专利名称：NPM1基因的exon12突变检测用探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种NPMl基因的eXOnl2突变的检测方法以及用于该检测方法的核酸探针和试剂盒。目前已经发现大量与急性髓系白血病(AML)病因相关的DNA突变。目前已经报告了 NPMl基因突变在成人急性髓系白血病患者体内被发现，而且与通过将NPMl基因突变与FLT3-ITD基因突变的结果结合起来考虑来进行预后预测相关(Blood. 2007 ；109 874-885)。作为NPMl基因的突变类型，例如，记载在New Eng J Med 352 =254-266,2005,Blood. 2005 ；106 :1419-1422, Blood. 2005 ；106 :3740-3746, Blood. 2005 ；106 :3733-3739,Blood. 2006 ；108 :1999-2005, Blood. 2005 ；106 :2854-2861 中，根据报告病例数的多少以及发生突变的碱基序列的部位，可以举出具有代表性的突变TypeA、TypeB, TypeD, Type7、TypeQ、TypelO、TypeE、Type60
作为检测碱基多态性的检测方法已知以下方法。Blood. 2005，106 :2854-2861记载了如下方法，在PCR扩增后，进行电泳分离，再从切出的凝胶中精制扩增产物，然后进行直接测序的方法。Haematologica 2007 ；92 1268-1269中记载了通过DHPLC法和序列测定法进行检测的方法。但是，上述这些方法存在以下问题(I)由于提取扩增产物，所以有发生污染的可能性；(2)不能够进行自动化操作，而且需要对各个项目逐项进行操作，因此需要花费人力和费用；(3)进行结果分析时，需要专业知识和专业技能；(4)由于进行序列分析的检测特异性仅为20%左右，对于含有正常细胞比例较高的癌细胞，检测变得困难。另一方面，已知如下方法对含有突变的区域进行PCR扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，根据熔解曲线分析的结果分析突变的方法(特开2001-286300号公报(专利文献I)、特开2002-119291号公报(专利文献2))。关于探针的设计，这些文献给出了以下的启示在末端部使用荧光染料标记了的淬灭探针与靶标核酸探针进行杂交时，在末端部分，探针-核酸杂交体的多个碱基对中至少一对形成G和C碱基对。但是，这些方法在实施方面存在无法对全部的任意序列进行实施的问题。

发明内容
本发明的课题在于，确定一种有效检测NPMl基因的eXonl2突变的探针，并提供NPMl基因的eXonl2突变的检测方法以及用于该检测的试剂盒。本发明人发现通过基于含有NPMl基因的exonl2突变的特定区域设计探针，并使用该探针进行熔解曲线分析，能够检测相应的突变，从而完成了本发明。SP，本发明如下所述。(I)多态性检测用探针，其为用于检测NPMl基因的exonl2突变的探针，其特征在于，所述探针为由选自下述的P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、Pl、Pl ’、P2和P2’中的至少一种荧
光标记寡核苷酸构成，(P5)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P5’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P6)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P6’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第145位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；
(P7)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P7’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(Pl)寡核苷酸具有与序列编号I所不的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸具有与序列编号I所不的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182位的碱基的19 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号182的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；以及(P2’)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182的碱基的19 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号182的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。(2)如⑴记载的多态性检测用探针，其中，P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号145的碱基对应的碱基，Pl以及P1’寡核苷酸在3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号135的碱基对应的碱基，P2以及P2’寡核苷酸在5’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号182的碱基对应的碱基。(3)如(I)记载的多态性检测用探针，其中，？5、？5’、？6、？6’、？7和？7’寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、与编号145的碱基对应的碱基，Pl和P1’寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与编号135的碱基对应的碱基，P2和P2’寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的、与编号182的碱基对应的碱基。(4)如⑴记载的多态性检测用探针，其中，Pl和P1’寡核苷酸以与编号153 156的碱基中的任意碱基对应的碱基为5’末端，并且荧光染料标记的与编号135的碱基对应的喊基位于3’末端；P2和P2’寡核苷酸以与编号153 156的碱基中的任意碱基对应碱基为3’末端，以荧光染料标记的与编号182的碱基对应的碱基为5’末端。(5)如⑴记载的多态性检测用探针，其中， 515’16、？6’、？7和？7’寡核苷酸以编号16 2的碱基为5’末端，在3’末端具有用荧光染料标记的与编号145的碱基对应的碱基，Pl和P1’寡核苷酸以编号155的碱基为5’末端，在3’末端具有荧光染料标记的与编号135的碱基对应的碱基，P2和P2’寡核苷酸以编号156的碱基为3’末端，在5’末端具有荧光染料标记的与编号182的碱基对应的碱基。(6)如⑴ (5)中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，所述的寡核苷酸未与目标序列杂交时发出荧光，并且与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。(7)如(6)记载的多态性检测用探针，其中，所述的寡核苷酸未与目标序列杂交时发出荧光，而与目标序列杂交时荧光强度减少。(8)如⑴ (7)中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，所述探针为用于熔解曲线分析的探针。(9)如(I) (8)中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，P5、P5，、P6、P6，、P7和P7’寡核苷酸的碱基长为12 35 ；P1和P1’寡核苷酸的碱基长为16 35 ；P2和P2’寡核苷酸的碱基长为19 35。(IO)NPMl基因的exonl2的多态性的检测方法，其特征在于使用⑴ (9)中任意一项记载的探针中的至少一种。(Il)NPMl基因的exonl2多态性的检测方法，其特征在于包含下述⑴ (IV)步骤(I)向含有核酸的试样中，添加⑴ (9)中任意一项记载的探针，使探针与上述核酸进行杂交的步骤；(II)改变温度，使由上述核酸与上述探针组成的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体解离的信号变动的步骤；(III)分析上述信号的变动，检测出上述试样中单链核酸的Tm值的步骤；以及(IV)根据上述Tm值，检测上述试样中单链核酸中，目标多态性的有无或含有多态性的单链核酸的丰度比的步骤。(12)如(11)记载的方法，还包括在进行步骤⑴之前或进行步骤⑴的同时，扩增 DNA。(13)对急性髓系白血病的易患性，病理状态和/或预后进行分析的方法，包括通过(10) (12)中任意一项记载的方法，检测NPMl基因的eXonl2的多态性的步骤；以及确定多态性的有无的步骤。(14)用于检测NPMl基因的多态性的试剂盒，其包含(I) (9)中任意一项记载的探针。
