专利名称：饲用果胶酶dns检测法的制作方法
技术领域：
本发明设计酶活检测领域，具体地涉及饲用果胶酶DNS检测法。
背景技术：
果胶酶是指能分解果胶物质的多种酶的总称，它在破解植物细胞壁、促进内源酶分泌及消除抗营养因子方面发挥了不可替代的作用，在饲料工业中越来越受到重视。但果胶酶是包含多种组分的复合酶，按作用方式分类可分为(I)解聚酶①聚甲基半乳糖醒酸酶 Polymethlgalacturonase PMG ②聚半乳糖醒酸酶 PolygalaturonasePG ③聚甲基半乳糖醒酸裂解酶Polymethlgalacturonatelyse PMGL④聚半乳糖醒酸裂解酶Polygalaturonatelyse PGL ; (2)果胶酯酶 Pectinesterase PE。按底物不同分类可分为果胶酯酶，果胶酶，原果胶酶。但是目前国内采用的果胶酶检测方法是次亚碘酸法(QB1502-92)，它存在以下问题1、底物无法完全溶解，配制出的底物批次间差异较大，且硫代硫酸钠标准溶液和碳酸钠溶液的稳定性较差，从而导致该方法的重复性很差，有时甚至会出现同一个样品今天能检测出酶活，明天却检测不出酶活的情况，对质量控制造成极大的困难。2、操作繁琐，所需试剂较多，有效的酶液浓度范围太窄，方法规定滴定差即消耗
O.05mol/L硫代硫酸钠溶液(A-B)之差须在O. 5-1. Oml范围内，难以控制，经常要多次实验才能准确测出酶活，大大增加了操作时间与难度，且势必会增加实验成本。3、酶活定义与现行NSP酶国家标准有冲突，一般都定义为每分钟降解底物生成Iymol产物为I个酶活单位，但该法定义为每小时降解底物生成Img产物为I个酶活单位，造成了酶活被高估，造成用户困扰。因此，因此，果胶酶的检测一直是个难题，现有果胶酶检测方法需要亟待改进。

发明内容
因此，本发明的目的是解决饲用果胶酶活性检测困难，提供一种改进的果胶酶DNS检测法。根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法，所述方法包括以下步骤(I)吸取果胶粉溶液，加入DNS试剂并振荡，在37°C水浴锅中保温30min，再加入稀释的酶液，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度Ab ；(2)吸取果胶粉溶液，加入与步骤(I)稀释同样倍数的酶液混匀，在37°C水浴中精确保温30min，加入DNS试剂，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AS ；(3)酶活计算酶活X= [ (As-Ab) X K+C。] X 1000 X Df/30/m/MX :酶样中果胶酶活力，U/mL ；AS :酶反应液的吸光度；AB :酶空白样的吸光度；K :标准曲线的斜率A :标准曲线的截距；Df :稀释倍数;M :半乳糖醛酸的分子量212. 15g/mol ；m :果胶酶取样量，g或mL,
其中，对于步骤(I)和步骤(2)，果胶粉溶液的pH为3. 5 ;果胶粉溶液与酶液的体积比为3 :1 ;在果胶粉溶液与酶液的混合液中，果胶粉的浓度为2. 25mg/mL。根据本发明的方法，对于步骤(I)和步骤(2)，在沸水浴煮沸的时间为5min，然后用自来水冷却至室温，加水定容并振荡混勻，IOOOOg离心lOmin。因此，根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法，其酶活定义为Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分钟从浓度为2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解释放Iymol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个 酶活单位U。根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法的原理为果胶酶能将果胶降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法确定了以下反应体系及反应条件反应温度一般饲用果胶酶最适温度在45_60°C之间，但应用环境(畜禽体温)在37-40°C，检测酶活是为了更好的表示其应用效果，故反应温度应该与实际应用温度保持一致，故选择37 °C。反应pH值畜禽胃肠道pH值为2. 0-5. 5，反应pH应该与实际应用环境中pH保持一致，故选择pH 3. 5。底物浓度QB 1502-92中规定果胶粉为10g/L，采用这个浓度的底物，样品空白值会比较高，且由于果胶粉不易溶解，此空白值也不稳定，严重影响方法的重复性。通过酶促反应动力学计算出果胶酶反应的Km值，再结合样品空白值的高低及检测结果的稳定性，最终选取了在果胶粉溶液与酶液的混合液中果胶粉的浓度为2. 25mg/mL。酶液与底物比例(体积比3 :1):按照酶促反应动力学所得Km值为1. 21，底物浓度应该选择10倍Km以上才能保证反应中底物过量，但是实际操作中底物浓度过高会造成空白吸光值太高，影响检测灵敏度及取值范围，因此选择稍低的底物浓度，以此来保证较低的空白值及相对过量的底物。检测波长根据波长扫描结果，产物在380_650nm之间均有吸收，最大吸收峰在450nm左右,但在410_480nm干扰较大,500-600nm之间数据较稳定波动小，并且梯度间吸光值差异明显，在这个范围取值都可以，选取了 540nm。根据本发明的方法可以确保此方法的重复性及重现性符合国家标准。根据现有的DNS方法检测果胶酶活性，果胶粉难溶于水，需加热煮沸才能完全溶解，但不同批次配制的底物间仍会存在一定差异；另外，在碱性环境中果胶粉不稳定，容易降解成一些絮状物质，该方法中空白样品中果胶粉会与碱性的DNS接触，造成重复性及重现性变差。本发明的检测果胶酶活性的DNS检测法确定了反应体系包括反应温度、反应pH值、底物浓度、酶液与底物比例、反应总体系等各种参数；确保该方法操作简便，且重复性好。通过实验验证，空白样品中通过先添加底物与DNS接触，让果胶粉在碱性环境中趋于稳定，不仅可降低空白值，数据也更稳定；另外，反应完成后经过IOOOOrpm离心IOmin也提高了方法的稳定性。


