17.根据权利要求15所述的装置，其中，所述生物聚合物选自由以下组成的组中纤维 蛋白原、胶原、层粘连蛋白、以及它们的组合。
18.根据权利要求15所述的装置，其中，所述半导体选自由硅和砷化镓组成的组。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的装置，进一步包括适于与分析设备，例如亮视野或荧光显微镜技术，包括基于荧光强度和荧光寿命成像，与光学光谱仪、芯片上溶解和质 谱仪接口的界面。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的装置，其中，所述培养室包括生物聚合物。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的装置，其中，所述装置由两层或更多层构成， 每层提供所述模块的至少一部分或与所述模块连接的通道的至少一部分。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的装置，进一步包括以下中的至少一个处理 器、存储单元、或温度控制单元。
23.一种研究流道的方法，包括提供权利要求1至22中任一项所述的装置；将所述流道加载到所述主通道中；将所述流道固定在所述主通道中，其中所述流道的至少一部分在所述培养室中；用生理溶液灌注或表面灌流所述流道；以及随时间监测所述流道。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括经由所述培养室向所述流道施加生物学 因子并监测所述流道的反应。
25.根据权利要求23至M中任一项所述的方法，进一步包括利用选自由以下组成的组 中的技术分析所述流道亮视野或荧光显微镜技术、基于荧光强度和荧光寿命成像、光学光 谱法、芯片上溶解和质谱法。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，固定所述流道包括经由所述固 定管线施加低于所述培养室中压力的压力。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，固定所述流道包括经由所述固 定管线施加粘结材料。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述粘结材料选自由以下组成的组中在暴露 于光时发生交联的聚合物、在暴露于湿气时发生交联的聚合物、以及响应于温度改变而发 生交联的聚合物。
29.根据权利要求23至观中任一项所述的方法，进一步包括沿着所述流道的轴向轴对 所述流道施加机械刺激。
30.根据权利要求23至四中任一项所述的方法，其中，监测所述流道包括利用集成光 学技术进行直径测量。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，进一步利用酶学方法溶解所述流道。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，用于研究血管发生，其中所述流道是 血管，进一步包括通过以下至少中的一种来刺激血管发生的步骤机械地破裂外平滑肌细 胞层、激光烧蚀、以及给予血管生成因子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述血管生成因子选自由以下组成的组中内 皮细胞生长因子(ECGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、成血管原、低分子量内皮促分裂原、 内皮细胞趋化因子、脂质、血管内皮生长因子(VEGF)、和血小板源性生长因子(PDGF)。
34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法，进一步包括用包含粒子或分子的流体 灌注所述流道，并评估所述粒子或分子通过所述流道壁的运输以及毒性。
35.根据权利要求23至34中任一项所述的方法，其中，所述流道的直径范围为约3微米至约2，000微米。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述流道的直径范围约15微米至约300微米。
37.根据权利要求23至36中任一项所述的方法，其中，所述流道的长度范围为约10微 米至约1. 5厘米。
38.根据权利要求23至37中任一项所述的方法，其中，所述流道选自由以下组成的 组中脑管、肺管、内耳管、脂小管、工程化血管、中空纤维、动脉、小动脉、静脉、小静脉、淋巴 管、肠、输精管、输卵管、胆管、支气管、小支气管、气管、输尿管、尿道、胰管、和肾小管。
39.根据权利要求38所述的方法，用于研究血脑屏障，其中所述脑管是来自大脑的微 血管网络的血管。
40.根据权利要求23至39中任一项所述的方法，其中，所述流道是选自由以下组成的 组中的具有疾病状态的生物学流道梗塞的、缺血的、发炎的、硬化的、免疫缺乏的、带有肿 瘤的、以及转移的生物学流道。
41.根据权利要求23至40中任一项所述的方法，其中，以约0-500ml/hr的速度进行灌 注或以约0-500ml/hr的速度进行表面灌流。
42.根据权利要求23至41中任一项所述的方法，其中，所述监测利用计算装置自动地 实施。
43.根据权利要求23至42中任一项所述的方法，进一步包括将监测到的数据传输至外 部装置以进行分析。
44.根据权利要求1至22中任一项所述的装置在用于个性化给药中的应用。
45.根据权利要求1至22中任一项所述的装置在用于开发药物产品中的应用。
全文摘要
本申请提供了一种用于研究流道的装置，包括基座；以及在基座中形成的模块，该模块包括用于流道的主通道，该主通道具有用于加载流道的加载进口；在主通道中的培养室，用于流道的灌注和表面灌流中的至少一种；与主通道连通的至少两个固定管线，用于在沿着该流道长度的至少两个固定位置处提供该流道的固定。
文档编号G01N33/483GK102124333SQ200980132036
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月17日 优先权日2008年6月17日
发明者斯特芬-塞巴斯蒂安·博尔兹, 阿克塞尔·京特 申请人:多伦多大学管理委员会