专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够对试样中的特定成分快速、高灵敏度、且简便地进行定量的生物传感器，特别涉及胆甾醇传感器。
背景技术：
作为以往的生物传感器的例子，对葡萄糖传感器进行说明。
具有代表性的葡萄糖传感器是利用丝网印刷等方法在绝缘性基板上形成至少包含测定极和配极的电极系统，然后在该电极系统上形成包含亲水性高分子、氧化还原酶和电子传导体的酶反应层而制得的。作为氧化还原酶，例如可使用葡萄糖氧化酶，此外，作为电子传导体，例如可使用铁氰化钾、二茂铁衍生物或苯醌衍生物等金属络合物或有机化合物等。另外，根据需要可在前述酶反应层中加入缓冲剂。
该生物传感器的酶反应层上如果滴下含底物的试样溶液，则酶反应层溶解，酶与底物会发生反应。随着反应的进行电子传导体被还原。酶反应结束后，被还原的电子传导体又通过电化学方法被氧化，这样就能够通过氧化电流值求得试样溶液中的底物浓度。
此外，由于该生物传感器使用以测定对象物质为基质的酶，因此从理论上讲能够测定各种物质。例如，如果使用胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶作为氧化还原酶，则能够测定各种医疗机构中用于诊断指南的血清中的胆甾醇值。
这种情况下，由于胆甾醇酯酶的酶反应进行得非常慢，所以通过添加合适的表面活性剂能使胆甾醇酯酶的活性有所提高，并可缩短整体反应所需的时间。但反应系统中包含的表面活性剂会对血细胞产生不良影响，利用葡萄糖传感器不能够对全血中的胆甾醇值进行测定。
针对上述情况，提出了为了仅将全血过滤除去血细胞而获得的血浆迅速地输入传感器内(试样溶液供给通路)，而在试样溶液供给通路的开口部附近设置过滤片(血细胞过滤部)的方案。
但是，如果过滤片与传感器的组合不合适，则被过滤片捕捉的血细胞会被破坏，导致血红蛋白的溶出。这样就很难用过滤片过滤血细胞成分，会有较小的血红蛋白流入试样溶液供给通路中，结果导致测定出现误差。
这是因为吸收试样溶液前的过滤片厚度和吸收试样溶液后膨胀起来的过滤片的厚度差与自上而下保持过滤片的压紧部的间隔不合适的缘故。自上而下保持过滤片的压紧部的间隔对应于膨胀后的过滤片的厚度如果过窄，则会阻碍过滤片的膨胀。这样，膨胀受到阻碍的过滤片的孔径不能够扩得足够大，结果使渗透的血细胞受到破坏。
针对上述情况，由于因试样溶液而异的血细胞比容值(血细胞容积比)导致过滤片的膨胀程度的不同，所以如果预先假设膨胀后的过滤片的厚度，并扩大设定前述压紧部的上下间隔，就可能使过滤片在传感器的保存过程中发生移位。
此外，为了抑制因试样溶液的吸收而出现的膨胀，考虑将过滤片设计得比以往薄，但这种情况下，如日本专利特愿2000-399056号的说明书记载的，仅从过滤片的一次侧的端部吸引试样溶液可减少一定时间内的吸收量，减慢来自过滤片的二次侧部分的血浆的流出速度，特别是减慢传感器内的试样溶液供给通路通过血浆达到饱和的速度，其结果是延长了测定时间。
针对上述情况，如果为增加一定时间内能够吸收的试样溶液的量而扩大吸引面积，从过滤片上部滴下试样溶液，则试样溶液在过滤片表面的流动速度比试样溶液浸入过滤片的速度快。因此，在过滤片表面流动的试样溶液从连接试样溶液供给通路与过滤片的试样溶液供给通路的开口部流入试样溶液供给通路内，结果导致测定出现误差。
所以，日本专利特愿2001-152868号的说明书中揭示了以下技术。即，设置从下保持前述过滤片的一次侧部分的第1压紧部、自上而下保持前述过滤片的二次侧部分的第2压紧部、从上保持前述过滤片的中央部分的第3压紧部、以及在前述第2压紧部和第3压紧部之间包围前述过滤片的空隙部，这样即使自上而下保持过滤片的压紧部的间隔与膨胀后的过滤片厚度不合适，也可防止因阻碍过滤片的膨胀而出现的血细胞被破坏。此外，还记载了通过将试样溶液直接滴在过滤片上，可抑制血细胞在过滤片表面流动、流入试样溶液供给通路内而出现的测定误差的技术思想。
