专利名称：茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种茶叶的检测方法，尤其是涉及一种茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧 蒽和蒽的同时快速检测方法。
背景技术：
在世界上，茶是仅次于水的普遍性饮品，在我国，茶是公认的“国饮”。茶叶中含有 咖啡碱、茶多酚、类黄酮、氨基酸和维生素等600种以上有机化合物，还含有钠、钾和氟等28 种无机元素。目前，已有大量的研究表明，饮茶对健康有益，具有抗癌、抗衰老和降低血糖 等功效。然而，在茶叶生长过程中，会富集空气中的多环芳烃(PAHs)，在制作过程中，如炒 制、烘干过程中亦会形成微量的多环芳烃，多环芳烃会对人类健康带来威胁。苯并(a)芘 (Benzo(a)Pyrene,BaP)是已发现的200多种多环芳烃中最主要的环境和食品污染物，国际 癌症研究总署(IARC)和美国国家环境保护局(US. EPA)均把苯并(a)芘列为具有最强致癌 性的多环芳烃，并将其作为代表性多环芳烃，是首要监测对象。我国国家标准对食品中苯并(a)芘的测定方法如下样品先用有机溶剂提取，或经皂化提取，再将提取液经液_液分配或色谱柱净化， 然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外灯照射下呈紫色荧光斑点，将分 离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸泡，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比 较定量(食品中苯并(a)芘的测定，中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.27-2003)。这种 检测方法过程比较复杂，对待测物的损失较严重，给定量工作带来很多不便。目前，茶叶中多环芳烃的检测方法主要有液相色谱/荧光检测法和气相色谱/质 谱法，样品中多环芳烃萃取方法包括超声萃取，索氏提取，固相微萃取，加速溶剂萃取。上述 萃取方法必须进行柱色谱净化样品，增加了实验步骤和待测物的损失，检测灵敏度会受到 影响。液相色谱法或气相色谱法有较强的分离分析能力，但均需繁锁的前处理操作，而且仪 器设备昂贵，难以实现快速筛查。荧光分析法具有高灵敏度、经济、快速等优点，目前，已经被应用于水样、烟熏肉、 油等多种样品中多环芳烃的检测。在常规荧光分析法中，苯并(a)芘的荧光峰与苯并(k) 荧蒽(BkF)和蒽(Ant)的荧光峰严重重叠，为了准确定量苯并(a)芘，必需消除苯并(k)荧 蒽和蒽的干扰。非线性可变角同步荧光法是同步荧光法的分支。非线性可变角同步荧光法沿着穿 过等高线图某条曲线进行扫描，两个单色器扫描速率在扫描过程中并不维持某一特定的比 率，通过选择特殊的扫描路径，能进一步改善光谱重叠体系的分辨率。本申请人在中国专利CN1632535A中提供一种明显减少对食品样品前处理过程， 操作简便快捷，费用低廉的食品中苯并(a)芘的荧光快速筛查方法，该方法提出导数技术 与恒能量同步荧光法结合，对一般超标食品中的苯并(a)芘快速筛选。由于茶叶基底比较 复杂，常规的前处理方法必须与柱色谱结合以除去色素等干扰。

发明内容
本发明的目的在于提供一种无需经过复杂的色谱净化分离处理过程的茶叶中苯 并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法。本发明包括以下步骤1)样品处理将茶叶研磨，加入正己烷超声萃取，分离得上清液，在上清液中加入 二甲亚砜超声萃取，分离出二甲亚砜萃取液，得待测样品溶液；2)测量使用带有导数可变角同步扫描功能的荧光分光光度计，按照扫描路径扫 描待测样品溶液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的一阶导数非线性可变角同步荧光光 谱；3)荧光强度读取苯并(a)芘读取扫描序列为84 87之间的峰值，苯并(k)荧 蒽读取扫描序列为365 372之间的峰值，蒽读取扫描序列为930 1050之间的正负峰绝 对值；4)定量方法采用连续标准加入法或基体匹配校准曲线法，定量计算茶叶待测溶 液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的浓度。在步骤1)中，所述正己烷的加入量最好是在0. 5 1. 0g茶叶中加入5. 0 10mL 的正己烷，所述加入正己烷超声萃取的时间可为10 15min，超声萃取最好重复2 3次； 所述二甲亚砜的加入量最好是5. 0 10mL ；所述加入二甲亚砜超声萃取的时间最好为8 15min。在步骤2)中，所述扫描路径最好是由四部分组成的连续变化的路径，所述四部分 组成的连续变化的路径包括扫描路径1-2、扫描路径2-3、扫描路径3-4和扫描路径4-6，其 中扫描路径1-2排除了苯并(k)荧蒽和蒽的干扰，沿此段路径扫描一阶导数非线性可变角 荧光光谱得到苯并(a)芘的荧光信号；扫描路径2-3排除了苯并(a)芘和蒽的干扰，沿此段 路径扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到苯并(k)荧蒽的荧光信号；沿扫描路径4-6 路径扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到蒽的荧光信号；而沿扫描路径3-4扫描得三 组分的混合的荧光信号(该段路径的荧光信号不作为定量依据)。