专利名称：一种甲基苯丙胺的胶体金标记免疫检测垫、试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种体外快速免疫检测工具，具体涉及一种甲基苯 丙胺的多梯度胶体金标记垫、试纸。
背景技术：
甲基苯丙胺(又名去氧麻黄碱或安非他命)呈白色结晶体或粉末状， 俗称冰毒。甲基苯丙胺为中枢兴奋剂，能抑制丁氨基氧化酶的活性，使 肾上腺素和肾上腺素能神经的化学传导物质一去甲基肾上腺素的破坏减 慢，大脑皮质以及皮质下中枢产生兴奋，具有欣快、警觉及抑制食欲的 作用。滥用者会处于强烈兴奋状态，表现为不吃不睡、活动过度、情感 冲动、偏执狂、妄想、幻觉和暴力倾向。为了捕捉和感受一种短暂即逝 的强烈快感或兴奋，避免快感过后的失落、抑郁、疲劳感，常常导致强 迫性用药行为。因而极易成瘾。甲基苯丙胺是目前国际、国内蔓延最广， 流行最快的毒品之一。
甲基苯丙胺可以使用多种方法进行检测，如气相色谱(GC)气相色谱 /质谱(GC/MS)，高效液相色谱(HPLC)等。但是费用较高，所需的时间 较长。因此目前在进行毒品筛査过程中更多使用的是免疫胶体金检测方 法。
3免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种 新型的免疫标记技术。胶体金在弱碱环境下带负电荷，胶体金标记，实 质上是蛋白质等带正电荷基团的高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被 过程。由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质等被吸附物质的生 物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子
结合，如SPA、 PHA、 ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密 度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因 而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作 为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。
目前毒品检测中使用的免疫胶体金检测方法原理为将氯金酸用还原 法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。以硝酸纤维素膜为载体，利 用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。 在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而 显示出来。样本中的被检测成分在流动的过程中与胶体金标记的特异性 单克隆抗体结合，抑制了抗体与硝酸纤维素(NC)膜检测线上被检测成分 -BSA偶联物的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显 色，结果为阴性。
在胶体金免疫检测法中，可使用的胶体金通常是红色型或紫红色型。
下面以目前普遍使用的甲基苯丙胺胶体金标记免疫检测方法为例进 行说明。(1) 免疫原的制备采用活化脂法，将牛血清白蛋白(BSA)与甲 基苯丙胺结合，制成甲基苯丙胺的免疫原。
(2) 抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备将制备的甲基苯丙胺合成免 疫原免疫小鼠，提取小鼠腹水，分离纯化以得到抗甲基苯丙胺单克隆抗 体。
(3) 胶体金的制备采用还原法制备胶体金，常用的还原剂有柠檬 酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。
(4) 胶体金标记抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备将特异抗体加入 到胶体金溶液中混合，获得胶体金标记的抗体。
(5) 抗胶体金标记抗体的二抗的制备采用常规的制备方法制备二抗。
(6) 硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜的处理 硝酸纤维膜的包被硝酸纤维膜作为检测过程中的抗原抗体反应的
载体，要依次包被甲基苯丙胺-BSA结合物(测试线即T线)和抗胶体金
标记抗体的二抗(质控线即c线)。
玻璃纤维膜处理将检测阈值为1000ng/mL的冻干的胶体金标记的 抗甲基苯丙胺的特异抗体固定于玻璃纤维膜，制成胶体金垫。
