专利名称：一种广谱性农药残留免疫检测试纸及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于农药残留的检测试纸及其制备方法和应用，尤其是一种可用于检测多种有机磷和多种拟除虫菊酯类农药残留的免疫检测试纸及其制备方法和应用。

背景技术：
农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质，对促进农业增产有极重要的作用，但同时带来严重的环境问题生态失衡，农产品品质下降，人类身体健康受威胁。目前，有机磷、拟除虫菊酯农药具有高效的杀虫效果，是植物化学保护的主力军。随着近年来环境保护的呼声越来越高，有机磷、拟除虫菊酯农药使用带来的环境问题日益引起人们的重视。
但就目前的形势而言，人类仍面临饥饿，贫穷的困扰，全面禁止农药的使用是不现实的，为了达到高产、高效的目标，农药的地位在短期内是无法取代的。鉴于此，为保障人民的身体健康，有效控制生产中农药的合理使用和对其残留量进行监控，开发一种快速、可靠、灵敏，适于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。目前有机磷、菊酯类农药的残留分析方法主要是复杂的前处理过程，再配以高效HPLC或GC(带ECD)，这种检测方法费用相对昂贵，且须技术熟练的操作人员。免疫分析是一种快速、灵敏的用于痕量检测的方法，但农药多为小分子化合物，免疫原合成难度较大，又由于抗体有特异性，建立的免疫分析方法多只适用于单一农药残留量的检测分析，限制了免疫分析方法的应用，另现行的免疫分析多以聚苯乙烯酶标板为固相载体，检测结果一般需要3-8h，检测过程复杂。


发明内容
本发明的目的在于提供一种含有广谱性标记抗体的免疫检测试纸及其制备方法和应用。具有测定速度快、不需要特殊仪器设备的特点。
为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案 一种广谱性农药残留免疫检测试纸，该试纸采用含有对多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆或多克隆抗体的硝酸纤维素膜试纸。
所述的多种有机磷或多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆抗体是以有机磷或菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫BALB/C小鼠，每只小鼠100μg免疫原，与等体积氟氏完全佐剂混合乳化均匀，沿腹股沟注入腹腔膜内；4周后，加强免疫，剂量不变，佐剂改为氟氏不完全佐剂；加强免疫三次后，采血测小鼠效价，待血清效价不再上升时，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10∶1的比例混合于50ml离心管进行融合，融合后的细胞经培养后待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，取细胞培养上清液用酶联免疫检测，每次检测均为复孔检测，在每次检测后的第二天重复检测，以确证结果；将强阳性孔内的细胞用有限稀释法进行克隆培养，并跟踪记录，经过3次以上的克隆培养和检测，均为阳性的孔内的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；经过扩大培养后用来制备腹水；提前一周用0.5ml石蜡油注射小鼠腹腔，将106个杂交瘤细胞悬浮在1ml无血清培养基中，注入小鼠腹腔内；10天后，小鼠腹部明显膨大，收集腹水；用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化单克隆抗体。
所述的多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的多克隆抗体是以有机磷或菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫新西兰大白兔，当效价达最佳时，心脏采血，先用硫酸铵分步沉淀法初步纯化后，再经Sephadex G-200进一步纯化得到的高质量广谱性有机磷抗体或拟除虫菊酯抗体。