(15)如(14)记载的试剂盒，还包括用于扩增NPMl基因的序列编号I所示的碱基序列中含有与P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、PU PI’、P2、P2，寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。(16)如(14)或(15)记载的试剂盒，其中，上述引物为选自下述P3和P4以及P3’和P4’的多态性检测用引物，(P3)为以第106位碱基T为3’末端，且与序列编号I同源的10 50个碱基的寡核苷酸，和(P4)为以第205位碱基T为3’末端，且与序列编号I的互补链具有同源性的10 50个碱基的寡核苷酸，以及(P3’)为以第106位碱基T为3’末端，且具有与序列编号I的互补链在严谨条件下杂交的碱基序列的10 50个碱基的寡核苷酸，和 (P4’)为以第205位碱基T为3’末端，且具有与序列编号I的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列的10 50个碱基的寡核苷酸。仅通过添加本发明的探针来进行熔解曲线分析(Tm分析)，就能够检测出NPMl基因的eXonl2的突变。本发明的探针特异性高，检测灵敏度高。通过使用本发明的方法，即使在进行PCR的情况下，也无需提取扩增产物，因此几乎没有污染的危险性。此外，本发明的方法，由于操作简单，因此容易自动化操作。使用本发明的探针，能够识别目前报告了的突变中的具有代表性的8种突变类型中的7种突变。而且，对于具有代表性的2个突变型(Type A、E)，即使野生型中包含10%的突变，也能够检测出来。


图I为(A)为示出核酸混合物的熔解曲线的示例以及图I(B)为示出微分熔解曲线的示例的图。图2为示出标准曲线的示例的图。图3为本发明的探针的设计概略图。该图示出实施例中使用的本发明的探针的位置。并示出比较例中使用的探针的位置。图4 :在实施例I的WT(互补链寡核苷酸)的Tm分析中，以每单位时间的TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)为纵轴，温度为横轴，示出二者的关系。以下各图中纵轴和横轴的关系与本图相同。图5 :在关于实施例I的mt typeA (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。图6 :在关于实施例I的mt typeB (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。图7 :在关于实施例I的mt typeD (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。图8 :在关于实施例I的mt type7 (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。图9:在关于实施例I的WT(互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。
图10 :在关于实施例I的mt typeQ (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。图11 :在关于实施例I的mt typel0(互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。图12 :在关于实施例I的mt typeE (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。图13 :在关于实施例I的mt type6 (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。图14:在关于比较例I的WT(互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图15 :在关于比较例I的mt typeA (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图16 :在关于比较例I的mt typeB (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图17 :在关于比较例I的mt typeD (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图18 :在关于比较例I的mt type7 (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图19 :在关于比较例I的mt typeQ (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图20 :在关于比较例I的mt typelO (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图21 :在关于比较例I的mt typeE (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图22 :在关于比较例I的mt type6 (互补链寡核苷酸)的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图23 :在关于实施例2的血液样品的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPYFL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图24 :在关于实施例2WT100% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图25 :在关于实施例2的mt typeA100% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图26 :在关于实施例2的mt typeA30% ,Wt70% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图27 :在关于实施例2的mt typeA20% ,Wt80% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图28 :在关于实施例2的mt typeA10% ,Wt90% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图29 :在关于实施例2的mt typeE100% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图30 :在关于实施例2的mt typeE30% ,Wt70% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图31 :在关于实施例2的mt typeE20% ,Wt80% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图32 :在关于实施例2的mt typeE10% ,Wt90% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左图)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右图)。图33 :在关于比较例2的血液样品的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图34 :在关于比较例2的WT100 % (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用 了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图35 :在关于比较例2的mt typeA100% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图36 :在关于比较例2的mt typeA20% ,Wt80% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图37 :在关于比较例2的mt typeE100% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图38 :在关于比较例2的mt typeE 20%,Wt 80% (质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。图39 :在关于实施例4的mt type A(质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 Pacific Blue (mtA_R4)。图40 :在关于实施例4的mt type A(质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 TAMRA(mtB-R5)。图41 :在关于实施例4的mt type A(质粒)的PCR反应后的Tm分析中，探针使用了 BODIPY FL (mtD-R6)。