但是，使用了过滤片的传感器，在经过过滤的血浆流入试样溶液供给通路内达到饱和后，由于血浆的粘性和全血中的血浆量，应该在空气孔停留(堵住空气孔)的血浆有时会从空气孔溢出。作为试样溶液的全血由血细胞成分和液体成分(血浆)构成，虽然因人而异，但其比例(血细胞容积比)在约20～60％的范围内。此外，因全血中的胆甾醇浓度不同而使粘性有所不同。由于这些不同之处，导致即使添加相同的试样溶液，不仅流入速度不同，而且有时出现粘性下降和血细胞容积比下降的现象，即使流入的血浆到达空气孔，也会顺着电极基板流过，出现溢出到试样溶液供给通路外的情况。
因此，本发明的目的是提供能够解决上述问题、与试样溶液的血浆粘性和全血中的血浆量无关、血浆能够停留在空气孔的经过改良的生物传感器。此外，本发明的目的在于提供高精度、应答特性优异、以全血为测定对象的胆甾醇传感器。
发明的揭示本发明的生物传感器具备绝缘性基板，包含设置在前述基板上的测定极和配极的电极系统，覆盖前述绝缘性基板的罩盖，含有氧化还原酶及/或电子传导体的至少1层反应层，由前述绝缘性基板和前述罩盖形成的包含前述电极系统及前述反应层的试样溶液供给通路，设置于前述试样溶液供给通路中的前述罩盖上的第1空气孔，试样溶液添加部，以及在前述试样溶液供给通路和试样溶液添加部之间设置的过滤血细胞的过滤片，用前述过滤片过滤了血细胞的血浆因毛细管现象被吸引入前述试样溶液供给通路内；该生物传感器的特征是，在前述试样溶液供给通路的前述绝缘性基板上设置了第2空气孔。
前述生物传感器中，前述第1空气孔和前述第2空气孔最好是连通的。
对附图的简单说明

图1为本发明的实施方式之一的生物传感器的分解立体图。
图2为本发明的实施方式之一的生物传感器的合体立体图。
图3为除去了同一传感器的反应层等后的简单纵截面图。
图4为表示同一传感器的电极系统附近的结构的简单纵截面图。
图5表示本发明实施例的胆甾醇传感器的应答特性。
实施发明的最佳方式如上所述，本发明的生物传感器具备在包含电极系统和反应层、在终端部具有第1空气孔的试样溶液供给通路与试样溶液添加部之间设置的过滤血细胞的过滤片，通过前述过滤片过滤了血细胞的血浆因毛细管现象被吸引入前述试样溶液供给通路内。该传感器的特征是，前述试样溶液供给通路中具备与第1空气孔不同的第2空气孔。
此外，前述第1空气孔和前述第2空气孔最好是连通的。
采用上述构成，可以不管试样溶液的血浆的粘性、全血中的血浆量及血细胞容积比的不同，能使血浆停留在试样溶液供给通路内。以往，如果存在上述不同之处，则流入的血浆到达空气孔后，不会停留在空气孔中，而是顺着绝缘性基板流过，与试剂一起溢出到试样溶液供给通路外，导致测定出现误差。但是，如果在绝缘性基板上设置与第1空气孔连通的第2空气孔，则血浆不会顺着绝缘性基板流过而溢出到试样溶液供给通路外，不管试样溶液的粘性和试样中被过滤的成分的比例如何，能够自动规定需进行测定的试样溶液的容量，因此能够消除测定误差。此外，由于试样溶液仅存在于试样溶液供给通路内，所以还可减少对传感器以外部分(测定机器及测定者等)的污染。
本发明所用的电子传导体除了铁氰化钾之外，还可选自与胆甾醇氧化酶等氧化还原酶之间具有电子传导能力的氧化还原型化合物。
氧化还原酶是以测定对象为底物的酶，以葡萄糖为测定对象的传感器中使用葡萄糖氧化酶。测定用于诊断指南的血清中的胆甾醇值时，采用催化胆甾醇的氧化反应的胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶及催化胆甾醇酯转变为胆甾醇的过程的胆甾醇酯酶。由于胆甾醇酯酶的酶反应进行得非常慢，所以可通过添加合适的表面活性剂等方法，使胆甾醇酯酶的活性有所提高，这样就能够缩短整体反应所需时间。
