专利名称：酶法测定锌离子含量的方法及锌离子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶法测定血清、血浆等样品中锌离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的锌离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
锌元素与生物的生长发育有关，具有重要的生理功能、营养作用和临床诊疗意义。测定血清中锌离子含量及Cu2+/Zn2+比值，对评价机体锌元素的营养状况和诊疗许多疾病均具有重要的实用价值。
现有技术中锌离子的测定方法有络合滴定法、荧光光度法、比色法、极谱法、原子吸收分光光度法、阳极溶出伏安法和中子活化法等。络合滴定法耗时费力，标本用量大，特异性低；荧光光度法操作简单，但需要具备荧光光度计；极谱法中，单扫描示波极谱仪操作简便，特异性较好，一些实验室采用这种小型仪器检测锌离子；阳极溶出伏安法是利用沉积在电极上的锌溶出之后，检测其阳极电流强度，该电流强度与锌的浓度成正比；原子吸收分光光度法(AAS法)，具有特异性高(干扰小)、检出限低(样品量少)、精密度好(CV≤3.6％)、回收率高(达到99％)、准确度高等优点，能够最为准确地分析样品中锌元素的含量，其操作方法也比较简单，但仪器价格十分昂贵。
相对而言比色法应用较为普遍。该方法检测锌离子快速、灵敏度高，能够得到与AAS法近似的结果，但操作步骤较为复杂。比色法一般都要加入盐酸胍或者三氯醋酸等物质，使锌离子及其它金属离子从蛋白结合物中释放出来；加入氰化物作掩蔽剂，使其络合除了锌离子之外的其它金属离子；加入水合氯醛作为暴露剂，并避免氰化物与锌离子络合，使锌离子能够特异地与吡啶偶氮酚类化合物反应显色。常用的显色剂及其与锌离子络合后在最大吸收峰的摩尔吸光系数(单位L·mol-1·cm-1)为1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚，56,000；1-[(5-氯-2-吡啶)偶氮]-2-萘酚，69,000；4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚，84,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙基氨基酚，120,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-n丙基-N-3-磺化丙氨基)酚，130,000。
酶法测定锌离子是近年来发展起来的新方法。该方法操作最为方便、易于自动化，且价格低廉、特异性高、精密度好，是非常适合国情、应用前景十分看好的一种检测方法。但是，应用不同的检测试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大差别，直接影响到该方法的使用与推广，这正是人们在该领域内不断研究、发展和创新的原因所在。

发明内容
本发明的目的是提供一种酶法测定锌离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的锌离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中锌离子的含量进行快速、准确测定，以便推广使用酶法检测锌离子的方法以及相应的诊断试剂盒，使该领域内检测手段得到进一步丰富和发展。
为实现本发明的目的之一，一种酶法测定钠离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将需要测定的样品与含有4-硝基酚磷酸和碱性磷酸酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长405nm的吸光度的上升速度，进而测算出样品中锌离子的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在505nm以上。
实现本发明另外一个目的——锌离子诊断试剂盒，可以是由以下成分组成的单剂缓冲液 40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，碱性磷酸酶 4000～60000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
也可以将以上单剂中的成分进行组合配制成双剂，使试剂更为稳定，比如 双剂配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I和试剂II中成分可以互换，从而形成多种配方。
以上配制锌离子诊断试剂盒时，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种，但选择范围同样不受这些列举所限制。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 80～120mmol/l，4-硝基酚磷酸 5～15mmol/l，碱性磷酸酶 14000～30000U/l，稳定剂/试剂总体积 20～50％。
本发明应用碱性磷酸酶反应比色法，在锌离子的激活下，碱性磷酸酶酶解4-硝基酚磷酸(4-Nitrophenyl Phosphate)成为4-硝基酚和磷酸根。4-硝基酚在405nm有吸收峰，从而使得405nm处的吸光度上升，反应所引起的吸光度变化与样品中锌离子的含量成正比。这样，通过在固定时间间隔内测定主波长405nm处吸光度的上升速度，便能定量反映出样品中锌离子的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过锌离子激活碱性磷酸酶的特性，定量反映出被测样品中锌离子的含量，测试结果准确，不受样品中是否存在其它金属离子的影响；(2)参与酶反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内锌离子的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中的锌离子；(6)本发明提供的液态锌离子诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种成分的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制锌离子诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，4-硝基酚磷酸 5mmol/l，碱性磷酸酶 14000U/l，乙二醇 50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测锌离子样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(吸光度上升，下同)。
加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录405nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中锌离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂例之一)按以下成分和用量配制锌离子诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 10mmol/l，甘油 50％(占试剂I总体积)；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，碱性磷酸酶 20000U/l，乙二醇 50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测锌离子样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录405nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中锌离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(双剂例之二)按以下成分和用量配制锌离子诊断试剂盒
试剂I——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，碱性磷酸酶 25000U/l，甘油 50％(占试剂I总体积)；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 12mmol/l，丙二醇 20mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测锌离子样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录405nm主波长吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中锌离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出样品的中锌离子的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受样品中是否存在其它金属离子的影响，也不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的锌离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中锌离子的含量。
权利要求
1.一种酶法测定锌离子含量的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有4-硝基酚磷酸和碱性磷酸酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长405nm的吸光度的上升速度，测算出样品中锌离子的含量。
2.根据权利要求1所述的酶法测定锌离子含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的酶法测定锌离子含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在505nm以上。
4.一种锌离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，碱性磷酸酶4000～60000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
5.根据权利要求4所述的锌离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的锌离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的锌离子诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
8.权利要求4～7中任意一种锌离子诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或双剂。
全文摘要
本发明涉及酶法测定锌离子含量的方法及锌离子诊断试剂盒。发明应用碱性磷酸酶反应比色法，在锌离子的激活下，碱性磷酸酶酶解4－硝基酚磷酸生成4－硝基酚，通过检测405nm主波长吸光度的上升速度，定量反映出样品中锌离子的含量。该方法特异性高，不受样品中其它金属离子的影响，也不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。
文档编号G01N21/31GK1786695SQ200410066189
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司