图1为标准曲线。
具体实施例方式实施例11、酶活定义 Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分钟从浓度为2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解释放Iymol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个酶活单位U。2、测定原理果胶酶能将聚半乳糖醛酸降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。3、试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1氢氧化钠溶液，c (NaOH)为200g/L 称取氢氧化钠20. 0g，加水溶解，定容至100mL。3. 2D-半乳糖醛酸，c(C6HltlO7 -H2O)为1. Omg/mL 称取D-半乳糖醛酸O. 100g，加水溶解，定容至100mL。3. 30. lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3. 5)甲液称取柠檬酸(C6H8O7 · H2O) 21. 01g，用水溶解并定容至1000mL。乙液称取柠檬酸三钠(C6H5Na3O7 · 2H20) 29. 41g，用水溶解并定容至1000mL。取甲液140mL、乙液60mL，混匀，缓冲液的pH应为3. 5 (用pH计调试)。3. 4果胶粉溶液，浓度为3mg/mL称取果胶粉(Sigma P9135) 0. 300g，加入80mL 0. lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至果胶完全溶解(注在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过IOOmL),然后停止加热，继续搅拌至溶液冷却，调节pH至3. 5，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至100mL。4°C避光保存，有效期为3天。3. 5DNS 试剂称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g (化学纯)，加水500mL，搅拌5s，水浴至45°C。然后逐步加入IOOml氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48°C)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g。继续45°C水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至lOOOmL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。4、仪器与设备4.1实验室用样品粉碎机或碾钵。4. 2分样筛孔径为O. 25mm (60目)。4. 3分析天平感量O. OOlg。4. 4pH 计精确至 O. 01。 4. 5磁力搅拌器附加热功能。4. 6电磁振荡器。4. 7烧结玻璃过滤器孔径为O. 45 μ m。4. 8 高速离心机，10000g。4. 9恒温水浴锅温度控制范围在30_60°C之间，精度为0. 1°C。4. 10秒表每小时误差不超过5s。4. 11分光光度计能检测350_800nm的吸光度范围。4. 12移液器；精度为I μ I。5、标准曲线及波长扫描制备标准一水D-半乳糖醛酸溶液，一水半乳糖醛酸的浓度范围应在0. 1-2. Smg/mL之间。用缓冲液溶解1. OOOg 一水D-半乳糖醒酸,定容至IOOmL,获得浓度为10mg/mL的半乳糖醒酸溶液。然后用缓冲液作系列稀释，配制浓度为0、0. 2mg/mL、0. 4mg/mL、0. 8mg/mL、1.2mg/mL>1. 6mg/mL>2. 0mg/mL>2. 4mg/mL>2. 8mg/mL 的标准溶液。分别吸取0. 5mL上述不同浓度标准溶液和1. 5mL 3mg/mL果胶溶液，配制成具有相同浓度果胶和不同浓度的D-半乳糖醛酸标准溶液，电磁震荡3-5s混匀。再加入2. 5mLDNS试剂，电磁震荡3-5s、沸水浴煮沸5min。冷却至室温，再用蒸馏水定容至12. 5mL，震荡摇匀，IOOOOg离心lOmin，取滤液，以D-半乳糖醛酸浓度为O的反应液作为基准调零，作200-700nm的波长扫描，以540nm处吸光度做标准曲。6、反应用酶液的制备6.1固体样品反应用酶液制备颗粒及粉状样品，按四分法缩分至200g，并粉碎通过0. 45mm标准筛，混匀后装入密封容器内备用。称取0. 2g备用样品于150mL锥形瓶中，精确至0. OOOlg,加入50mL缓冲液，在回旋式振荡器上提取30min。