专利名称：一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及肝素钠中多硫酸软骨素的预处理和电泳检测方
法。
背景技术：
我国是肝素钠产量最大的国家，国际市场的肝素钠产品原料70%以上均来自中 国。随着需求的增加，肝素钠的价格这几年一路攀升。2008年2月，美国因注射肝素钠出 现4例死亡，多例不良反应的医疗事故，成为震惊世界的“肝素钠事件”。经有关专家分析， 上述事故可能是因为与肝素钠中含有多硫酸软骨素有关联。我国政府十分重视并关注事态 发展，针对市场中存在部分肝素钠中含多硫酸软骨素情况，国家药监局召开专门会议，要求 加强管理，一律召回含有多硫酸软骨素的肝素钠。因此，对肝素钠中多硫酸软骨素进行检测 已经成为迫在眉睫的事。目前，行业内肝素钠中多硫酸软骨素的检测，一般采用核磁共振法、醋酸纤维素薄 膜电泳法。核磁共振法检测设备投入大，而且多硫酸软骨素含量少于时也不易被检出。 而醋酸纤维素薄膜电泳检测法，分离效果差，容易受其它杂质干扰，薄膜不透明，不易于观 察，通常肝素钠中多硫酸软骨素的含量大于5%时，电泳检测效果明显，而当多硫酸软骨素 小于3%时电泳检测结果不容易辨别(导致这些产品流入市场)。本申请人同日提交的发 明专利申请，公开了一种肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方法，即使肝素钠 中的多硫酸软骨素含量少于1 %也能被检出，检测结果容易观察，分辨率高，检测灵敏度高。 但当肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于0.5%时，该方法仍不能有效检出。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法， 即使肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于0. 5%时，仍能有效检出，检测结果容易观察，分辨 率高，检测灵敏度高。本发明采取以下技术方案予以实现一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，包括下列步骤(1)肝素钠中多硫酸软骨素的分离制备a、溶解过滤将含有重量低于0. 5%多硫酸软骨素的肝素钠样品，加入氯化钠溶 液中，升温至55°C 士5°C，搅拌使肝素钠完全溶解，再用碱溶液调PH至10-12，过滤收集滤 液，并将滤液降温至溶液的冰点至5°C，用酸调PH至1-2，过滤收集滤液；b、快速沉淀滤液用碱调PH至5-6，搅拌下缓慢加入酒精，使溶液含酒精的重量浓 度为30-38%，静置；用搅拌棒试探容器底部，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精倒出，收 集沉淀物，烘干即得多硫酸软骨素、肝素钠、杂质的混合品；(2)样品准备将相同重量的步骤(1)含有重量低于0. 5%多硫酸软骨素的肝素钠 样品、步骤(1)制得的沉淀物，以及肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品分别溶解于水中；对制得的水溶液分别加酸调PH至1-3，然后用亚硝酸盐或硝酸盐进行硝化反应0. 5-2小时， 再调PH至6. 5-7. 5，备用;(3)多硫酸软骨素的检测C、制胶板用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为1 0.7-1. 5，并加 热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均勻薄层；d、电泳在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液；取 步骤(1)准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的电 压梯度、电流强度的条件下电泳；e、染色和脱色取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无色 为止；f、结果观察观察样品和标准品所显示的迁移距离。本发明进一步改进方案是，所述电泳缓冲液为醋酸_锂盐缓冲液，缓冲液PH值为 2. 0-4. O0本发明更进一步改进方案是，四种样品溶液的点样量分别为0. 5-1. 5 μ 1。电泳时 的电压梯度为25-35V/cm，电流强度为l-2mA/cm，电泳时间为15-20分钟。本发明的有益效果一、本发明用快速沉淀法将多硫酸软骨素与肝素钠分离，并进一步对分离所得物 进行检测，实现了对肝素钠中含量较低的多硫酸软骨素的检测，灵敏度达到0. 以上。二、本发明所制备的琼脂糖凝胶厚薄均勻，含水量大(约占98% -99% )，近似自由 电泳，样品扩散性好，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。三、琼脂糖透明无紫外吸收，琼脂糖胶板呈透明状，易于观察，电泳过程和结果可 直接用紫外光灯检测、观察，观察直观，容易判断。四、电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，且制成干膜可长期保存。五、本发明操作简单，电泳速度快。


图1为本发明的四种样品电泳图。图中的1为含有重量0. 2%多硫酸软骨素的肝 素钠粗品；图中的2为含有重量0. 2%多硫酸软骨素的肝素钠粗品经分离沉淀后得到的沉 淀物(多硫酸软骨素、肝素钠、杂质的混合品)；图中的3为肝素钠标准品；图中的4为多硫 酸软骨素标准品。从图示可知，图中的2、4相应位置显现多硫酸软骨素条带，图中的1、3相 应位置未显现该条带，说明当肝素钠中多硫酸软骨素的含量低于0.5%时，简单的采用琼脂 糖凝胶电泳检测方法是检测不出来的。本发明首先通过对含有重量0. 2%多硫酸软骨素的 肝素钠粗品进行分离，然后再对分离得到的沉淀物进行检测，从而实现能检测出肝素钠中 含量低于0. 5%的多硫酸软骨素。
