专利名称：硬质禾草内生真菌检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，确切讲是检测一种生长于植物体内的真菌的方法。本发明的方法中包括将禾草样品用染色剂进行染色，再将经染色的样品置于光镜下进行检测，或者将经染色后的样品稍加热后再置于光镜下进行检测。
背景技术：
内生真菌(endophyte)是一类生活在植物体内而不表现外部症状的真菌。禾草感染内生真菌可以引起采食的家畜中毒甚至死亡。据美国和新西兰的统计，每年仅因高羊茅内生真菌(Neotyphodium coenophialum)和黑麦草内生真菌(Lolium perenne)使牛羊患病、死亡造成的经济损失就达6亿美元之多。现已发现，生长于我国北方的醉马草(Achnatherum inebrians)中含有的内生真菌可能是引起家畜中毒的原因。但在另一方面，禾草内生真菌的侵染可以增加植物抗旱、抗虫、抗病、耐践踏等特性。因此，防治内生真菌对畜牧业的危害和利用内生真菌提高草坪草的抗逆性是当前国际研究的两大热点领域。而对禾草内生真菌的带菌状况进行检测是从事上述研究的前提。
目前国际上通用的禾草内生真菌检测方法为(1)直接光镜检测法；(2)血清学检测法；(3)分子技术检测法和(4)间接检测法。在这四种检测方法中，因后三种由于需较为复杂的前期准备，费时费工，且花费较大，一般不作为常用的检测方法，直接光镜检测法由于简便、方便，操作相对容易而被用作常用检测方法。现广泛采用的直接光镜检测法除种子糊粉层检测法外，更为简便的是叶鞘染色法，它是沿禾草叶鞘内侧撕取内皮层，再将内皮层用染色剂进行染色，然后将样品置于光学显微镜下进行检测。为使染色有更好的效果，也可以将染色后的样品稍稍加热，如将经染色后的样品放置于电热盘上或者酒精火焰上加热数秒后，再置于光镜下进行检测。但这种检测方法对于一些质地较为坚硬的禾草，如醉马草、赖草(Leymus)、冰草(Agropyron)等，很难撕取其内皮薄膜，既使撕取所得的皮层也往往厚度不够，因而影响采用叶鞘染色和光镜检测法对此类禾草内生真菌进行检测，同时也影响其检测的准确性。

发明内容
本发明提供可以对质地较为坚硬的禾草进行叶鞘染色和直接光学显微镜检测的方法。
本发明的方法分为两种，其中的第一种方法适用于检测生长期小于4周龄的早龄幼草，而第二种方法适用于检测生长期大于4周龄的老龄幼苗或成株。
本发明的第一种方法是先将禾草样品(可以是整个禾草分蘖)用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小时后，然后再进行染色处理。
本发明的第二种方法是先将禾草样品(使用叶鞘)用沸水煮4～8分钟，再沿叶鞘内侧撕取内皮层，再对内皮层进行染色处理。
与现有技术相比，本发明有如下特点1、适用于处理质地较为坚硬的禾草，而且检测的准确率高。通过本发明的方法可以使禾草组织软化和透明，从而提高了检测的准确性；2、重复性好，检测精度高。发明人曾利用本发明对甘肃的夏河、肃南、永靖、兰州、庆阳等5个不同生态区域的3000余株幼苗、成株进行检测，其效果令人满意，而且检测的重复性很好。通过已经进行的对比实验，本发明的方法与直接撕取相比，其菌丝体更为清晰；3、方法简单，易于掌握和操作；4、检测方法快速方便，而且可以对早龄幼苗整株进行直接检测。如果采用现有技术检测，必须等幼苗生长5～6周时间后才能进行。本发明则可以对早期幼苗整株直接进行检测，大大缩短了工作进程。此外，本发明的检测速度也很快，根据实际测算，每小时可每人可检测30个以上的植株。
具体实施例方式
以下提供本发明的实施例例1材料采自甘肃、青海、新疆和内蒙古的醉马草种样，经种子糊粉层染色检测找出带菌率为100％的种子，种植于16×6眼的塑料育种盘内，在15～30℃温室条件下生长，取生长期在4周以内的单株幼苗为样品。
方法将所取的早龄幼苗分蘖用5～15％的NaOH水溶液在室温下浸泡3至5小时，然后将其直接置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺蓝溶液染色，将样品轻压，再用电热盘或酒精火焰加热数秒后，在光学显微镜下进行检测。
结果2000个醉马草早龄幼苗的叶鞘经本发明处理后，其内生真菌检出率为98％。而使用现有技术，样品极难以处理，经处理所得样品检测其内生真菌检出率仅为12％。
例2材料采自甘肃、青海、新疆和内蒙古的醉马草种样，经种子糊粉层染色检测找出带菌率为100％的种子，种植于16×6眼的塑料育种盘内，在15～30℃温室条件下生长，取生长期在5周龄的老龄幼株。
方法将所取的老龄幼株叶鞘用开水煮4～6分钟，再沿叶鞘内侧撕取内皮层，将撕取的内皮层置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺蓝溶液染色，再用电热盘或酒精火焰加热数秒后，在光学显微镜下进行检测。
结果2000个醉马草成株叶鞘经本发明处理后，其内生真菌检出率为100％。而使用现有技术，样品非常难处理，且经处理所得样品进行检测，其内生真菌检出率仅为5％。
例3材料采自甘肃、青海、新疆和内蒙古的醉马草种样，经种子糊粉层染色检测找出带菌率为100％的种子，种植于16×6眼的塑料育种盘内，在15～30℃温室条件下生长，取生长期在15月龄的成株。
方法将所取的成株叶鞘用开水煮5～8分钟，再沿叶鞘内侧撕取内皮层，将撕取的内皮层置于玻片上，用0.8％的乳酸苯胺蓝溶液染色，再用电热盘或酒精火焰加热数秒后，在光学显微镜下进行检测。
结果2000个醉马草成株叶鞘经本发明处理后，其内生真菌检出率为100％。而使用现有技术，样品非常难处理，且经处理后所得样品进行检测，其内生真菌检出率仅为20％。
权利要求
1.硬质禾草内生真菌检测技术，将样品用染色剂进行染色，再将样品置于光镜下进行检测，或者将染色后的样品稍加热后再置于光镜下进行检测，其特征是首先将样品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小时后，再进行染色处理。
2.禾草中内生真菌检测技术，将样品用染色剂进行染色，再将样品置于光镜下进行检测，或者将染色后的样品稍加热后再置于光镜下进行检测，其特征是首先将样品用沸水煮4～8分钟，再沿叶鞘内侧撕取内皮层，再对撕内皮层进行染色处理。
全文摘要
本发明涉检测一种生长于植物体内的真菌的方法。本发明的第一种方法适用于幼苗，它是先将禾草样品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小时后，再进行染色处理和检测；本发明的第二种方法适用于成株，它是先将样品叶鞘用沸水煮4～8分钟，再沿叶鞘内侧撕取内皮层，再对内皮层进行染色处理和检测。本发明的方法适用于处理质地较为坚硬的禾草，而且检测的准确率高，其检测重复性好，检测精度高，方法简单、快速，易于掌握和操作。
文档编号G01N21/29GK1661357SQ20041002594
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者李春杰, 南志标 申请人:兰州大学