在步骤3)中，所述扫描序列是在一阶导数非线性可变角同步荧光光谱数据中，以 每隔0. lnm波长为1个采样点，对采样点进行编号，即从1开始并以1为间隔填充的递增序 列。本发明提出的茶叶样品前处理方法一正己烷超声萃取-二甲亚砜反萃取法优化 了目前存在的液-液萃取法，采用反萃取技术代替柱色谱净化样品，减少待测物的损失，缩 短样品处理时间，简单易操作。本发明以苯并(a)芘为重点监测对象，提出茶叶中苯并(a) 芘、苯并(k)荧蒽和蒽的快速萃取方法，通过一阶导数非线性可变角同步荧光方法消除了 茶叶中苯并(k)荧蒽和蒽对苯并(a)芘在常规荧光检测中的干扰，实现了同时快速定量分 析三种多环芳烃。方法经济简单，操作简便、快捷。


图1为苯并(a)芘在二甲亚砜中的等高线图。图2为苯并(k)荧蒽在二甲亚砜中的等高线图。图3为蒽在二甲亚砜中的等高线图。
从图1 3可见，苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽三组分的光谱重叠严重，尤其是 苯并(a)芘受到另外两组分的干扰最严重。图4为苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽在二甲亚砜中的等高线图叠加及可变角同 步扫描路径。在图4中，粗实线为选择的可变角同步扫描路径，扫描路径1-2获得苯并(a) 芘的荧光信号；扫描路径2-3获得苯并(k)荧蒽的荧光信号；扫描路径4-6获得蒽的荧光信号。图5为沿扫描路径获得的苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽、蒽和三组分混合物的一阶导 数非线性可变角同步荧光光谱。图6为苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的工作曲线线性考察。在图6中，苯并(a) 芘浓度范围是0. 10 13.0ng/mL，固定苯并(k)荧蒽和蒽的浓度分别为5. Ong/mL、10ng/ mL0图7为苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的工作曲线线性考察。在图7中，苯并(a) 芘和蒽的浓度分别为5. Ong/mL、lOng/mL，苯并(k)荧蒽浓度范围0. 25 25. Ong/mL。图8为苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的工作曲线线性考察。在图8中，苯并(a) 芘和苯并(k)荧蒽的浓度均为5. Ong/mL，蒽的浓度范围是1. 00 103ng/mL。图9为某市售铁观音茶叶二甲亚砜萃取液的一阶导数非线性可变角同步荧光光
並图10为某市售普洱茶叶二甲亚砜萃取液的一阶导数非线性可变角同步荧光光
並
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。本发明的检测原理1)扫描路径的确定本发明提出的扫描路径是由四部分组成的连续变化的路径， 如图4示，其中扫描路径1-2排除了苯并(k)荧蒽和蒽的干扰，沿此段路径扫描一阶导数非 线性可变角荧光光谱得到苯并(a)芘的荧光信号；扫描路径2-3排除了苯并(a)芘和蒽的 干扰，沿此段路径扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到苯并(k)荧蒽的荧光信号 ’沿 扫描路径4-6路径扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到蒽的荧光信号；而沿扫描路径 3-4扫描得到三组分的混合的荧光信号(该段路径的荧光信号不作为定量依据)。本发明 提出的扫描路径是优化路径(扫描波长变化范围见表1)，在后面的检测中可直接使用，无 需重复选择扫描路径。表1非线性可变角同步荧光扫描路径 2)绘制样品的一阶导数非线性可变角同步荧光光谱样品萃取液放置于带有导 数可变角同步荧光扫描功能的荧光仪上，沿本发明提出的扫描路径扫描绘制样品的一阶导 数非线性可变角同步荧光光谱，以每隔0. lnm波长为1个采样点，对采样点进行编号，即从1 开始并以1为间隔填充的递增序列，此递增序列作为扫描序列，以扫描序列为横坐标，荧光 强度为纵坐标，绘制荧光信号强度随扫描序列的变化曲线。在一定浓度范围内，荧光强度随 浓度呈线性变化。一次光谱扫描在1分钟内可完成，可同时获取苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽 和蒽三组分独立的荧光信号，结合导数技术，有效地提高方法的灵敏度，具有良好的抗干扰 能力，快速灵敏。3)荧光强度读取苯并(a)芘读取扫描序列为84 87之间的峰值，苯并(k)荧 蒽读取扫描序列为365 372之间的峰值，蒽读取扫描序列为930 1050之间的正负峰值 绝对值加和值。