含有电子传导体的层及含有氧化还原酶的反应层配置在传感器内的电极系统上或其近旁。具备与设置了电极系统的基板结合、与基板之间形成了向电极系统供给试样溶液的试样溶液供给通路的罩盖构件的传感器中，可在露出于前述试样溶液供给通路的部分和试样溶液供给通路的开口部等处设置前述反应层。最好不论在哪一个位置，反应层都能够容易地溶解于导入的试样溶液中，直至电极系统。
此外，为了保护电极，抑制形成的反应层的剥离，最好在电极系统上连接形成亲水性高分子层。此外，除了电极系统之外，最好使亲水性高分子层作为形成反应层时的基底层形成，或使亲水性高分子包含于最下层的反应层中。
特别是为了提高含有电子传导体的反应层的溶解性，最好使该反应层与表面活性剂分离。此外，为了获得保存稳定性，最好使催化胆甾醇氧化反应的胆甾醇氧化酶及胆甾醇酯酶分离。
测定血糖值的生物传感器中，有为了将试样溶液导入反应层而形成将电极系统上形成的层等覆盖的含有脂质的层的例子(例如，日本专利特开平2-062952号公报)。本发明的测定胆甾醇的生物传感器，最好采用冷冻干燥法形成反应层的一部分(例如，日本专利特愿2000-018834号说明书)；或在罩盖构件表面用表面活性剂或通过等离子照射等进行处理而赋予亲水性。采用上述构成的情况下，即使不设置脂质层也没关系。
亲水性高分子可使用水溶性纤维素衍生物，特别是乙基纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，明胶，琼脂糖，聚丙烯酸或其盐，淀粉或其衍生物，马来酸酐的聚合物或其盐，聚丙烯酰胺，甲基丙烯酸酯树脂或聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯等。
表面活性剂可使用正辛基-β-D-硫葡糖甙、聚乙二醇单十二烷基醚、胆酸钠、十二烷基-β-麦芽苷、蔗糖单月桂酸酯、脱氧胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠、N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺或聚氧乙烯(10)辛基苯醚等。
此外，使用脂质时，例如，可使用卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等磷脂质，较好是使用亲水亲油性脂质。
氧化电流的测定方法有仅包括测定极和配极的二电极方式，以及还增加了参考极的三电极方式，三电极方式能够更准确地进行测定。
以下，参考附图，通过具体实施方式
对本发明进行详细说明。图1为本发明的较好实施方式的生物传感器的分解立体图。
图1所示的生物传感器中，例如在聚对苯二甲酸乙二醇酯等绝缘性树脂构成的绝缘性基板1的左侧部分喷镀钯，且通过激光修边处理，形成包含工作极2和配极3的电极系统。电极面积由形成于后述的隔板7上的狭缝12的宽度决定。此外，在绝缘性基板1上形成粘着部4及孔5。作为粘着部4，例如可将双面胶带贴在绝缘性基板1上而形成。
隔板7上形成了装入过滤片6的开口部10、构成试样溶液供给通路12’的狭缝12、为了在过滤片的一次侧导入试样溶液而在狭缝12的左右两侧设置的导轨9、以及从开口部10与狭缝12连通的连结部11。
罩盖13具有空气孔17及开口部16，为了在过滤片的一次侧部分导入试样溶液而在开口部16的左右两侧形成了导轨15。
隔板18上设置了装入过滤片6的开口部21，为了将试样溶液导入过滤片的一次侧部分而在开口部21的左右两侧形成导轨20。
