专利名称：用于检测牛slc35a3基因v180f突变的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测牛SLC35A3基因V180F突变的 引物和特异性的TaqMan MGB探针。
背景技术：
遗传缺陷指的是由于生殖细胞或受精卵中的遗传物质发生了结构或功能上的改 变，从而使发育成的个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害。奶牛群体中遗传疾 病基因的频率较高，这与奶牛高强度选择有关。世界奶牛经过几十年的高强度选育，种公牛 的血缘关系越来越近，由此增加了有害基因快速传播的风险，一旦种公牛带有某种遗传缺 陷，通过人工授精技术，遗传缺陷基因会在牛群中迅速扩散。近年来，我国大量从国外进口种牛、胚胎和冷冻精液，一方面充分利用了国际上优 秀种质资源，有利于提高我国奶牛的遗传改良进展，但另一方面，也增加了遗传缺陷在我国 范围内快速传播的风险，因此需要建立起重要遗传缺陷的检测方法，严格控制遗传缺陷的 发生。脊柱畸形综合症(Complex Vertebral Malformation, CVM)是由丹麦科学家于 2001年报道的一种单基因控制的牛常染色体隐性遗传缺陷，其隐性纯合子胎儿有早产、死 产，体型较小、体重偏轻及颈胸结合部附近椎骨融合和畸形等症状，其中50%的案例伴有 心脏病变，而CVM携带者表型正常，亦无发病表现。研究发现，CVM的致病机理是牛3号 染色体上编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白(UDP-N-acetylglucosamine transporter)的SLC35A3基因的一个单碱基突变，编码第180位氨基酸的核苷酸由 GTT突变为TTT，该突变导致氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸(V180F)，从而影响尿苷二磷 酸-氮-乙酰氨基葡萄糖从细胞质中转运到高尔基体中，导致发病。CVM是当前荷斯坦牛中一种广泛的遗传缺陷，根据日本、瑞典、波兰、德国等所报道 的检测结果，CVM携带频率高达13 32%。CVM严重影响荷斯坦牛繁殖性能，造成巨大的 经济损失，因此世界各国都采取严格措施控制和降低CVM致病基因频率。借助分子检测方法确定公牛CVM基因型，在种公牛中逐渐淘汰CVM携带者，是降低 CVM遗传缺陷基因频率的最有效措施。CVM由单碱基突变引起，故CVM分子检测的本质是突 变位点(SNP)基因型的判定。目前已报道的用于检测CVM遗传缺陷基因的方法主要包括引 入酶切位点聚合酶链式反应(PIRA-PCR)方法和聚合酶链式反应-单链构象多态(SSCP)方 法，但这些方法存在步骤繁琐，耗时长，灵敏度低、检测结果易受实验条件的影响等缺点。聚合酶链式反应_限制性片段长度多态(PCR-RFLP)方法是检测单碱基突变的 常用方法之一，但前提是所检测的位点必须有已知的限制性酶切位点。对于无限制性酶 切位点的情况，则可以通过设计包含酶切位点的错配引物来克服，即在引物中引入酶切位 点法 PCR(Primer-Introduced Restriction Analysis, PIRA—PCR)，因此该方法可认为是 PCR-RFLP的特殊应用。其原理是根据单碱基突变位点两侧的序列设计PCR引物，其中一条 引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，其PCR产物可用类似PCR-RFLP的方法进行分析。 该方法首先需要考虑到多态性位点邻近序列的情况设计特殊的引物，检测过程需要3个步 骤①利用聚合酶链式反应扩增目的片段；②扩增产物的限制性内切酶消化；③酶切产物 的琼脂糖凝胶电泳检测。显然，PIRA-PCR方法具有步骤繁琐，耗时长的缺点。此外，由于引 物上引入酶切位点，而引物通常只有20个碱基长度，当PCR产物被酶切开，会出现两条长度 相差甚小的条带，这样需要高分辨率的琼脂糖电泳检测，否则可能出现假阳性或假阳性。PCR-SSCP方法的原理是，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发 生改变时，会影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯 酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以敏锐地将 构象上有差异的分子分离开。其基本过程是①利用聚合酶链式反应扩增目的片段；②将 PCR扩增产物在高温条件下变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分 子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染 或溴化乙锭显色分析结果。