(7) 免疫层析试纸条的制备在塑料底板7上分别将吸液用玻璃纤维6、固着冻干胶体金标记的
抗甲基苯丙胺的特异抗体的玻璃纤维膜金标垫5、包被甲基苯丙胺-BSA 结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的硝酸纤维素膜2和吸水垫1依次粘 贴，如图1所示，其中硝酸纤维素膜2两端分别与吸水垫和抗甲基苯丙 胺单抗金标垫5互相交叠连接，在抗甲基苯丙胺单抗金标垫5上压有玻 璃纤维6。
(8)样品测试和结果判断方法
快速检测过程描述将试纸条插入待测样品中，停留5秒后取出平 放，或用滴管在样品垫上滴加4 6滴样品，3 5分钟后观察结果。如 果受测标本中不含有甲基苯丙胺，胶体金标记的特异性抗体释放并向膜 区流动，与膜区抗原和二抗结合形成两条红线(一条反应线T， 一条质 控线C)，表明检测结果为阴性，如果受测标本中存在甲基苯丙胺，而且 浓度高于检测水平时，就会与胶体金标记的抗体竞争结合，从而阻止胶 体金标记的抗体与膜区抗原结合，使其对应的反应线不显色，仅出现一 条红色的质控线，表明检测结果为阳性。质控线(C)是检验方法本身 有效与否，显色有效，不显色无效。
免疫胶体金层析技术具有特异性强，灵敏度高，简便易行，价格低 廉等许多优点，已经成为世界通用的对吸毒人员进行初步筛査的首选方 法。当筛査为阳性结果，再进行GC-MS检査确认，大大降低了工作强度 和经济费用。作为筛查，我国对每一种毒品都规定了各自的检测阈值 (cutoff)，高于该阈值即为检测阳性。各种毒品的检测阈值在各国略有不同，即使在一个国家，也会根据该阈值的实际检测的信度和效度不断 调整阈值。美国1988年首次公布对阿片、大麻、可卡因等数种毒品检测
阈值后，到2004年已经进行了 4次修订。对每个国家来讲，各种毒品的 检测阈值都是单一的，以国家行政命令的形式公布的，其区分度具有一 定的法律意义。我国目前使用的检测阈值是参照美国1988年公布的检测 阈值制定的，其中，甲基苯丙胺检测阈值为1000ng/mL。但是在对药物 滥用人员执法过程中，存在各种复杂情况，单一的定性检测阈值，难以 适应不同的环境，难以区分不同的吸毒人群。如在吸毒时大量饮水，会 造成尿液稀释，使尿中毒品浓度低于检测阈值，造成假阴性；无法区分 偶尔吸毒和吸毒成瘾者，对于上述两种情况我国法律所规定的处理方法 是不同的。对于无法进行GC-MS检测确认的现场执法人员面对这些复杂 情况，单一定性的检测阈值提供的信息是不够的。

实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种甲基苯丙胺的多梯度胶体金标记免 疫检测工具，克服上述信息量不足的缺点，采用保留原检测阈值(cutoff ) 1000 ng/mL不变，用增加检测阈值的方法，扩大检测范围，以满足现场 执法区分不同吸毒人员的需要。对尿中含甲基苯丙胺的浓度进行多个浓 度范围的半定量标定。
本实用新型甲基苯丙胺胶体金标记免疫检测垫和相配合的试纸，包 括免疫原、抗甲基苯丙胺特异抗体、胶体金、胶体金标记抗甲基苯丙胺 特异抗体、抗胶体金标记抗体的二抗、硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜、免疫层析试纸条，
所述检测垫是多梯度检测垫，其上至少有两个硝酸纤维素膜，不同 的硝酸纤维素膜上分别有不同浓度的胶体金标记抗甲基苯丙胺特异抗体 固定于其上，形成具有不同检测阈值的胶体金标记垫；
所述免疫层析试纸条是使用上述胶体金垫，在同一底板上制成的多 梯度检测试纸条；其中，每个试纸条是将吸液用玻璃纤维、上述胶体金 垫之一、包被甲基苯丙胺-BSA结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的硝酸 纤维素膜和吸水垫依次粘贴于其上。
所述甲基苯丙胺的多梯度胶体金标记免疫检测垫及相配合的试纸， 其特征在于所述多梯度检测试纸条所包含的检测阈值为下述三组中的任 何一组
(1) 由如下两个检测阈值构成250 500ng/mL和1000ng/mL;
(2) 由如下两个检测阈值构成1000ng/mL和10000 100000ng/mL;
(3) 由如下三个检测阈值构成250 500ng/mL、 1000ng/mL和 10000 100000ng/mL。
使用所述的免疫检测垫和相配合的试纸的检测方法，样品测试和结
果判断方法按照如下操作步骤进行
将上述多梯度检测试剂条置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直
