专利名称：三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法
技术领域：
本发明涉及三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法，属于血浆钙测定领域。
背景技术：
钙主要存在于人体的骨骼和牙齿中，细胞外液中含量很少，但对维持正常的神经肌肉应激性、腺体分泌以及一些酶系统的活性特别在血凝过程中起重要作用。血钙浓度通过骨骼、肾脏和肠道之间进行调节，同时，甲状旁腺素(升高血钙)、降钙素(降低血钙)和1，25-二羟维生素D3参与调节。当骨骼和细胞外液钙的动态平衡被破坏时，就呈现出病态。准确测定血中钙含量，可为人体体症的表征提供科学依据。迄今国内外测定血钙的方法大致有滴定法、比色法、原子吸收光谱法、离子选择电极法、质谱分析法、荧光分析法等。邻甲酚酞络合比色法是临床应用较多的一种方法，但是所用试剂稳定性差(＜8小时)，不能排除镁的干扰且对二氧化碳敏感。原子吸收光谱法最准确、敏感，但由于仪器价格及其维护费用非常昂贵，难以在临床实验室推广普及。
三联吡啶钌电化学发光是近年来发展比较迅速的一种分析方法，广泛用于草酸、氨基酸和脂肪胺等的测定、免疫分析及核酸分析，其中三联吡啶钌电化学发光免疫分析及核酸分析已在临床中应用。1977年Chang、Saji和Bard在J.Am.Chem.Soc.第99卷第5399页首次报道了三联吡啶钌和草酸在有机溶液中发生电化学反应可以产生电化学发光；1981年Rubinstein和Bard在J.Am.Chem.Soc.第103卷第512页报道了三联吡啶钌和草酸在水溶液中发生电化学反应可以产生电化学发光，1983年Rubinstein和Bard在Anal.Chem.第55卷第1580页报道了三联吡啶钌电化学发光可以用于直接测定合成尿样中的草酸，1990年Uchikura等和Egashira等分别在Bunseki Kagaku第39卷第323页和Anal.Sci.第6卷第903页报道了三联吡啶钌电化学发光可以用于直接测定尿样中的草酸，1992年Egashira、Kumasako、Kurauchi和Ohga在Anal.Sci.第8卷第713页报道了三联吡啶钌电化学发光可以用于直接测定蔬菜中的草酸。这些研究成果表明三联吡啶钌电化学发光测定草酸具有良好的选择性和灵敏度。
上面提到的滴定法测定血钙是通过在血中加入草酸使血钙与草酸生成沉淀，多次洗涤除去沉淀中剩余草酸和其它杂质，再加硫酸和草酸钙作用生成硫酸钙沉淀并释出草酸，用已知浓度高锰酸钾滴定释出草酸量，由此计算出钙含量。可见操作比较复杂费时，需要相对多的血样。

发明内容
由于三联吡啶钌电化学发光测定草酸具有良好的选择性，并且人体中的血浆钙的浓度一般比较高，正常值在2.25～2.65毫摩尔/升，易于用草酸盐沉淀，因此三联吡啶钌电化学发光可以通过对生成草酸钙沉淀后剩余草酸量直接进行分析而用于血浆钙的测定。
本发明的目的是提供一种三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法。
本发明中电化学发光试剂三联吡啶钌与草酸在中性和弱酸性溶液中发生电化学发光反应时发光效率高，而血液中氨基酸、抗坏血酸等可以与三联吡啶钌发生电化学发光反应的干扰物在中性和弱酸性溶液中发生电化学发光反应时发光效率远远低于三联吡啶钌与草酸反应的效率；同时血液中固有的草酸的浓度很低；加上血液中的大分子通过离心被除去，因此本方法具有很好的选择性，可以满足测定血浆钙以表征人体生理参数的需要。电化学发光反应发生在电极表面附近，原则上仅需要不到1微升的发光溶液，因此可以对很少的血样进行测定。由于直接对生成草酸钙沉淀后剩余草酸量进行电化学发光分析，省去了多次的洗涤和滴定过程，使得分析速度得到明显提高。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为先在50～100微升血浆中加入过量草酸溶液(浓度大于5毫摩尔/升)，使草酸和血钙充分反应生成草酸钙，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液与pH在5至7.5之间的三联吡啶钌溶液混合，然后进行电化学发光分析，即对生成草酸钙沉淀后剩余草酸量进行电化学发光分析测定，可以得到血浆钙的含量。
所述的三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法，用缓冲溶液时可以使用醋酸缓冲液。