此外，在罩盖22上设置了装入过滤片6的开口部25、压紧部(间隔部)26及孔27，为了将试样溶液导入过滤片的一次侧部分而在开口部25的左右两侧形成了导轨24。
在图1所示的各构件一体化时，图1所示的隔板7上的开口部10、罩盖13上的开口部16、隔板18上的开口部21及罩盖22上的开口部25是连通的。此外，绝缘性基板1上的第1空气孔17、隔板7上的狭缝12的终端部和罩盖13上的第2空气孔31是连通的。
过滤片6由玻璃纤维滤纸构成，如图1所示，在与绝缘性基板1相同的平面的投影图中，过滤片6具有两条边相等的三角形的形状。
在组装传感器时，首先，如图1的点划线所示的位置关系，在隔板7上载持罩盖13，得到合体基板A。此时，在罩盖13和隔板7合在一起通过狭缝12形成的凹状部分形成后述的反应层。
然后，如图1的点划线所示的位置关系，在隔板18上载持罩盖22，得到合体基板B。
按照图1的点划线所示的位置关系组合绝缘性基板1、合体基板A及合体基板B，在与绝缘性基板1相同的平面的投影图中，具有两边大致相同的三角形的过滤片6的一次侧部分的右端(底边侧)与绝缘性基板1上的粘着部4相连而设置过滤片6。
换言之，过滤片6的一次侧部分的右端(底边侧)设置在绝缘性基板1上，且呈嵌入隔板7的开口部10、罩盖13的开口部16、隔板18的开口部21及罩盖22的开口部25的状态。此外，过滤片6的二次侧部分的左端(顶点侧)处于夹在合体基板A的凹状部分的连结部11和绝缘性基板1之间的状态。
以上制得的本发明的生物传感器的简单立体图如图2所示。此外，其截面结构如图3所示。图3为本发明的生物传感器的简单纵截面图，相当于图2所示的X-X线截面图。图3中省略了设置于试样溶液供给通路12’的反应层等。
图1～3所示的本发明的生物传感器中，如图3所示，过滤片6及其他构件形成了非接触孔5和孔27。
即，如图3所示，本发明的生物传感器中形成了从下保持过滤片6的一次侧部分的第1压紧部a、自上而下保持过滤片6的二次侧部分的第2压紧部b及b’、以及从上保持过滤片6的中央部分的第3压紧部c。
在第2压紧部b及b’和第3压紧部c之间，孔5和孔27通过开口部10、16及21(参考图1)连通，形成与过滤片6和其他构件不接触的部分。
此外，图1所示的开口端8、14、19及23连通，如图2所示，形成作为凹状部分的试样溶液添加部30。本发明的生物传感器中存在凹状部分，且传感器的端面开口(向外部开放)，作为试样溶液的添加方法，能够采用通过穿刺从指尖采血再擦拭于试样溶液添加部30的方式。然后，试样溶液暂时保存在凹状部分，再迅速集中供给过滤片的一次侧部分。
图4为本发明的另一生物传感器的简单纵截面图。图2中虽然省略了反应层及电极系统，但图4中示出了反应层和电极系统。在绝缘性基板1的电极系统(2及3)上形成了亲水性高分子层28及反应层29。此外，在相当于试样溶液供给通路12’的顶部的罩盖13的下面侧形成了反应层30。图4所示的其他构件与图3所示相同。
为了便于对生物传感器的结构进行说明，图1～4所示的本发明的生物传感器由过滤片和各种基板的6种构件组成，但罩盖22和隔板18也可由1种构件组成，或罩盖13和隔板7也可由1种构件组成。
采用传感器对血液中的胆甾醇进行测定时，由作为凹状部分的试样溶液添加部30向过滤片6供给全血。此时，由于导轨9、15、20及罩盖22朝向隔板7、罩盖13、隔板18及罩盖22与试样溶液添加部30连接的部分，所以能够将全血有效地供给过滤片6。
然后，供给的血液从过滤片6的一次侧部分的端面及上面向其内部渗透。由于过滤片6内血细胞的渗透速度比作为液体成分的血浆的渗透速度慢，所以血浆从过滤片6的二次侧部分的前端渗出。渗出的血浆一边溶解载持于覆盖电极系统的位置及/或罩盖13的内面的反应层，一边填满电极系统附近，甚至填满延展到第1空气孔17和第2空气孔31的连通部分的整个试样溶液供给通路12’。
