专利名称：一种用液相色谱—串联质谱检测烟草特有亚硝胺的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测N-亚硝胺的方法，特别是涉及一种检测烟草特有N-亚硝胺的方法。
背景技术：
烟草特有N-亚硝胺是只存在于烟草及其制品中的一类化合物。尽管它们在生理条件下通常是稳定的，但其通过在体内代谢活化就具有强烈的致癌作用。为了减少烟草特有N-亚硝胺对吸烟者和被动吸烟者健康可能的伤害，控制和降低它们在烟草及其制品中的含量，已经成为一项重要的课题，烟草特有N-亚硝胺的含量将成为烟草制品品质的一项重要指标。因此，自上世纪90年代以来，国内外都对烟草中烟草特有亚硝胺的检测方法进行了相应的研究。然而，由于烟草及卷烟烟气的成分十分复杂，其中的烟草特有亚硝胺含量极微，所以这方面的研究难度很大，尚需深入。Prokopczyk等人(“Improved methodology for the quantitative assessment of tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco by supercritical fluid extraction”，J.Agric.Food chem.，1995，43916-922)报道了一种检测方法，先用加10％甲醇的硅胶柱超临界流体萃取烟草中N-亚硝胺，将萃取液过硅胶层析柱纯化，组分洗脱后浓缩，最后用气相色谱/热能分析仪(GC/TEA)分析检测。该方法只采用硅胶柱，会使许多酸性干扰组分与N-亚硝胺同时洗脱，影响纯化效果和回收率；其次，TEA检测器对所有亚硝基化合物均有响应，难以区分共洗提的其它亚硝基化合物；再者，TEA检测器死体积大，限制了GC的扫描次数，使其方法检测限较高。Song等(“Supercritical fluid extraction andgas chromatography/mass spectrometry for the analysis of tobacco-specificnitrosamines in cigarettes”，Anal.Chem.，1999，711303-1308)报道了一种检测方法，先用加10％甲醇修饰剂的超临界流体萃取烟丝，用氢氧化钠溶液洗涤乙酸乙酯为溶剂的萃取液，浓缩后用硅胶基固相萃取柱以正相模式进一步纯化试样，最后用GC/MS分析检测。该方法只采用了强碱洗涤、硅胶固相萃取柱萃取，会使碱性较强的含氮化合物与待测组分同时洗脱，影响预处理纯化效果和回收率。

发明内容
本发明旨在解决烟草特有N-亚硝胺检测中纯化效果不佳、回收率低等问题，提供一种可提高纯化效果和回收率、且操作简便、仪器通用性强的检测烟草特有亚硝胺的方法。
本发明的技术方案是这样实现的A.将主流烟气捕集于滤片上，加入内标物溶液，用柠檬酸—磷酸盐缓冲溶液和环己烷对滤片进行振荡共提取；B.在N2气保护下，浓缩有机相提取液，往其中加盐酸酸化，相分离后，往水相中加碱溶液中和；C.将水相溶液转入反相化学键合固相萃取柱，用含极性有机溶剂的水溶液淋洗，用极性有机溶剂洗提，收集洗提液；D.浓缩洗提液，用LC/MS/MS仪分析。LC条件C18液相色谱柱，柱温40～60℃，进样量10～20μL，流动相流量0.2～1mL/min，流动相由乙酸铵水溶液和乙酸铵乙腈溶液组成，采用线性梯度流动相洗脱。MS/MS条件正离子模式电离，源温度500～600℃，喷嘴电压4000～5000V；
E.根据组分峰与内标物峰的面积比进行定量分析。
在步骤A中滤片为剑桥滤片；内标物为三甲基13C3标记咔啡因，以甲醇为溶剂，浓度为50-500ng/mL，用量0.1-2mL；柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液PH4-5，柠檬酸浓度45-60mmol/L，抗坏血酸浓度10-30mmol/L，柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液与环己烷的体积比为1∶0.5-2。
在步骤B中盐酸浓度0.1-0.5mol/L，用量1-5mL；碱溶液为氢氧化纳水溶液，浓度为0.5-2mol/L，滴加至PH为5.5-7.5。
在步骤C中反相化学键合固相萃取柱为OasisHLB固相萃取柱，使用前已相继用1-10mL甲醇和1-10mL蒸馏水平衡；极性有机溶剂为甲醇，其水溶液浓度为2-8％，淋洗剂用量1-20mL，洗提剂用量1-20mL。