所述的三联吡啶钌电化学发光测定血钙的方法，电化学发光测定时既可以在静态体系中进行，也可以在流动体系中进行。
本发明的方法具有选择性好、分析速度快、需要样品少和分析仪器相对便宜等优点。本发明的方法与最准确、敏感的原子吸收光谱法测定的血浆钙的含量相当吻合，差异较小。本发明的方法可靠性和一致性均较高。
具体实施例方式
实施例1取100微升血浆与100微升浓度为5毫摩尔/升的草酸溶液混合均匀使草酸和血钙充分反应，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液，加入用pH值5的醋酸缓冲溶液配制的三联吡啶钌溶液并混合均匀，然后将混合液加入流动注射体系中进行电化学发光测定。测得钙含量为2.478(±0.053)毫摩尔/升。
实施例2进行对比试验，取50微升血浆用pH值5.5的醋酸缓冲液稀释至100微升，与100微升浓度为5毫摩尔/升草酸溶液混合均匀使草酸和血钙充分反应，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液，加入用pH值5.5的醋酸缓冲溶液配制的三联吡啶钌溶液并混合均匀，然后将混合液放入容积为0.5毫升的发光池中进行静态电化学发光测定。测得钙含量为2.496(±0.054)毫摩尔/升。同样的血浆样品用原子吸收光谱法测得钙含量为2.531(±0.029)毫摩尔/升。两种方法测定的血浆钙的含量相当吻合，差异较小。
实施例3进行回收试验，在100微升已知钙量为2.48毫摩尔/升的血浆中，分别加入1.1、1.5和1.9毫摩尔/升的钙，使血浆钙的理论值分别成为3.58、3.98和4.39毫摩尔/升，再分别与浓度为5毫摩尔/升草酸溶液混合均匀使草酸和钙充分反应，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液，加入用pH值7.5的醋酸缓冲溶液配制的三联吡啶钌溶液并混合均匀，然后将混合液分别放入容积为0.5毫升的发光池中进行静态电化学发光测定。测得回收率为97.4～102％。
实施例4进行重复性试验，取100微升血浆与100微升浓度为5毫摩尔/升草酸溶液混合均匀使草酸和血钙充分反应，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液，加入用pH值5.5的醋酸缓冲溶液配制的三联吡啶钌溶液并混合均匀，然后将混合液加入流动注射体系中进行电化学发光测定。一天内重复测定六次的平均值为2.478毫摩尔/升，变异系数为2.14％，在五天内重复上述测定的平均值为2.459毫摩尔/升，变异系数为3.33％。事实证明，本发明的方法可靠性和一致性均较高。
权利要求
1.一种三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法，其特征在于，在血浆中加入过量的草酸(浓度大于5毫摩尔/升)，使草酸和血钙充分反应生成草酸钙，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液与pH在5至7.5之间的三联吡啶钌溶液混合，然后进行电化学发光分析，即对生成草酸钙沉淀后剩余草酸量进行电化学发光分析测定，以得到血浆钙的含量。
2.如权利要求1所述的三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法，其特征在于，用缓冲溶液时可以使用醋酸缓冲液。
3.如权利要求1所述的三联吡啶钌电化学发光测定血钙的方法，其特征在于，电化学发光测定时既可以在静态体系中进行，也可以在流动体系中进行。
全文摘要
本发明涉及三联吡啶钌电化学发光测定血浆钙的方法，属于血浆钙测定技术领域。本发明所采用的技术方案为先在50～100微升血浆中加入过量草酸溶液(浓度大于5毫摩尔/升)，使草酸和血钙充分反应，然后通过离心机进行离心使草酸钙和血中的大分子沉至底部，取含有草酸的上层清液与pH在5至7.5之间的三联吡啶钌溶液混合，然后进行电化学发光测定以得到血浆钙的含量。该方法具有选择性好、分析速度快、需要样品少和分析仪器相对便宜等优点。
文档编号G01N31/02GK1773259SQ20051001723
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者徐国宝, 史立红, 刘晓庆, 牛文新 申请人:中国科学院长春应用化学研究所