专利名称：动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚a的方法
技术领域：
本发明涉及动物中人工合成激素的提取方法，具体涉及从动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法。
背景技术：
目前，家禽、鱼、虾或蟹的养殖业发达，虽然动物饲养中规定不得使用促生长激素，但由于己烯雌酚等人工合成激素的促生长效果显著，以及双酚A的广泛用途成为人们随处可接触到的环境污染物，动物源性食物中可能有这些类雌激素的残留，人食用后影响身体健康。因此检测动物组织中己烯雌酚等类雌激素残留量，保障动物源性食品安全就显得尤为重要。检测动物组织中己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A等残留量的方法多种多样，有酶标法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法或拉曼光谱法等。气相色谱-质谱法一般采用乙腈、乙酸乙酯或乙醚等有机溶剂提取，然后用固相萃取柱净化，浓缩并衍生化，定容后上机分析。仪器测定时选用HP-5MS柱为色谱分离柱，外标法定量。如SN/T 1744-2006《进口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚残留量的检验方法气相色谱-串联质谱法》，该方法的样品提取溶剂用乙醚，MAX固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生，色谱柱是HP-5MS柱，定量方法为外标法；该方法介绍的己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的检出限依次为3μ g/kg、5y g/kg、5y g/kg。吴银良等报导了“气相色谱法测定动物组织中三种1，2- 二苯乙烯类药物的残留量”(色谱，2006.24 (5)，462-465)，则以乙酸乙酯作为样品中己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的提取溶剂，提取液虽经10%碳酸钠除去样品中带入的酸性物质，再用硅胶固相柱进一步净化，但净化仍不是十分的彻底。目前气相色谱-质谱法每一样品需耗一根固相萃取柱，所需成本较高，提取时净化效果也不是十分地理想。只能用外标法测定己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚等，检出限较高。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法，该方法选用合适的提取试剂和净化试剂，不需采用固相萃取柱就能达到净化的目的，且己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A净化较彻底。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法，其步骤如下:
a、称取5.0Og已匀浆的动物肌肉试样置于具塞的第一离心瓶中，加入10 20ml乙腈匀质，2000rpm离心5min，上清液转移到具塞的第二离心瓶中，第一离心瓶中再加入10 20ml乙腈,摇勻后，2000rpm离心5min,上清液合并于第二离心瓶中；
b、第二离心瓶中，加入16ml正己烧和4ml二氯甲烧,摇勻后,2000rpm离心3min,弃去上层正己烷相；这样大部分非极性物质一起被除去；
C、第二离心瓶中再加入IOml 二氯甲烧和5ml正己烧,摇勻后，2000rpm离心3min,将有机相转移到梨形瓶中，40°C下旋转蒸发至干，得到含己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A提取物。第二离心瓶中液体分三层，上层为正己烷相，中间层为乙腈-二氯甲烷相，下层为水相，己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A等人工合成激素大多溶于乙腈-二氯甲烷相中，极少部份溶于正己烷相，乙腈-二氯甲烷相和正己烷相都为有机相，极性成分溶于水相中，就分离了极性物质，净化了人工合成激素。与现有技术相比，本发明的优点在于:动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法，通过乙腈提取，体积比4:1的正己烷与二氯甲烷溶剂分离非极性物质，体积比1:2的正己烷与二氯甲烷溶剂进一步将人工合成激素溶于有机相中，分离水相中极性物质，不需要固相萃取柱净化，降低了提取成本，己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A提取物的纯度高，无机、有机杂质少，可以用内标的气相色谱-质谱法检测，检出限低，每种人工合成激素检测限为0.05μ g/kg以下，定量检测误差少。因此该方法选用合适的提取试剂和净化试剂，不需采用固相萃取柱就能达到净化的目的，且己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A净化较彻底。具体实施方法
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