一种广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其制备方法包括如下步骤 1)首先采用由2×2块0.5cm×0.5cm大小的硝酸纤维素膜(NCM)，并将其每块分别取名为A1，A2，B1和B2； 2)、然后将1μL有机磷包被液点滴于A1，A2中央，1μL拟除虫菊酯包被液点滴于B1，B2中央，下面垫吸水纸，4℃过夜，于PBST漂洗3次，晾干； 3)、再是将经过步骤2)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在封闭液中浸泡30min，于PBST中漂洗3次，晾干； 4)、其次是将经过步骤3)处理后的A1、B1浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和待测样品提取液的预混合液中；A2、B2浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和阴性样品提取液的预混合液中，作为对照样，10min后于PBST中漂洗3次，晾干； 5)、然后再将经过步骤4)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在酶标二抗稀释液中10min，于PBST中漂洗3次，晾干； 6)、再将经过步骤5)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在底物反应液暗处反应5min，于PBST中漂洗3次，晾干； 7)、最后目测结果，A2、B2为阴性样品在硝酸纤维素膜上形成特异性褐色沉淀，而A1、B1为阳性样品在硝酸纤维素膜不显色或显浅褐色，A1，B1就制备成本发明检测用的试纸。
所述的有机磷包被液是指二乙基膦酸乙酸与卵清蛋白偶联物的PBS稀释液，拟除虫菊酯包被液是指间苯氧基苯甲酸与卵清蛋白偶联物的PBS稀释液。
所述的封闭液为1％卵清蛋白的PBS稀释液。
所述的样品提取液是指于20g菜样中加乙腈30mL匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，且与有机磷抗体和拟除虫菊酯抗体预混合10min后形成预混合液待测。
一种广谱性农药残留免疫检测试纸的应用，称取10g切碎的农作物样品，加乙腈30ml匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，采用本发明的方法制备的广谱性的农药残留免疫检测试纸条的吸水纸端浸入样品液10s后取出后平放，10min后观察结果，如只有对照区显色，表示样品为阴性，若样品区条带显色，表明农作物样品中有机磷或菊酯类农药残留。
本发明的有益效果是本发明针对目前农药检测中存在的实际问题，提供一种含有广谱性标记抗体的免疫检测试纸及其制备方法和应用。本发明的免疫检测试纸是一种快速检测农药残留的有效工具，可对一类农药的总残留进行定性及半定量检测，与目前通用的板上免疫检测方法相比较，具有测定速度快、不需要特殊仪器设备，且操作简便、快速、经济的优点，是目前技术发展的重点。非常适用于农产品农药现场检测和试验室对批量样品粗筛。



图1是本发明的紫外光谱图。

具体实施例方式 实施例1多种有机磷类杀虫剂免疫检测抗体的制备方法 1)、人工抗原的制备方法1 免疫原制备以二乙基膦酸乙酸为半抗原，取等摩尔量的二乙基膦酸乙酸和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N，N′-二环己基碳酰亚胺(DCC)，用二氧六环将混合物溶解，室温下避光反应过夜，去除沉淀后取上清液干燥后，残留物悬浮在3毫升溶有牛血清蛋白(BSA)的硼酸盐缓冲液中。混合物在室温下磁力搅拌1小时，4℃对1升pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析。
包被抗原为半抗原与卵清蛋白(OVA)的偶联物，制备方法与免疫原相同。
透析后的样品用紫外扫描仪进行全波长扫描鉴定偶联状况，经测定二乙基膦酸乙酸在232nm处有最大吸收峰，根据各自的OD232值计算结合比。
2)、人工抗原的制备方法2 免疫原制备先称取二乙基膦酸乙酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，低温搅拌。取水溶性碳二亚胺(EDC)溶于1mlDMF中，缓慢加入到上述DMF中，另取BSA20mg溶于2mlDMF中，4℃搅拌，缓慢加入到上述混合液中。4℃搅拌反应8h，再于14℃反应过夜，次日2000g离心10min，取沉淀，透析、鉴定步骤同上。
包被抗原为半抗原与卵清蛋白(OVA)的偶联物，制备方法与免疫原相同。
通过上述2种方法制备的人工抗原样品进行紫外分析后得出如图1所示，图中a和b为由人工抗原制备方法1(活性酯法)制备的2个人工抗原样品；图中c和d为由人工抗原制备方法2(碳化二亚胺法)制备的2个人工抗原样品；图中3种物质由上到下分别是载体蛋白BSA、载体蛋白BSA与半抗原偶联物、半抗原。可以看出在254nm处半抗原有一波谷，载体-抗原偶联物也有波谷出现，二者在此处发生吸收峰的叠加。另外在210nm、238nm处也有明显的吸收叠加现象。说明二者之间发生了反应，可以推断半抗原和载体蛋白BSA成功偶联。根据上述推测方法，可以确定图2-b、2-c、2-d中3种物质也已成功偶联。