8滴加140 160ul无空气泡的受试者尿样于加样孔内； 测试结果在5-8分钟以内读取，8分钟后判定无效； 结果判断相应试纸条上的检测线不显色，检测结果为阳性，检测线显色，检测结果为阴性，质控线显色表明检测结果有效，不显色表明 结果无效。所述免疫层析试纸条的制备是使用上述胶体金垫，在同一底板上制 成多梯度检测试纸条，其中，每个试纸条是将吸液用玻璃纤维、上述胶体金垫之一、包被甲基苯丙胺-BSA结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的 硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴；所述样品测试和结果判断方法的操作步骤如下(1) 将上述多梯度检测试剂条置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加140-160nl无空气泡的尿样于加样孔内；(2) 测试结果在5-8分钟以内读取，8分钟后判定无效；(3) 结果判断相应试纸条上的检测线不显色，检测结果为阳性，检测线显色，检测结果为阴性，质控线显色表明检测结果有效，不 显色表明结果无效。所述检测阈值为下述三组中的任何一组 (1)包括如下两个检测阈值250 500ng/mL和1000ng/mL;/mL;(3) 包括如下三个检测阈值250 500ng/mL 、 1000ng/mL和 10000 100000ng/mU所述检测阈值250 500ng/mL用于筛选检测前3h内一次或多次 饮水800mL以上的被试者是否服用甲基苯丙胺类毒品。所述检测阈值1000 ng/mL用于筛选检测前3h内饮水量不超过 S00mL的被试者是否服用甲基苯丙胺类毒品。所述检测阈值10000 100000ng/mL用于筛选被试者是否连续服用 甲基苯丙类毒品并成瘾。所述样品为尿液。所述检测方法在被试者服用甲基苯丙胺类毒品后48小时内均可使用。本实用新型的优越性在于将只有一个检测阈值的定性检测方法，改进为多个梯度的半定量检测，扩大检测范围，增加了信息量，为区分 不同性质，不同剂量吸毒人员的判定提供客观依据。


图1为通用甲基苯丙胺检测试纸条的结构图；l-吸水垫；2-硝酸纤维素膜；3-质控线；4_测试线；5-抗甲基苯丙胺单抗金标垫；6-玻璃纤维；7-底板图2为本实用新型甲基苯丙胺检测试纸条的俯视图； 图3为本实用新型甲基苯丙胺检测试纸测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本实用新型的制备及使用本实用新型的检测方法 进行详细说明。实施例1l免疫原的制备采用活化脂法，将牛血清白蛋白(BSA)与甲基苯 丙胺结合，制成甲基苯丙胺的免疫原，甲基苯丙胺-BSA结合物。2抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备将制备的甲基苯丙胺合成免疫 原免疫小鼠，提取小鼠腹水，分离纯化以得到抗甲基苯丙胺单克隆抗体， 其制备方法参照宋朝锦、郭伟正、刘一兵等写的甲基苯丙胺和吗啡单克 隆抗体的制备及初步应用(中国原子能科学研究院年报，2001年00期 397-403页)。3胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备金溶胶，其中，加入1 %柠檬酸三钠水溶液0.7ml，制得金溶胶的粒径为71.5nm，颜色为紫 红色。4胶体金标记抗甲基苯丙胺的特异抗体的制备将步骤2中制备的特异抗体加入到步骤3制得的胶体金溶液中混合，从而获得胶体金标记 的抗体，具体操作方法参照江静、刘一兵、周棱等写的甲基苯丙胺免疫层析测试条的研制(同位素，2004年17 (2) : 79-83)和曾立波、陈连 康、胡小龙等写的氯胺酮、甲基苯丙胺和吗啡金标单抗试剂盒的研制(中 国法医学杂志2008年23 (4): 241-243)。5抗胶体金标记抗体的二抗的制备具体操作方法参照江静、刘一兵、周棱等写的甲基苯丙胺免疫层析测试条的研制(同位素，2004年17 (2) : 79-83)和曾立波、陈连康、胡小龙等写的氯胺酮、甲基苯丙胺 和吗啡金标单抗试剂盒的研制(中国法医学杂志2008年23 (4): 241-243)。6硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜的处理硝酸纤维膜的包被剪取长6cm，宽为0.4cm硝酸纤维膜，在膜上 依次包被浓度为10mg/ml的甲基苯丙胺-BSA结合物(测试线即T线)， 位置参照图1中的4，和浓度为10mg/ml的抗胶体金标记抗体的二抗(质 控线即C线)，位置参照图1中的3;制作三张同样的硝酸纤维膜。玻璃纤维膜处理剪取三张长6cm，宽为0. 