取未含人工合成激素的奸肉5.0Og 二份方试样，切碎，均质后，一份试样分别加入
0.0005 μ g的己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A，另一份试样分别加入0.0002 μ g的己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A，然后将试样于具塞的第一离心瓶中，加入10 20ml乙腈匀质，2000rpm离心5min，上清液转移到具塞的第二离心瓶中，第一离心瓶中再加入10 20ml乙腈,摇勻后,2000rpm离心5min,上清液合并于第二离心瓶中，弃去固体试样；第二离心瓶中，先加 入16ml正己烧和4ml 二氯甲烧,摇勻后,2000rpm离心3min,弃去上层正己烷相，这样大部分非极性物质一起被除去；第二离心瓶中，再加入IOml 二氯甲烷和5ml正己烷，摇匀后，2000rpm离心3min，将有机相转移到梨形瓶中，这样大部分非极性物质一起被除去，梨形瓶40°C下旋转蒸发至干，梨形瓶内就得到含己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A提取物。检测时:在梨形瓶中加入4ml(分2次)二氯甲烷，注意淋洗瓶壁让提取物溶解，并转移到IOml玻璃离心管(A)中，A管中加入4ml 4%NaOH,4ml正己烷，缓慢上下颠倒摇动试管，使二氯甲烷全部转移到上层，2000rpm离心3min，弃去上层有机相，然后用6mol/L磷酸溶液调节提取液pH至6.2,加4ml乙醚摇勻，2000rpm离心3min,将上层乙醚用无水硫酸钠脱水后转移到另一离心管(B)中，A管内再用4ml乙醚重复提取I次，上层乙醚用无水硫酸钠脱水后转移到B管；B管中加入100 μ I (100ng/ml)BPA-D16内标溶液，65°C下氮气吹干；再加入100 μ I硅烷化衍生剂(BSTFA:TMCS=99:1)，65°C下衍生30min ;氮气吹去衍生剂，加500 μ I正庚烷，摇匀。选择DB-17MS柱以一定的仪器条件进行GC-MS测定。测得回收率:己烯雌酚81.29Γ99.9%、双烯雌酚82.4% 116%、己烷雌酚93.5% 118%、双酚Α76.8% 111% ;精密度(RSD):3.48% 11.9%，说明检测限可以为0.05 μ g/kg左右。实施例2
取切碎、匀浆后鲤鱼肌肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A，提取方法和测试方法同实施例1，最后测得鲤鱼肌肉中含己烯雌酚0.008 μ g，双烯雌酚0.011 μ g，肉中己烯雌酚含量约为2 μ g/kg,双烯雌酚约为2.7 μ g/kg。
实施例3
取切碎、匀浆后猪肉的肌肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A，提取方法和测试方法同实施例1，最后测得肌肉中含己烷雌酚0.02yg，双酚A 0.032yg，肉中己烯雌酚含量约为5 μ g/kg,双酚A约为8 μ g/kg。实施例4
取切碎、匀浆后鸡脯肉5g，不加烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和双酚A，提取方法和测试方法同实施例1，最后测得肉中含己烯雌酚0.026 μ g，己烷雌酚0.01 μ g，双酚A 0.015 μ g。
权利要求
1.动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法，其特征在于步骤如下: a、称取5.0Og已匀浆的动物肌肉试样置于具塞的第一离心瓶中，加入10 20ml乙腈匀质，2000rpm离心5min，上清液转移到具塞的第二离心瓶中，第一离心瓶中再加入10 20ml乙腈,摇勻后，2000rpm离心5min,上清液合并于第二离心瓶中； b、第二离心瓶中，加入16ml正己烧和4ml二氯甲烧,摇勻后,2000rpm离心3min,弃去上层正己烷相； C、第二离心瓶中再加入IOml 二氯甲烧和5ml正己烧,摇勻后,2000rpm离心3min,将有机相转移到梨形瓶中，40°C下旋转蒸发至干，得到含己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A提取物。
全文摘要
本发明公开了动物肌肉中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A的方法，通过乙腈提取，体积比41的正己烷与二氯甲烷溶剂分离非极性物质，体积比12的正己烷与二氯甲烷溶剂进一步将人工合成激素溶于有机相中，分离水相中极性物质，不需要固相萃取柱净化，降低了提取成本，己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和/或双酚A提取物的纯度高，无机、有机杂质少，可以用内标的气相色谱-质谱法检测，检出限低，每种人工合成激素检测限为0.05μg/kg左右，定量检测误差少。
文档编号G01N30/06GK103197015SQ20131010652
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者钟惠英, 柴丽月, 朱励华, 柳海 申请人:宁波市海洋与渔业研究院