4)定量方法可采用连续标准加入法或基体匹配校准曲线法定量计算茶叶待测 液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的浓度。进行同一类茶叶分析时，可采用基体匹配校准 曲线法。5)方法的检出限及线性范围固定两组分的浓度，向二甲亚砜溶液中加入不同浓 度的第三组分的标准溶液，测量其一阶导数非线性可变角同步荧光信号强度，建立荧光强 度-浓度关系曲线。图6是固定苯并(k)荧蒽和蒽的浓度分别为5.0ng/mL、10ng/mL，苯并 (a)芘浓度范围是0. 10 13. Ong/mL ；图7是固定苯并(a)芘和蒽的浓度分别为5. Ong/mL、 lOng/mL，苯并(k)荧蒽浓度范围0. 25 25. Ong/mL ；图8是固定苯并(a)芘和苯并(k)荧 蒽的浓度均为5. Ong/mL,蒽浓度范围是1. 00 103ng/mL。计算得到如下参数，苯并(a)芘、 苯并(k)荧蒽和蒽的线性方程分别是1 = 127c-15. 7，I = 38. 6c+9. 08，I = 15. 7c+18. 3 ； 线性范围分别是0. 10 13. Ong/mL, 0. 25 25. Ong/mL, 1. 00 103ng/mL，检出限(3 o ) 分别为0. 02，0. 08，0. 14ng/mL。实施例1 某市售铁观音茶叶中3种多环芳烃的检测1)茶叶经研磨均勻后称取约1. 0g样品于25mL血清瓶中，加入5mL正己烷，超声萃 取lOmin，功率59KHz，100%;重复3次，合并萃取液(共15mL)并加入10mL 二甲亚砜，超声 萃取15min，条件同上。取0. 5mL 二甲亚砜萃取液稀释至2mL于荧光分光光度计上测量一阶 导数非线性可变角同步荧光光谱，如图9示。以连续标准加入法对样品中三组分定量分析， 即向样品溶液中连续加入2微升苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的标准溶液(苯并(a)芘、 苯并(k)荧蒽和蒽标准溶液浓度分别为1. 0mg/L, 1. 0mg/L和4. 0mg/L)，每次加入标准溶液后扫描一阶导数非线性可变角同步荧光光谱。苯并(a)芘荧光强度读取扫描序列为84 87之间的峰值，苯并(k)荧蒽荧光强度读取扫描序列为365 372之间的峰值，蒽荧光强度 读取扫描序列为930 1050之间的正负峰值绝对值加和值，分别绘制荧光强度与相应的标 准溶液加入量的变化曲线，计算样品待测液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的浓度，每个
样品平行三组。2)加标回收实验同一样品按上述方法处理，平行三组，计算加标回收率。结果如 表2所示，三组分的加标回收率在77. 8% 124. 5%之间。表2茶叶样品加标回收率实验结果 实施例2 3种市售铁观音茶叶中3种多环芳烃的检测购买3种市售的铁观音茶叶，其品质有较大的差别，分别命名为1号、2号及3号样 品。样品经研磨均勻后称取约0. 5g于25mL血清瓶中，加入5mL正己烷，超声萃取lOmin，功 率59KHz，100% ；重复3次，合并萃取液(共15mL)并加入5mL 二甲亚砜，超声萃取15min， 条件同上。取0. 3mL 二甲亚砜萃取液稀释至2mL于荧光分光光度计上测量一阶导数可变角 同步荧光光谱，定量分析方法与实施例1相同，采用连续标准加入法。每个样品平行三组实 验，以连续标准加入法对三种多环芳烃进行定量，结果如表3所示。表3 3种市售铁观音茶叶中3种多环芳烃的检测结果 实施例3 某市售乌龙茶商务茶包中3种多环芳烃的检测茶叶经研磨均勻后称取0. 6g于25mL血清瓶中，加入7mL正己烷，超声萃取15min， 功率59KHz，100%;重复两次，合并萃取液(共14mL)并加入6mL二甲亚砜，超声萃取lOmin， 功率59KHz，100%。取1. OmL 二甲亚砜萃取液稀释至2mL于荧光分光光度计上测量其荧光 值。采用连续标准加入法定量，结果为茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽含量分别为27.3ng/g,80. lng/g,390. 3ng/g。实施例4 考察茶叶基体的影响，对于同一类茶叶采用基体匹配校准曲线法进行 定量计算。以某市售铁观音茶叶中苯并(a)芘的检测为例，样品处理与实施例1相同，以 其中的一个茶叶样品作为基体配制一系列浓度的标准工作溶液，以此茶叶待测液为空白溶 液，绘制荧光强度随浓度变化曲线，拟合得工作曲线I = 27. 6c-0. 04，R2 = 0. 9968，以此工 作曲线对同一类的其余的茶叶待测样品中苯并(a)芘进行定量分析。与连续标准加入法定 量结果比较，两者无显著性差异，结果如表4所示。表4基体匹配校准曲线法曲线法及连续标准加入法对某市售铁观音茶叶中苯并(a)芘的定量结果 注而是基体匹配校准曲线法定量结果，C2是连续标准加入法定量结果实施例5 某市售普洱茶中3种多环芳烃的检测购买某市售普洱茶，样品经研磨均勻后称取0. 503g样品于25mL血清瓶中，加入 10mL正己烷，超声萃取13min，功率59kHz，100%;重复2次，合并萃取液(共20mL)并加入 7. OmL 二甲亚砜，超声萃取8min，功率59KHz，100%。取1. OmL 二甲亚砜萃取液稀释至2mL 于荧光分光光度计上扫描一阶导数非线性可变角同步荧光光谱，如图10示。采用连续标准 加入法对苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽进行定量分析，测量结果为茶叶中苯并(a)芘、苯 并(k)荧蒽和蒽含量分别为5. 26ng/g,26. 0ng/g，44. 8ng/g。以上5组实施例进一步表明本发明操作简便，实验周期短，能对茶叶中苯并(a) 芘、苯并(k)荧蒽和蒽三种多环芳烃进行快速筛查。