如果整个试样溶液供给通路12’被填满，则过滤片6内的液体的流动也就停止，此时血细胞未到达过滤片6的二次侧部分的端部而残留在过滤片6内。因此，为了即使通过仅填满整个试样溶液供给通路12’量的血浆，血细胞也不能够到达过滤片6的二次侧部分的程度，过滤片6需要设计成具有血浆和血细胞的流通阻力差的样子。
本发明的过滤片最好使用孔径为1～7μm左右的深度过滤片。此外，过滤片的厚度较好为300～400μm。
经过上述血细胞过滤过程，被血浆溶解的反应层和血浆中的测定成分(如果是胆甾醇传感器，为胆甾醇)发生化学反应，一定时间过后，利用电极反应测定电流值，能够对血浆中的成分进行定量。
此外，在表示试样溶液供给通路12’的电极系统附近配置反应层的例子的图4中，在绝缘性基板1的电极系统上形成了含有羧甲基纤维素的钠盐(以下，简称为“CMC”)等的亲水性高分子层28及含有电子传导体等反应试剂的反应层29。此外，由罩盖13和隔板7组合形成的试样溶液供给通路12’中，罩盖13露出于试样溶液供给通路12’的面上形成了含有氧化还原酶的反应层30。
如图1～4所示，试样溶液供给通路12’的与液体流通方向垂直的方向的距离比过滤片6的一次侧部分的厚度小，距离过滤片6的二次侧部分1mm的部分在试样溶液供给通路12’的连接部11附近压缩而设置。
过滤片6的被压缩部分在本发明实施例的尺寸的传感器产生吸引力的情况下，最好为从二次侧部分的前端开始约1mm左右的地方。此外，过滤片6的二次侧部分的压缩程度是二次侧部分为一次侧部分的约1/4～1/3。
虽然传感器的吸引力用数值表示较困难，但过滤片的压缩程度在隔板7的厚度为100μm、过滤片的厚度为370μm的情况下的测定结果(流入速度)良好。但是，过滤片的厚度在310μm以下时，流入速度较慢。
这样，由于试样溶液供给通路12’的截面积小于过滤片6的一次侧部分的截面积，所以用过滤片6过滤了血细胞的血浆利用毛细管现象能够迅速被吸入试样溶液供给通路12’内。
反应层中一般存在易溶解的部分和难溶解的部分。易溶解的部分为试样溶液供给通路12’的边缘部分，即沿隔板7的狭缝12的壁面的部分，液体流动方向的中央部分为难溶解部分。由于通过过滤片6的试样溶液沿狭缝12优先流过，所以虽然中央部分未被完全溶解，但试样溶液有时也会堵塞空气孔。过滤片6的二次侧部分的中央部分从左右两端部分向试样溶液供给通路12’内突出，所以试样溶液优先流过试样溶液供给通路12’内的中央部分，这样在试样溶液供给通路12’的中央部分就没有气泡残留，能够使血浆迅速流入传感器内。
测定时，如果通过穿刺而出血的指尖上的血由试样溶液添加部30供给过滤片6，则血液从过滤片6的一次侧部分的端面和上面向其内侧渗透。此时，由于存在成为隔板的第3压紧部c，所以血液优先流过过滤片6的表面，并没有直接流入试样溶液供给通路12’内。此外，与绝缘性基板1相同平面的投影图中，由于第3压紧部c和第1压紧部a的位置不一致，所以不会妨碍过滤片6的膨胀，血细胞不可能被破坏。
前述电极系统最好为贵金属电极。前述试样溶液供给通路12’的宽度较好是在1.5mm以下，这是经过丝网印刷电极的决定电极面积的精度不良的缘故。针对于此，贵金属电极的宽度为0.1mm，能够进行激光修边处理，决定电极面积的精度较高。
以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不仅限于此。
实施例按照以下步骤制作具有图1、2及4所示结构的胆甾醇传感器。反应层29中包含电子传导体，反应层29’中包含胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。