在步骤D中LC条件为液相色谱柱为Pinnacle II C18柱；乙酸铵水溶液和乙酸铵乙腈溶液浓度均可为3-8mmol/L；流动相线性梯度变化为70％～100％乙酸铵水溶液+30％～0％乙酸铵乙腈溶液，平衡3～10min，然后乙酸铵水溶液在1～8min内由70％～100％线性减少为50％～10％，同时乙酸铵乙腈溶液由30％～0％线性增加至50％～90％，保持1～8min，按着乙酸铵水溶液在1-8min内由50％～10％线性增加为70％～100％，同时乙酸铵乙腈溶液由50％～90％线性减少至30％～0％，保持1-20min。
本发明的有益效果为由于采用了水溶性缓冲溶液和有机溶剂振荡共提取，有效提高了纯化效果和回收率。因为振荡共提取使得把烟草特有亚硝胺从滤片上萃取进入水溶性缓冲溶液，然后再反萃到有机相可以一步完成，避免了以往反萃取时形成泡沫的现象，泡沫形成将引起损失和误差。尤其是，共提取中的柠檬酸—磷酸盐缓冲溶液可以消除碱性较强的含氮化合物的影响。此外，盐酸酸化、相分离可以消除一些中性干扰组分的影响，固相萃取纯化可以消除一些非目标化合物。本方法设定的LC/MS/MS实验条件，能有效分离NNN，NNK，NAT，NAB四种待测组分和内标物，特别适用于卷烟烟气中烟草特有亚硝胺的精确定量。本方法操作简便，因未采用层析柱所以省时，相对于GC/TEA法而言仪器通用性强。
具体实施例方式
实施例一先往捕集了20支9mg 555牌卷烟烟气的直径92mm剑桥滤片加入1.0mL 300ng/mL三甲基13C3标记咔啡因甲醇溶液，再加入含53mmol/L柠檬酸和20mmol/L抗坏血酸的pH4.3柠檬酸—磷酸盐缓冲溶液和环己烷各30mL，对滤片进行振荡共提取。分离得到有机相提取液后，N2保护下浓缩至约1mL，再往其中加1mL0.1mol/L盐酸酸化，相分离后往水相中滴加1mol/L氢氧化钠溶液至pH7.0。将所得水相溶液定量转入已相继用3mL甲醇和3mL蒸馏水平衡的美国Waters公司的Oasis HLB固相萃取柱，然后用3mL5％甲醇水溶液淋洗，用5mL甲醇洗提。将洗提液浓缩至1mL，供LC/MS/MS分析。LC条件为美国Restek公司的Pinnacle II C18液相色谱柱，柱温60℃，进样量10μL，流动相流量0.25mL/min，流动相由5mmol/L乙酸铵水溶液和乙酸铵乙腈溶液组成，流动相线性梯度变化为95％乙酸铵水溶液+5％乙酸铵乙腈溶液，平衡6min，然后乙酸铵水溶液在6min内由95％线性减少为20％，同时乙酸铵乙腈溶液由5％线性增加至80％，保持4min，接着乙酸铵水溶液在2min内由20％线性增加为95％，同时乙酸铵乙腈溶液由80％线性减少至5％，保持10min。该实验条件下，烟草特有亚硝胺的四种主要组分NNN，NNK，NAT和NAB可与三甲基13C3标记咔啡因有效分离，再通过MS/MS检测，定量各种待测组分含量。MS/MS条件为正离子模式电离，源温度600℃，喷嘴电压5000V。根据积分仪得到的待测组分与三甲基13C3标记咔啡因的峰面积比进行定量分析。由提取离子流图分析可知，信噪比较高，基本无干扰峰，样品纯化良好，峰形尖锐对称。
实施例二以甲醇为溶剂，按表1浓度范围配置系列混合标样溶液，其中三甲基13C3标记咔啡因均为300ng/mL；然后在上述实验条件下进行LC/MS/MS分析检测，以色谱图上组分峰与三甲基13C3标记咔啡因峰的面积比为响应信号，根据6种混合标样溶液的3次平行测量结果，建立NNN、NNK、NAT和NAB四种组分的标准曲线，各标准曲线的线性相关系数依次为0.9992、0.9980、0.9990和0.9992，表明响应信号与组分浓度显著线性相关；由最低浓度混合标样溶液5次平行测量结果标准偏差的3倍确定方法检出限，实验结果见表2，表明方法检出限低，方法灵敏。
表1系列混合标样溶液主要组分浓度标样编号 1 2 3456NNN/ng/mL 2.75 27.5 110 275 550 2750NNK/ng/mL 2.75 27.5 110 275 550 2750NAT/ng/mL 2.50 25.0 100 250 500 2500NAB/ng/mL 2.50 25.0 100 250 500 1000表2 LC/MS/MS方法的检出限NNN NNK NAT NAB检出限/ng/mL0.170.240.050.19
取同一牌号的混合型卷烟通过上述试样预处理和LC/MS/MS分析检测，重复进行5次平行测定，计算测定的相对标准偏差RSD％，实验结果见表3，对于复杂基体中的痕量组分分析而言，这样的结果说明方法的重复性相当好。