3)、多克隆抗体的制备与纯化 免疫程序为首先，剂量为每千克兔子体重1mg免疫原，加氟氏完全佐剂将抗原制成油包水乳浊液，背部皮下多点注射；隔2周第二次免疫，加氟氏不完全佐剂；此后，每隔3周免疫1次，方法同第二次免疫；第四次开始，每次免疫后一周兔耳缘静脉采少量血，分离血清，采用间接竞争ELISA法测定抗体效价。效价合格后，进行最后1次免疫，用加倍量抗原的生理盐水稀释液耳缘静脉注射，1周后心脏采血致死，分离抗血清，并采用辛酸-硫酸铵二步沉淀法纯化抗体，制成冻干粉，于-20℃保存备用。利用方阵滴定法将两种抗血清用两种包被原分别进行检测，确定最佳的抗原-抗体组合及其最佳工作浓度。
多种有机磷抗体效价测定结果见表1，由表1可以看出，用EDC法(人工抗原制备方法2)合成抗原免疫动物的效果与活性酯法(人工抗原制备方法1)相比较差。活性酯型抗原产生的抗体对EDC法制备的抗原有微弱的识别能力；EDC型抗原产生的抗体对活性酯法制备的包被原没有任何作用。主要原因可能是EDC法制备的抗原不能使抗原决定簇充分暴露，所以没有获得高度亲和力的抗体。分泌抗体效价为25600的兔子效价最高，以该抗体作为进一步研究。利用该抗体进行方阵滴定，所得结果表明抗原、抗体最佳工作浓度均为2000倍。
4)、抗体对不同有机磷药剂的交叉反应， 表2为抗体对不同农药的交叉反应结果显示表，从表2可以看出，所得抗体对多种农药产生了识别反应。抗体对抗原先导物二乙基膦酸乙酸有较强的亲和力，I50为0.0143μg/mL。本方法在乐果和氧乐果之间的选择性差异较大，二者结构上的差别在于P＝O和P＝S键不同，其余基团都相同。抗体对氧乐果有很强的亲和力，但对乐果的亲和力很弱，由此可以看出在抗原激活免疫系统产生抗体的过程中，P＝O键起了决定性的作用。但是抗体对毒死蜱、二嗪农、乙基对硫磷的IC50均小于1μg/mL，这3种农药都含有共同的结构(C2H5O-)，说明C2H5O-也是作为一个抗原决定簇而存在的，起着非常重要的作用。丙溴磷因为含有一个C2H5O--和一个P＝O，而使抗体对其有较强的识别作用，I50为0.97μg/mL。水胺硫磷、马拉硫磷、甲基对硫磷等对抗原-抗体反应抑制能力较差，说明抗体对这些药剂没有或只有微弱的识别能力。从以上的结果可以看出，在二乙基膦酸乙酸羧基端偶联载体蛋白，可以使膦酸基团上的C2H5O--和一个P＝O充分暴露作为抗原决定簇，刺激动物产生抗体，对含有这一通用结构的有机磷类杀虫剂具有广泛的亲和力。
当然本实施例也可以采用单克隆抗体，单克隆抗体的制备与纯化是以有机磷类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫BALB/C小鼠，每只小鼠100μg免疫原，与等体积氟氏完全佐剂混合乳化均匀，沿腹股沟注入腹腔膜内；4周后，加强免疫，剂量不变，佐剂改为氟氏不完全佐剂；加强免疫三次后，采血测小鼠效价，待血清效价不再上升时，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10∶1的比例混合于50ml离心管进行融合，融合后的细胞经培养后待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，取细胞培养上清液用酶联免疫检测，每次检测均为复孔检测，在每次检测后的第二天重复检测，以确证结果；将强阳性孔内的细胞用有限稀释法进行克隆培养，并跟踪记录，经过3次以上的克隆培养和检测，均为阳性的孔内的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；经过扩大培养后用来制备腹水；提前一周用0.5ml石蜡油注射小鼠腹腔，将106个杂交瘤细胞悬浮在1ml无血清培养基中，注入小鼠腹腔内；10天后，小鼠腹部明显膨大，收集腹水；用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化单克隆抗体。
实施例2多种拟除虫菊酯类杀虫剂免疫检测抗体的制备方法 1、抗体制备以间苯氧基苯甲酸为半抗原，通过活化酯法和6-氨基己酸法制备人工免疫抗原和包被抗原。以人工免疫原通过皮下多点注射免疫健康雄性新西兰大白兔，6个月后制备得到多克隆抗体。