提取后的试样在离心机上以IOOOOrpm离心IOmin取上清，再用缓冲液做适当稀释(稀释后的酶液中果胶酶活力控制在0. 09U/mL左右)。6. 2液体样品的反应用酶液制备液体样品直接用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行稀释，定容(稀释后的酶液中果胶酶活力控制在O. 09U/mL左右)。7、酶活测定吸取1. 5mL果胶粉溶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入2. 5mLDNS试剂，电磁振荡5s。在37°C水浴锅中保温30min，再加入0. 5mL经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，混勻，沸水浴煮沸5min。用自来水冷却至室温,加水定容至12. 5mL,电磁振荡5s混匀，IOOOOg离心lOmin。取上清，在540nm处测定吸光度AB。
吸取1. 5mL果胶粉溶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入O. 5mL经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，混匀，在37°C水浴中精确保温30min。加入2. 5mL DNS试剂，混勻，沸水浴煮沸5min。用自来水冷却至室温,加水定容至12. 5mL,电磁振荡5s混勻，IOOOOg离心lOmin。取上清，在540nm处测定吸光度AS。8、酶活计算酶活X= [ (As-Ab) X K+CJ XlOOOX Df/30/m/MX :酶样中果胶酶活力，U/mL ；AS :酶反应液的吸光度；AB :酶空白样的吸光度；K :标准曲线的斜率A :标准曲线的截距；Df :稀释倍数；30 :反应时间；M :半乳糖醛酸的分子量；m :样品称样量。
9、重复性每个试样应取两份平行试样进行分析测定，相对误差不超过8. O %，二者的平均值为最终的酶活力测定值。实施例2检测限检测步骤同实施例1表I
果胶_称样量稀释倍数样品OD54lj酶活相对酶活3
900°'55093763.61%
1500°'394102969.86%
1800°·353121082.15%0.2000g20000.312Π9180 86%
2500°·282133290.43%
3000°·270144798.23%
3333 0.230 1473 100.00% __4000__0205__1453__98.64%3注相对酶活指相对于最大酶活的百分率从表中可知，OD54tl在O. 200-0. 270的酶活差异在5%以内，超出这个范围误差较大，稀释后待测酶液酶活在O. 09U/mL左右，方法最低定量限为8U/g。实施例3检测步骤同实施例1表2中样品I来源于武汉新华扬生物股份有限公司自产果胶酶，样品2、样品3及样品4是随机采集于市场的饲用果胶酶。表2几种饲用果胶酶测定结果(重复性、准确度)
权利要求
1.饲用果胶酶DNS检测法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)吸取果胶粉溶液，加入DNS试剂并振荡，在37°C水浴锅中保温30min，再加入稀释的酶液，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度Ab ；(2)吸取果胶粉溶液，加入与步骤(I)稀释同样倍数的酶液混匀，在37°C水浴中精确保温30min，加入DNS试剂，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AS ；(3)酶活计算酶活 X= [ (As-Ab) X K+CJ X1000X Df/30/m/MX :酶样中果胶酶活力，U/mL ；AS :待测酶反应液的吸光度；Ab :待测酶空白样的吸光度； K :标准曲线的斜率A :标准曲线的截距；Df :待测酶样品的稀释倍数;M :半乳糖醛酸的分子量，212. 15g/mol ；m :待测果胶酶取样量，其中，对于步骤(I)和步骤(2 )，果胶粉溶液的PH为3. 5 ;果胶粉溶液与酶液的体积比为3:1;在果胶粉溶液与酶液的混合液中，果胶粉的浓度为2. 25mg/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对于步骤(1)和步骤(2)，在沸水浴煮沸的时间为5min,然后用自来水冷却至室温,加水定容并振荡混勻，IOOOOg离心lOmin。
全文摘要
本发明设计酶活检测领域，具体地涉及饲用果胶酶DNS检测法。根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法，其酶活定义为1g酶粉或1mL酶液在pH3.5、37℃下，每分钟从浓度为2.25mg/mL的底物(Sigma P9135)溶液中分解释放1μmol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个酶活单位U。本发明的检测果胶酶活性的DNS检测法确定了反应体系包括反应温度、反应pH值、底物浓度、酶液与底物比例、反应总体系等各种参数；确保该方法操作简便，且重复性好。
文档编号G01N21/31GK102998269SQ20121049860
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者王冠, 詹志春, 徐丽, 周樱, 丁皓, 付大波, 周金敏, 王晓亮, 张庆丽 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司