表3混合型卷烟烟气中烟草特有亚硝胺含量测定的重复性实验编号 1 2 3 4 5 RSD％NNN/ng/支122.84 134.08 128.56 116.48 120.15 5.60NNK/ng/支46.03 45.23 43.96 44.86 40.57 4.81NAT/ng/支162.73 154.12 159.46 167.64 172.95 4.63NAB/ng/支18.47 17.25 18.70 16.86 16.87 5.05将混合标样溶液加入已捕集卷烟烟气的剑桥滤片中，然后按照上述试样预处理和LC/MS/MS分析检测方法进行实验，根据实际加入量和实测结果，计算各种组分的回收率，实验结果见表4，表明四种组分的回收率均在90％以上。
表4方法回收率的测定NNN NNK NAT NAB加入量/ng200 200 200 100实测量/ng186.52190.24180.3391.09回收率/％93.26 95.12 90.17 91.09
权利要求
1.一种用液相色谱-串联质谱检测烟草特有亚硝胺的方法，其特征在于此方法的步骤如下A、将主流烟气捕集于滤片上，加入内标物溶液，用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液和环己烷对滤片进行振荡共提取；B、在N2气保护下，浓缩有机相提取液，往其中加盐酸酸化，相分离后，往水相中加碱溶液中和；C、将水相溶液转入反相化学键合固相萃取柱，用含极性有机溶剂的水溶液淋洗，用极性有机溶剂洗提，收集洗提液；D、浓缩洗提液，用LC/MS/MS仪分析，LC条件C18液相色谱柱，柱温40～60℃，进样量10～20μL，流动相流量0.2～1mL/min，流动相由乙酸铵水溶液和乙酸铵乙腈溶液组成，采用线性梯度流动相洗脱，MS/MS条件；正离子模式电离，源温度500～600℃，喷嘴电压4000～5000V；E、根据组分峰与内标物峰的面积比进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的检测烟草特有亚硝胺方法，其特征在于在步骤A中滤片为剑桥滤片；内标物为三甲基13C3标记咔啡因，以甲醇为溶剂，浓度为50-500ng/mL，用量0.1-2mL；柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液PH4-5，柠檬酸浓度45-60mmol/L，抗坏血酸浓度10-30mmol/L，柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液与环己烷的体积比为1∶0.5-2。
3.根据权利要求1所述的检测烟草特有亚硝胺方法，其特征在于在步骤B中盐酸浓度0.1-0.5mol/L，用量1-5mL；碱溶液为氢氧化纳水溶液，浓度为0.5-2mol/L，滴加至PH为5.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的检测烟草特有亚硝胺方法，其特征在于在步骤C中反相化学键合固相萃取柱为OasisHLB固相萃取柱，使用前已相继用1-10mL甲醇和1-10mL蒸馏水平衡；极性有机溶剂为甲醇，其水溶液浓度为2-8％，淋洗剂用量1-20mL，洗提剂用量1-20mL。
5.根据权利要求1所述的检测烟草特有亚硝胺方法，其特征在于在步骤D中LC条件为液相色谱柱为Pinnacle II C18柱；乙酸铵水溶液和乙酸铵乙腈溶液浓度均可为3-8mmol/L；流动相线性梯度变化为70％～100％乙酸铵水溶液+30％～0％乙酸铵乙腈溶液，平衡3～10min，然后乙酸铵水溶液在1～8min内由70％～100％线性减少为50％～10％，同时乙酸铵乙腈溶液由30％～0％线性增加至50％～90％，保持1～8min，按着乙酸铵水溶液在1-8min内由50％～10％线性增加为70％～100％，同时乙酸铵乙腈溶液由50％～90％线性减少至30％～0％，保持1-20min。
全文摘要
一种用液相色谱—串联质谱检测烟草特有亚硝胺的方法，用于测定卷烟烟气中特有亚硝胺含量。将烟气捕集于滤片上，加内标物，用柠檬酸—磷酸盐缓冲溶液和环己烷对滤片振荡共提取，N
文档编号G01N30/72GK1616962SQ20041007882
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月7日 优先权日2004年9月7日
发明者毛友安, 钟科军, 魏万之, 戴云辉, 魏新亮, 卢红兵, 李艳春 申请人:常德卷烟厂