权利要求
茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法，其特征在于包括以下步骤1)样品处理将茶叶研磨，加入正己烷超声萃取，分离得上清液，往上清液中加入二甲亚砜超声萃取，分离出二甲亚砜萃取液，得待测样品溶液；2)测量使用带有导数可变角同步扫描功能的荧光分光光度计，按照扫描路径扫描待测样品溶液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的一阶导数非线性可变角同步荧光光谱；3)荧光强度读取分别读取苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的光谱峰值；4)定量方法采用连续标准加入法或基体匹配校准曲线法，定量计算茶叶待测溶液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的浓度。
2.如权利要求1所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法，其 特征在于在步骤1)中，所述正己烷的加入量是在0.5 l.Og茶叶中加入5.0 10mL的正 己焼。
3.如权利要求1或2所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方 法，其特征在于在步骤1)中，所述加入正己烷超声萃取的时间为10 15min，超声萃取重复 2 3次。
4.如权利要求1所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法，其 特征在于在步骤1)中，所述二甲亚砜的加入量是5. 0 10mL。
5.如权利要求1或4所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方 法，其特征在于在步骤1)中，所述加入二甲亚砜超声萃取的时间为8 15min。
6.如权利要求1所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法，其 特征在于在步骤2)中，所述扫描路径是由四部分组成的连续变化的路径，所述四部分组成 的连续变化的路径包括扫描路径1-2、扫描路径2-3、扫描路径3-4和扫描路径4-6，其中扫 描路径1-2排除了苯并(k)荧蒽和蒽的干扰，沿此段路径扫描一阶导数非线性可变角荧光 光谱得到苯并(a)芘的荧光信号；扫描路径2-3排除了苯并(a)芘和蒽的干扰，沿此段路径 扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到苯并(k)荧蒽的荧光信号；沿扫描路径4-6路径 扫描一阶导数非线性可变角荧光光谱得到蒽的荧光信号；而沿扫描路径3-4扫描得三组分 的混合的荧光信号。
7.如权利要求1或6所述的茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方 法，其特征在于在步骤3)中，荧光强度读取方法为以每隔0. lnm波长为1个采样点，对采 样点进行编号，即从1开始并以1为间隔填充的递增序列，此递增序列作为扫描序列，苯并 (a)芘读取扫描序列为84 87之间的峰值，苯并(k)荧蒽读取扫描序列为365 372之间 的峰值，蒽读取扫描序列为930 1050之间的正负峰绝对值。
全文摘要
茶叶中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的同时快速检测方法，涉及一种茶叶的检测方法。将茶叶研磨，加入正己烷超声萃取，分离得上清液，加入二甲亚砜超声萃取，分离出二甲亚砜萃取液得待测样品溶液；使用带有导数可变角同步扫描功能的荧光分光光度计，按照扫描路径扫描待测样品溶液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的一阶导数非线性可变角同步荧光光谱；苯并(a)芘读取扫描序列为84～87之间的峰值，苯并(k)荧蒽读取扫描序列为365～372之间的峰值，蒽读取扫描序列为930～1050之间的正负峰绝对值；采用连续标准加入法或基体匹配校准曲线法，定量计算茶叶待测溶液中苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽和蒽的浓度。
文档编号G01N21/64GK101876638SQ20101010854
公开日2010年11月3日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者李呐, 李秀英, 李耀群, 林丽容, 黄维 申请人:厦门大学