2、抗体的纯化取5ML抗体与等量生理盐水于搅拌下逐滴加入等量的饱和硫酸铵，4℃下放置过夜，使其充分沉淀，离心3000转20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至12ml，在逐滴加饱和硫酸至18ml，置4℃保存过夜，重复上述第二步过程1次，将末次离心后所得沉淀物以0.02mol/l PBS溶解至5ml，装入透析，用0.02mol/lPBS中透析。
3、多克隆抗体检测拟除虫菊酯农药 抗体可识别氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯，结果表明PBA-抗体和CPA-抗体不仅能识别半抗原，而且识别含半抗原结构在内的大分子化合物，溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯交叉反应也有一定的交叉识别。
当然本实施例也可以采用单克隆抗体，单克隆抗体的制备与纯化是以菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫BALB/C小鼠，每只小鼠100μg免疫原，与等体积氟氏完全佐剂混合乳化均匀，沿腹股沟注入腹腔膜内；4周后，加强免疫，剂量不变，佐剂改为氟氏不完全佐剂；加强免疫三次后，采血测小鼠效价，待血清效价不再上升时，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10∶1的比例混合于50ml离心管进行融合，融合后的细胞经培养后待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，取细胞培养上清液用酶联免疫检测，每次检测均为复孔检测，在每次检测后的第二天重复检测，以确证结果；将强阳性孔内的细胞用有限稀释法进行克隆培养，并跟踪记录，经过3次以上的克隆培养和检测，均为阳性的孔内的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；经过扩大培养后用来制备腹水；提前一周用0.5ml石蜡油注射小鼠腹腔，将106个杂交瘤细胞悬浮在1ml无血清培养基中，注入小鼠腹腔内；10天后，小鼠腹部明显膨大，收集腹水；用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化单克隆抗体。
实施例3免疫检测试纸的制备方法 先建立酶联免疫分析法，优化抗原、抗体的工作条件，并在此基础上进一步研究快速检测试纸最佳工作条件。
该试纸由2×2块0.5cm×0.5cm大小的硝酸纤维素膜(NCM)(A1，A2，B1，B2)组成，其测定程序为1、将1μL有机磷包被液点滴于A1，A2中央，1μL拟除虫菊酯包被液点滴于B1，B2中央，下面垫吸水纸，4℃过夜，于PBST漂洗3次，晾干。2、将NCM浸在封闭液中浸泡30min，于PBST中漂洗3次，晾干。3、将A1、B1浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和待测样品提取液的预混合液中，A2、B2浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和阴性样品提取液的预混合液中(作对照)，10min后于PBST中漂洗3次，晾干；4、将NCM浸在酶标二抗稀释液中10min，于PBST中漂洗3次，晾干；5、将NCM浸在底物反应液暗处反应5min，于PBST中漂洗3次，晾干；6、目测结果，A2、B2为阴性样品在硝酸纤维素膜上形成特异性褐色沉淀，而A1、B1为阳性样品在硝酸纤维素膜不显色或显浅褐色，A1，B1就制备成本发明检测用的试纸。
实施例4应用免疫检测试纸检测黄瓜中有机磷和拟除虫菊酯农药残留 称取10g切碎的黄瓜样品，加乙腈30ml匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，将实施例3制备的试纸条的吸水纸端浸入样品液10s后取出后平放，10min后观察结果，如只有对照区显色，表示样品为阴性。若样品区条带显色，表明黄瓜样品中有机磷或菊酯类农药残留。本实施例的样品样品区条带显色，表明黄瓜样品中有机磷或菊酯类农药残留。
实施例5应用免疫检测试纸检测小青菜中有机磷和拟除虫菊酯农药残留 称取20g菜样，加乙腈50ml匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，将实施例3制备的试纸条的吸水纸端浸入样品液10s后取出平放，10min观察结果，只有对照区显色，表示样品为阴性，表明菜样品中没有机磷或菊酯类农药残留。
表1多种有机磷抗体效价测定结果
表2抗体对不同农药的交叉反应


权利要求