具体实施例方式以下仅是对本发明的说明，而非对本发明的限制。(1)肝素钠中多硫酸软骨素的分离制备a、溶解过滤取IOg含有重量0. 2%多硫酸软骨素的肝素钠样品，加入150mL水和5g氯化钠混合的溶液中，升温至55°C 士5°C，搅拌使肝素钠完全溶解，再用重量浓度为20% 氢氧化钠碱溶液调PH至10-12，过滤收集滤液，并将滤液降温至零度，用盐酸调PH至1-2， 过滤收集滤液；b、快速沉淀滤液用氢氧化钠调PH至5. 5，搅拌下缓慢加入95%酒精，使溶液含酒 精的重量浓度为35%，静置；用搅拌棒试探容器底部，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精 倒出，收集沉淀，烘干即得所需的多硫酸软骨素、肝素钠、杂质的混合品；(2)取相同重量的步骤(1)所用的含有重量0. 2%多硫酸软骨素的肝素钠样品、步 骤(1)制得的多硫酸软骨素、肝素钠、杂质的混合品，以及肝素钠标准品、多硫酸软骨素标 准品各200mg，分别溶解于IOml水中；对制得的水溶液分别加盐酸调PH至2，然后用亚硝酸 盐进行硝化反应1. 5小时，再调PH至7，备用；
(3)多硫酸软骨素的检测C、制胶板先配制醋酸-锂盐缓冲液，取冰醋酸50mL，加水SOOmL混合后，用氢氧 化锂调节PH值至3. 0，再加水定溶至IOOOmL ；取琼脂糖0. 2g加入IOmL的水中，置水浴中加 热使其完全溶解，向琼脂糖溶液中加入温热的醋酸_锂盐缓冲液IOmL (其温度与琼脂糖溶 液温度接近)，混合均勻后，趁热将胶液涂布于(4cmX9cm)的玻板上，厚度约3mm，静置，待 凝胶结成无气泡的均勻薄层，即可d、点样与电泳在电泳槽内加入本步骤c配制的醋酸-锂盐缓冲液，将凝胶板置于 电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液；于凝胶板负极端分别用步骤(2)得到的样品溶液1 点样，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm、电流强度l-2mA/cm的条件下，电泳约20分钟， 关闭电源；e、染色与脱色取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，再用水洗去多余的染色液至背 景无色为止；甲苯胺蓝溶液配制一般可用甲苯胺蓝0. Ig溶解于IOOmL水中制得；f、观察标准样品与对照样品所显示的迁移距离，标准品与对照样品所显示的迁移 距离之比为0. 8-0. 9。
权利要求
一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，其特征在于包括下列步骤(1)肝素钠中多硫酸软骨素的分离制备a、溶解过滤将含有重量低于0.5％多硫酸软骨素的肝素钠样品，加入氯化钠溶液中，升温至55℃±5℃，搅拌使肝素钠完全溶解，再用碱溶液调PH至10-12，过滤收集滤液，并将滤液降温至溶液的冰点至5℃，用酸调PH至1-2，过滤收集滤液；b、快速沉淀滤液用碱调PH至5-6，搅拌下缓慢加入酒精，使溶液含酒精的重量浓度为30-38％，静置；用搅拌棒试探容器底部，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精倒出，收集沉淀物，并将其烘干；(2)样品准备将相同重量的步骤(1)含有重量低于0.5％多硫酸软骨素的肝素钠样品、步骤(1)制得的沉淀物，以及肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品分别溶解于水中；对制得的水溶液分别加酸调PH至1-3，然后用亚硝酸盐或硝酸盐进行硝化反应0.5-2小时，再用碱调PH至6.5-7.5，备用；(3)多硫酸软骨素的检测c、制胶板用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为1∶0.7-1.5，并加热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层；d、电泳在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液；取步骤(1)准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的电压梯度、电流强度的条件下电泳；e、染色和脱色取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无色为止；f、结果观察观察样品和标准品所显示的迁移距离。
2.如权利要求1所述的一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，其特征在于步 骤(3)所述电泳缓冲液为醋酸_锂盐缓冲液，缓冲液的pH值为2. 0-`4. 0。
3.如权利要求1所述的一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，其特征在于步 骤⑶所述的点样，四种样品溶液的点样量分别为0. 5-1. 5 μ 1。
4.如权利要求1所述的一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，其特征在于步 骤(3)所述的电压梯度为25-35V/cm，电流强度为l-2mA/cm，电泳时间为15-20分钟。
5.如权利要求1所述的一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，其特征在于步 骤(3)所述的染色液为甲苯胺蓝溶液。
全文摘要
本发明公开了一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，本发明用快速沉淀法将多硫酸软骨素与肝素钠分离，并进一步对分离所得物通过琼脂糖、电泳进行检测，实现了对肝素钠中含量较低的多硫酸软骨素的检测，灵敏度达到0.1％以上。本发明的电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测、观察，观察直观，容易判断。电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，且制成干膜可长期保存。
文档编号G01N27/447GK101825607SQ20101011205
公开日2010年9月8日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者刘榜惠, 张志斌, 袁红英 申请人:淮安麦德森化学有限公司