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤繁琐，胶薄而易碎，试验药品毒性 大，一次最多可检测的个体少，检测效率低，因此不适宜作为大样本检测的方法。实时荧光定量TaqMan SNP分型技术是一种基于实时荧光定量PCR的单核苷酸多 态性(SNP)检测方法，由美国ABI公司研发，基本原理是利用DNA聚合酶的5' — 3'核酸 酶外切功能来水解探针，通过探针报告基团发出的荧光来检测PCR产物的基因型。等位基 因分型需要两条探针(TaqMan探针)和一对引物，一条探针对应一个等位基因，每条探针在 5'和3'各有一个含有荧光的报告基团和淬灭基团。当探针完整时，由于报告基团距离淬 灭基团很近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收。在PCR进行过程中，正反向引物在DNA 聚合酶的引导下合成一个特定分子DNA，探针可以和目的DNA杂交，DNA聚合酶的5 ‘ — 3 ‘ 核酸酶外切功能可以水解这个杂合分子，这样探针被水解后，5'的报告基团和3'淬灭基 团被分开，5'报告基团发出荧光，根据荧光的颜色即可判定等位基因的基因型。PCR反应 在实时荧光定量PCR仪上进行，仪器每个PCR循环过程中收集一次荧光信号，随着PCR反 应的进行荧光信号不断累积，根据荧光信号的种类及信号强度，判定SNP基因型。TaqMan MGB探针是对传统TaqMan探针的改进，其优点是3'端的淬灭基团是不发光的淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher, NFQ)，因此当淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大 大降低了本地信号的干扰；此外，TaqMan MGB探针还具有更强的序列特异性，实验结果更精 确可靠等优点。总之，实时荧光定量TaqMan SNP分型技术与传统方法相比有诸多优点，包 括检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判型，反应全过程在 封闭的管内进行，减少了交叉污染。

发明内容
本发明的目的是克服现有的采用引入酶切位点聚合酶链式反应(PIRA-PCR)以 及聚合酶链式反应-单链构象多态(SSCP)方法检测CVM遗传缺陷基因存在步骤繁琐， 耗时长，灵敏度低、检测结果易受实验条件的影响等缺点，提供一种能够准确高效地检测 SLC35A3基因V180F突变位点的合适引物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探 针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测牛SLC35A3 V180F突变位点基因 型，从而准确筛查CVM遗传缺陷携带者。
为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测牛SLC35A3基因V180F突变的引 物和探针，所述引物包括上游引物SLC35A3 F :5，-AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT-3，和下游引 物 SLC35A3 R :5’ -CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAGC-3，。上游引物由22个碱基组成，对应GenBank中牛SLC35A3基因序列(Accession number :AY160683)的第9840 9861位碱基；下游引物由23个碱基组成，对应SLC35A3基 因序列的第9896 9918位碱基序列。该引物对的扩增片段长度为79bp。所述探针包括1)突变型等位基因探针 SLC35A3-mutant :5，-FAM-TCATGGCATTTCTCA-NFQ ；以及2)野生型等位基因探针 SLC35A3-wild :5，-VIC-TCATGGCAGTTCTCA-NFQ。突变型等位基因的探针SLC35A3-mutant，由15个碱基组成，对应SLC35A3基因序 列的第9863 9877位碱基序列，针对突变碱基T (第180位氨基酸为苯丙氨酸F)，探针 5’端连接了荧光基团FAM ；野生型等位基因的探针SLC35A3-wild，由15个碱基组成，对应 SLC35A3基因序列的第9863 9877位碱基序列，针对野生型碱基G (第180位氨基酸为缬 氨酸V)，探针5’端连接了荧光基团VIC。