首先，在绝缘性基板1的电极系统上滴下CMC的0.5重量％水溶液5μl，在50℃的温风干燥机中干燥10分钟形成亲水性高分子层28。
然后，在亲水性高分子层28上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于70mM的铁氰化钾)，在50℃的温风干燥机中干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层29。此外，在溶解了来自诺卡氏菌的胆甾醇氧化酶(EC 1.1.3.6ChOD)和来自假单胞菌的胆甾醇酯酶(EC 3.1.1.13ChE)的水溶液中添加作为表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯醚(Triton X-100)。
在试样溶液供给通路12’中的罩盖13的露出部分滴下0.4μl以上制得的混合溶液，于-196℃的液氮下进行预备冷冻后，在冷冻干燥机中进行2小时的干燥，形成含有450U/ml胆甾醇氧化酶、1125U/ml胆甾醇酯酶及2重量％表面活性剂的反应层30。
此外，对厚度约300～400μm的玻璃纤维滤纸进行冲孔获得底边为3mm高为5mm的二等边三角形，冲孔片的二次侧前端的角加工成圆形，获得过滤片。然后，在绝缘性基板1和合体基板A之间设置两条边大致相等的三角形的过滤片6。
接着，使在前述绝缘性基板1和合体基板A之间设置过滤片6的构件和隔板18及罩盖22一体化而形成的合体基板B连接，制得具备图1、2及4所示结构的胆甾醇传感器。
在该传感器的试样溶液添加部30中添加作为试样溶液的具有各种浓度的全血10μl，3分钟后以配极为基准在阳极方向的测定极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，其结果示于图5。图5是表示全血的胆甾醇浓度和电流值关系的曲线图。
从图5可明显看出，本发明的传感器能够在胆甾醇浓度和电流值之间获得良好的线性。
产业上利用的可能性本发明能够提供与试样溶液的血浆粘性和全血中的血浆量无关、血浆可停留在空气孔中的经过改良的生物传感器。因此，本发明能够提供高精度、应答特性优良的以全血为测定对象的胆甾醇传感器。
权利要求
1.生物传感器，所述传感器具备绝缘性基板，包含设置在前述基板上的测定极和配极的电极系统，覆盖前述绝缘性基板的罩盖，含有氧化还原酶及/或电子传导体的至少1层反应层，由前述绝缘性基板和前述罩盖形成的包含前述电极系统及前述反应层的试样溶液供给通路，设置于前述试样溶液供给通路中的前述罩盖上的第1空气孔，试样溶液添加部，以及在前述试样溶液供给通路和试样溶液添加部之间设置的过滤血细胞的过滤片，用前述过滤片过滤了血细胞的血浆因毛细管现象被吸引入前述试样溶液供给通路内；其特征在于，在前述试样溶液供给通路的前述绝缘性基板上设置了第2空气孔。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1空气孔和前述第2空气孔是连通的。
全文摘要
本发明提供了即使在通过指尖穿刺采血而进行测定的情况下，也能够方便地在传感器中添加全血，再将添加的全血迅速供给过滤片的经过改良的生物传感器。该传感器在包含电极系统及反应层、与终端侧的第1空气孔连通的试样溶液供给通路上设置了第2空气孔。
文档编号G01N33/49GK1498344SQ0280443
公开日2004年5月19日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月14日
发明者长谷川美和, 山本智浩, 池田信, 吉冈俊彦, 彦, 浩 申请人:松下电器产业株式会社