1.一种广谱性农药残留免疫检测试纸，其特征在于该试纸采用含有对多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆或多克隆抗体的硝酸纤维素膜试纸。
2.如权利要求1所述的一种广谱性农药残留免疫检测试纸，其特征在于所述的多种有机磷或多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的多克隆抗体是以有机磷或菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫新西兰大白兔，当效价达最佳时，心脏采血，先用硫酸铵分步沉淀法初步纯化后，再经Sephadex G-200进一步纯化得到的高质量广谱性有机磷抗体或拟除虫菊酯抗体。
3.一种如权利要求1所述的广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤
1)首先采用由2×2块0.5cm×0.5cm大小的硝酸纤维素膜，并将其每块分别取名为A1，A2，B1和B2；
2)、然后将1μL有机磷包被液点滴于A1，A2中央，1μL拟除虫菊酯包被液点滴于B1，B2中央，下面垫吸水纸，4℃过夜，于PBST漂洗3次，晾干；
3)、再是将经过步骤2)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在封闭液中浸泡30min，于PBST中漂洗3次，晾干；
4)、其次是将经过步骤3)处理后的A1、B1浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和待测样品提取液的预混合液中；A2、B2浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和阴性样品提取液的预混合液中，作为对照样，10min后于PBST中漂洗3次，晾干；
5)、然后再将经过步骤4)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在酶标二抗稀释液中10min，于PBST中漂洗3次，晾干；
6)、再将经过步骤5)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在底物反应液暗处反应5min，于PBST中漂洗3次，晾干；
7)、最后目测结果，A2、B2为阴性样品在硝酸纤维素膜上形成特异性褐色沉淀，而A1、B1为阳性样品在硝酸纤维素膜不显色或显浅褐色，A1，B1就制备成本发明检测用的试纸。
4.如权利要求3所述的一种广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其特征在于所述的有机磷包被液是指二乙基膦酸乙酸与卵清蛋白偶联物的PBS稀释液，拟除虫菊酯包被液是指间苯氧基苯甲酸与卵清蛋白偶联物的PBS稀释液。
5.如权利要求3所述的一种广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其特征在于所述的封闭液为1％卵清蛋白的PBS稀释液。
6.如权利要求3所述的一种广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其特征在于所述的样品提取液是指于20g菜样中加乙腈30mL匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，且与有机磷抗体和拟除虫菊酯抗体预混合10min后形成预混合液待测。
7.一种广谱性农药残留免疫检测试纸的应用，其特征在于称取10g切碎的农作物样品，加乙腈30ml匀浆1min，抽滤后加5-7g氯化钠盐析，取其上清液为样品提取液，采用本发明的方法制备的广谱性的农药残留免疫检测试纸条的吸水纸端浸入样品液10s后取出后平放，10min后观察结果，如只有对照区显色，表示样品为阴性，若样品区条带显色，表明农作物样品中有机磷或菊酯类农药残留。
全文摘要
本发明公开了一种广谱性农药残留免疫检测试纸，该试纸采用含有对多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆或多克隆抗体的硝酸纤维素膜试纸，以及此种试纸的制备方法和应用。本发明具有测定速度快、不需要特殊仪器设备的特点。
文档编号G01N33/558GK101813697SQ20101014844
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者徐敦明, 卢声宇, 黄蓬英, 周昱, 张缙, 杨方, 陈鹭平 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心