4cm玻璃纤维膜，分别 将检测阈值为250ng/mL 、 1000ng/mL和10000ng/mL的冻干的胶体金标 记的抗甲基苯丙胺的特异抗体固定于不同的玻璃纤维膜，制成三个胶体 金垫。7免疫层析试纸条的制备12在塑料底板7上分别将吸液用玻璃纤维6、固着冻干胶体金标记的抗甲基苯丙胺的特异抗体的玻璃纤维膜金标垫5、包被甲基苯丙胺-BSA 结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的硝酸纤维素膜2和吸水垫1依次粘 贴，三个检测阈值的试纸条粘帖在同一塑料底板7上，结果如图2所示， 从上到下检测阈值依次为250ng/mL 、 1000ng/mL和10000ng/mL。8检测(4) 将试剂条置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加5 滴无空气泡的尿样(约150ul)于加样孔内。(5) 测试结果在5分钟时读取，8分钟后判定无效。(6) 结果判断如图3所示，a:阳性，250 ng/ml《尿液中甲基苯丙胺浓度《1000 ng/ml，此阳 性结果表明检测前3h内一次或多次饮水800mL以上的被试者服用过甲基 苯丙胺类毒品；b:阳性，1000ng/ml《尿液中甲基苯丙胺浓度《10000ng/ml，此阳 性结果表明检测前3h内饮水量不超过800mL的被试者服用过甲基苯丙胺 类毒品；c:阳性，尿液中甲基苯丙胺浓度^10000ng/ml，此阳性结果表明被 试者连续服用过甲基苯丙类毒品并成瘾；d:阴性；e i:检测结果无效。 实施例2单次口服甲基苯丙胺 10mg ， 其血浆 Cmax 为 17. 4ng/mL;Tmax5. 2h;T1/29. 3h。尿Cmax为2969. 7ng/mL;Tmax15. 16h;阳 性结果(检测值为1000ng/mL)出现的最早时间5. Oh。单次口服甲基苯丙 胺20mg，其血浆Cmax为32. 4ng/mL; Tmax7. 5h; T1/211. lh。尿Cmax为 4038.4ng/mL;Tmaxl4.32h;阳性结果出现的最早时间3. 3h。甲基苯丙胺 肾脏清除率175 +/- 102 mL/min，根据上述甲基苯丙胺药代动力学特征 设计如下实验，以确定检测阈值250 ng/ml和10000ng/ml的必要性和可 信度。1检测低线阈值的确定1.1检测值500ng/mL或250ng/mL对正常人定量服用甲基苯丙胺后 尿中甲基苯苯胺浓度的检测时间窗和检测阳性率的影响8例健康受试者，均为男性，平均年龄为26岁，经一次口服甲基苯 丙胺10mg后，使用GC-MS连续检测尿液中甲基苯丙胺的浓度，结果 发现如以500ng/mL为检测阈值时，检出甲基苯丙胺的时间范围是7-20h， 如果以250 ng/mL为检测阈值，其最初检出甲基苯丙胺的时间范围是4-13 h。以250 ng/mL为检测阈值比以500ng/mL为检测阈值，总检出时间增 加达34 h，总检出阳性率增加480/0。1. 2不同检测值对甲基苯丙胺毒品可疑使用者检出率的影响
使用已经取得体外试剂检测批号的杭州艾康生产的甲基苯丙胺检测 试纸条对娱乐场所中300名可疑甲基苯丙胺使用者进行尿液检测，结果
显示206名为阳性，对尿检(lOOOng/mL为检测值)阴性人员的尿液使 用GC-MS复检，结果发现检测值在100ng/mL以上阳性率为82.2%， 250ng/mL以上阳性率为76. 4%，500ng/mL以上阳性率为14. 1%， lOOOng/mL 以上阳性率为0%。在调查中发现所有阴性人员均有在2-3h中大量饮水 (饮料)历史，饮水量在800ml—1000ml之间。
1. 3增加250ng/mL检测值对假阳性的检测结果的影响
对甲基苯丙胺检测而言，假阳性主要来自治疗目的使用甲基苯丙胺， 和其他药物中含有的单胺、腐胺类成分的交叉反应。我国允许使用中枢 兴奋剂治疗儿童注意缺陷多动障碍、成年注意缺陷多动障碍和发作性睡 病。治疗剂量一般为20-25mg/d，剂量范围是5-30mg/d。在这一用药剂 量范围中尿液甲基苯丙胺浓度己经处于^1000ng/mL的水平(参看2. 1)， 所以250ng/mL检测值对治疗用药人群的假阳性检出率的影响不大。值得 注意的是一些含有单胺、腐胺类药物由于交叉反应造成的假阳性结果。 可以在使用说明中标示250ng/mL检测值仅限于在尿液被稀释的情况下， 即吸毒后2-3h内饮水量在800ml以上，才对判定吸毒与否有意义。
2检测高线阈值的确定
2.1娱乐性(偶尔)使用甲基苯丙胺人员尿中甲基苯丙胺浓度低于10000ng/mL