两个探针的3’端标均记有淬灭基团，该基团为不 发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher, NFQ)。本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。一种筛查牛脊柱畸形综合症(CVM)基因携带者的方法，包括以下步骤(1)提取待测牛的基因组DNA ；(2)采用实时荧光定量PCR技术，以待测牛的基因组DNA为模板，用上述引物对和 两条探针进行PCR扩增；(3)对步骤(2)的扩增产物进行基因型判定如果突变型等位基因探针所标记荧 光染料(FAM，其激发波长465nm，发射波长510nm)的荧光强度呈S型增长，而野生型等位基 因探针所标记荧光染料(VIC，其激发波长533nm，发射波长580nm)的荧光强度无S型增长， 表示被测样本基因型为TT;反之，如果野生型等位基因探针所标记荧光染料(VIC)的荧光 强度呈S型增长，而突变型等位基因探针所标记荧光染料(FAM)的荧光强度无S型增长，表 示被测样本基因型为GG ；如果两种荧光强度均呈S型增长，则被测样本基因型为TG。(4)最后可以通过专门的分析软件，进行等位基因分型。为了便于检测结果分析，可在PCR扩增步骤中增加已知基因型的阳性对照和阴性 对照。其中，突变纯合基因型(TT)阳性对照来自突变型等位基因的克隆子，野生型基因型 (GG)是已经过测序验证的样本，杂合型(TG)是经过DNA测序验证的样本。阴性对照不加任 何模板DNA。另外，本发明还提供含有上述引物和特异性探针的用于检测牛SLC35A3基因 V180F突变位点的试剂盒。本发明首次提供一种能够准确高效地检测牛SLC35A3基因V180F突变位点的引物 和特异性的TaqMan MGB探针，具有以下优点(1)所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测SLC35A3基因V180F突变。(2)检测过程只经一个酶反应步骤，即可得出判型结果，无需PCR后反应，步骤简 单、耗时短。
(3)所用的反应体系和反应条件稳定，检测结果可靠。(4)反应的整个过程在封闭的管中进行，减少了污染。(5)工作流程简单，只需混合DNA模板、引物和探针试剂即可进行仪器检测，易于掌握。(6)该方法灵敏性高，对DNA的浓度要求低，只要l-20ng即可。


图1为本发明实时荧光定量PCR仪对FAM荧光信号的检测结果。图2为本发明实时荧光定量PCR仪对VIC荧光信号的检测结果。图3为本发明5个被检测个体及1个阴性对照样品的荧光信号散点图，其中1，2 代表野生型纯合子，3,4,5代表携带者，6代表阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1、DNA 提取(1)牛血液DNA提取采用天根生化生物技术公司DP318试剂盒从血块中提取基因组DNA，具体步骤如 下1)取出样品，融化后，剪取200 μ L于2mL离心管中；
2)加入600 μ L细胞裂解液CL，摇勻；3) IOOOOrpm离心lmin，弃去暗红色上清；4)重复 2)和 3) —次；5)加入200 μ L缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；6)加入20 μ L蛋白酶K，220 μ L缓冲液GB，充分晃动摇勻；7)56°C烘箱中消化3小时以上，消化早期，需颠倒混勻数次，直至溶液变澄清，无 血块颗粒；8)加入200 μ L无水乙醇，轻轻晃动混勻，转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃
去收集管中的暗绿色废液；9)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去收集管中废液；10)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；11)加入500 μ L漂洗液Pff, 12000rpm离心30s,弃去废液；