对使用杭州艾康生产的甲基苯丙胺检测试纸条检测的105例甲基苯 丙胺尿检阳性人员进行血液中甲基苯丙胺浓度检测(GC-MS方法)发现 血液中甲基苯丙胺浓度在0. 1-11. 1 microM，中位数为1. 3 microM (0. 19 mg/l)均数为2microM (0. 3 mg/1)。根据药代动力学推算，维持甲基苯 丙胺血药浓度为1.3 microM (0.19 mg/1)，人每天的药物负荷剂量应为 52mg。
4例健康受试者，均为男性，平均年龄28.3岁，以每次口服给甲基 苯丙胺13mg，每天4次，每次给药间隔为4h，连续4天。结果显示受试 者的血药浓度维持在1-4microM之间。尿中甲基苯丙胺浓度大于 1000ng/mL，低于10000ng/mL。
2. 2甲基苯丙胺成瘾人员尿中甲基苯丙胺浓度高于10000ng/mL
物质成瘾的诊断必须满足DSM-IV诊断标准，临床发现符合甲基苯 丙胺依赖诊断标准的患者都有长期且大量使用甲基苯丙胺的病史。对诊 断甲基苯丙胺成瘾972名自愿戒毒人员的调査发现，他们使用甲基苯丙 胺剂量范围在0.7-2. lg/d，中位数为0.82 g/d，均数为l.l g/d。根据 药代动力学的研究，以成瘾人员每日用量的中位数0. 82g为甲基苯丙胺 药物负荷剂量，成瘾人员甲基苯丙胺血药浓度应在 16-64microM(2. 4-9. 6mg/L)， 尿中甲基苯丙胺浓度在 26400ng/mL—1930000ng/mL，均数为317000 ng/mL，因而将上线定于10000ng/mL以上，便于区分少量娱乐性使用和成瘾性大量使用甲基苯 丙胺的人员。
以上研究结果表明，以250ng/mL、 10000ng/mL，与原有1000ng/mL 的检测阈值共同组成一个检测单位，实现对甲基苯丙胺(盐酸甲基安非 他明)3个浓度范围的半定量检测。在该检测范围内，能够较好的达到 区分不同性质使用甲基苯丙胺的人员。
3检测时间范围的确定
8个志愿者分为2组口服甲基苯丙胺，连续给药组4人每天给甲基 苯丙胺10mg， 4天，非连续给药4人组隔天给甲基苯丙胺10mg， 4次。 用GC-MS连续检测末次给药后尿液中甲基苯丙胺的浓度，直到尿液中甲 基苯丙胺浓度低于250ng/ml为止。发现连续使用甲基苯丙胺的4人中从 末次给药到尿中甲基苯丙胺浓度低于250ng/ml的时间范围是44h到73h， 平均为58.2士14.2h;非连续使用甲基苯丙胺的4人中从末次给药到尿 中甲基苯丙胺浓度低于250ng/ml的时间范围是59h到71h，平均为65. 8 士5.9h。从以上结果可以发现连续使用或间断使用甲基苯丙胺对最长可 检测时间影响不大；以250ng/ml为最低检测值，可以发现在48h以内使 用过10mg以上甲基苯丙胺的人。
权利要求1、一种甲基苯丙胺胶体金标记和试纸，包括免疫原、抗甲基苯丙胺特异抗体、胶体金、胶体金标记抗甲基苯丙胺特异抗体、抗胶体金标记抗体的二抗、硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜、免疫层析试纸条，其特征在于所述检测垫是多梯度检测垫，其上至少有两个硝酸纤维素膜，不同的硝酸纤维素膜上分别有不同浓度的胶体金标记抗甲基苯丙胺特异抗体固定于其上，形成具有不同检测阈值的胶体金垫；所述免疫层析试纸条是使用上述胶体金垫，在同一底板上制成的多梯度检测试纸条，其中，每个试纸条是将吸液用玻璃纤维、上述胶体金垫之一、包被甲基苯丙胺-BSA结合物和抗胶体金标记抗体的二抗的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于其上。
2、 根据权利要求1所述的胶体金标记垫和试纸，其特征在于所述多梯度检 测试纸条所包含的检测阈值为下述三组中的任何一组(1) 由如下两个检测阈值构成250 500ng/mL和1000ng/mL;(2) 由如下两个检测阈值构成1000ng/mL和10000 100000ng/mL;(3) 由如下三个检测阈值构成250 500ng/mL、 1000ng/mL和10000 100000ng/mL。
专利摘要本实用新型公开了一种甲基苯丙胺的多梯度胶体金标记免疫检测垫及试纸，属于体外检测试剂领域。本实用新型是对目前普遍使用的单一阀值甲基苯丙胺的胶体金标记免疫检测工具的进一步改进，在保留原有单一检测阈值的基础上增加1～2个新的检测阈值构成一个多梯度检测。使用本实用新型的检测方法可以区分不同可疑涉毒人员是否吸毒或成瘾，为执法人员提供一个客观指标，具有简单、准确的特点。
文档编号G01N33/558GK201413327SQ200920146329
公开日2010年2月24日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者高俊钰 申请人:高俊钰