12) 12000rpm 离心 2min ；13)将吸附柱转移到新的1. 5mL离心管中，开口凉干；14)加入100 μ L在64°C预热的洗脱缓冲液TB，静置2min ；15) 12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液中，4°C保存 备用或-20°C长期保存。(2)公牛冻精DNA提取1)将细管冻精(0. 25ml)转移到2mL离心管中，加入500 μ L生理盐水，涡旋离心，弃废液保留沉淀，重复以上操作一次；2)向沉淀中加入400 μ L冻精裂解液(含DTT)、100 μ L 20%的SDS,涡旋，最后加 入10 μ L的蛋白酶K(储液浓度20mg/mL)，充分混勻，56°C消化4h或过夜；3)消化结束，加入300 μ L饱和食盐水，颠倒混勻，低温离心，去除蛋白质杂质，将 上清液转管保留，并加入1000 μ L冰乙醇，轻轻颠倒混勻至絮状沉淀不再增加，再离心，此 时弃去上清液，所得的沉淀即DNA，用500 μ L 75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发， 最后加适量TE缓冲液溶解，-20°C保存。2、PCR 扩增PCR反应体系基因组DNA l_20ng，上、下游引物浓度各900nM和探针浓度各 200nM，IX TaqMan 通用 PCR 扩增预混试剂(TaciMan Universal PCR Master Mix，购自美 国应用生物系统公司)。其中，上游引物为SLC35A3-F:5，-AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT-3，和下游 引物为 SLC35A3-R :5’ -CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAGC-3’。探针为突变型等位基因 探针 SLC35A3-mutant :5，-FAM-TCATGGCATTTCTCA-NFQ，以及野生型等位基因探针 SLC35A3-wild :5’ -VIC-TCATGGCAGTTCTCA-NFQ。PCR反应条件:95 V，预变性IOmin ；95°C变性15s，60°C退火/延伸Imin,共50个循环。仪器罗氏LightCycler 480型实时荧光定量PCR仪。3、结果分析在实时荧光定量PCR仪中，实时检测整个扩增中两种荧光的强度。反应结束后，再 用罗氏Endpoint Genotyping analysis软件分析结果。图1是实时荧光定量PCR仪对FAM 荧光信号(激发波长465nm，发射波长510nm)的监测结果，反映突变型等位基因(SLC35A3 180F)的扩增情况，每一条曲线代表一个样本，CVM携带者出现典型的S形扩增曲线，而野生 型纯合子和阴性对照的荧光信号接近0。图2是实时荧光定量PCR仪对VIC荧光信号(激 发波长533nm，发射波长580nm)的监测结果，反映野生型等位基因(SLC35A 180V)的扩增 情况，每一条曲线代表一个样本，野生型纯合子和CVM携带者都出现S形扩增曲线，而阴性 对照的荧光信号接近0。图3是所分析的5个被检测个体及1个阴性对照荧光信号的散点 图，从中可以直观地区分个体基因型，其中样品编号3，4，5代表携带者，样品编号1，2代表 野生型纯合子，样品编号6代表阴性对照。所有检测样品均进行DNA测序验证，测序结果与本发明方法所检测结果一致，在 突变位点上野生型样品的基因型为GG，携带者为杂合型TG，证明本发明提供的技术方法检 测结果准确可靠。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于检测牛SLC35A3基因V180F突变的引物和探针，所述引物包括上 游弓丨物 SLC35A3 F :5，-AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT-3，和下游弓丨物 SLC35A3 R 5，-CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAGC-3，；所述探针包括1)突变型等位基因探针SLC35A3-mutant :5，-FAM-TCATGGCA TTTCTCA-NFQ ；以及2)野生型等位基因探针SLC35A3-wild :5，-VIC-TCATGGCAGT TCTCA-NFQ。
2.含有权利要求1所述的引物和探针检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种能够准确高效地检测SLC35A3基因V180F突变位点的引物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测牛SLC35A3V180F突变位点基因型，从而准确筛查牛脊柱畸形综合症(CVM)遗传缺陷携带者。与传统的检测技术相比具有诸多优点，包括检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
文档编号G01N21/64GK102002526SQ201010547539
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者俞英, 孙东晓, 张毅, 张沅, 张胜利, 王雅春, 范学华 申请人:中国农业大学