具体实施例方式<1>本发明的探针以及本发明的检测方法本发明所用探针为用于检测NPMl基因的eXonl2的突变的探针，其特征在于该探针为选自由下述的(P5)、(P5’ )、(P6)、(P6，) (P7)、(P7’ )、(PI)、(P2)、(P1，)、(P2，)中的至少一种荧光标记的寡核苷酸组成的多态性检测用探针。(P5)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P5’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P6)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P6’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号第145位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P7)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P7’)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (Pl)寡核苷酸具有与序列编号I所不的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸具有与序列编号I所不的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182位的碱基的19 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号182的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；以及(P2’)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182的碱基的19 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号182的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。本发明的探针具有序列编号2所示的碱基序列(具有NPMl基因的eXonl2的突变typeA的碱基的序列)中由上述(P5)、(P5，)、(P6)、(P6，)、(P7)、(P7，)确定的序列，对于(P6)、(P6’)而言，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，对于(P7)、(P7’)而言，与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，除此之外与专利文献1、2中记载的淬灭探针同样地制作。另外，本发明的探针含有序列编号I所示的碱基序列(含有NPMl基因的eXonl2为野生型的碱基的序列)中上述的(Pl)、(PI’)、(P2)和(P2’)所确定的序列之外，可以与特开2001-286300号公报、特开2002-119291号公报记载的淬灭探针同样地制作。而且，本发明的序列编号I所示的序列为GeneBank登录号NG 016018的第27689 28278号。另夕卜，序列编号2所示的序列与序列编号I所示的序列仅在添加了编号第153 157位的碱基这4个碱基这一点不同。作为本发明的探针长度，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’例如为12 50碱基长、12 35碱基长、或12 30碱基长。PU P1’为16 50碱基长，16 35碱基长或16 30碱基长。P2、P2’为19 50碱基长，19 35碱基长或19 30碱基长。本发明的探针中，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’例如为以与序列编号2所示的碱基序列中的编号160 163的碱基中任何碱基对应的碱基为5’末端的探针，例如，以碱基编号162的碱基为5’末端，以碱基编号145的碱基为3’末端。本发明所用的探针，例如为与序列编号I所示碱基序列中的编号153 156的碱基(下述表I中的gcag)中任意碱基的对应的碱基为末端的探针。PU P1’以编号153 156的碱基(下述表I中的gcag)中任意碱基为5’末端，P2、P2’以第153 156碱基中任意碱基为3’末端。本发明的探针中，例如在如图I所示的碱基序列中，P1、P1’以编号155的碱基为5’末端，P2、P2’以第156位碱基为3’末端。本发明中的“同源性”意指在特定的碱基序列中，例如与碱基序列的互补链具有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性的序列的碱基序列。在本申请中，也可以具有100%的同一性。本申请中的杂交可以根据公知的方法或者以其为标准的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等进行。该文献经此引用并入本申请说明书。
本申请所谓“严谨条件”意指形成特异的杂交体，而不形成非特异的杂交体的条件。典型的“严谨条件”例如可以为，钾离子浓度为约25mM 约50mM以及镁离子的浓度为约I. OmM 约5. OmM中进行杂交的条件。本发明的条件的一个示例可以为Tris-HCl (pH8. 6)、25mM KCl以及I. 5mM MgCl2中进行杂交的条件。但是，本发明不限于此。此外，严谨条件记载在 Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)中。此文献经此引用并入本申请的说明书。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，容易对于这些条件做出选择。另外，本发明的所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、PI、PI’、P2、P2’荧光标记寡核苷酸中包含在所述？545’、？6、？6’、？7、？7’、？1、？1’、？2、？2’荧光标记寡核苷酸中分别插入、缺
失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。该插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、P1、P1’、P2、P2’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或取代的碱基的数量可以为I个碱基或2个碱基以上，插入、缺失或取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸总体的长度而不同，例如可以为I个碱基 10个碱基或I个碱基 5个碱基。在插入、缺失或取代中，作为本发明的所述P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、PU PI’、P2、P2，荧光标记寡核苷酸，可以举出分别取代了所述P5、P5，、P6、P6，、P7、P7’、PU P1，、P2、P2’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。取代的位置无特别限定。例如从检测灵敏度的观点来说，可以为序列编号2所示的序列中的第152位 第166位的碱基以外位置、或者序列编号I所示的序列中的第152位 第162位的碱基以外的位置的碱基被取代。作为被取代的碱基的数量，可以举出I个碱基或2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸总体的长度而不同，例如可以为I个碱基 5个碱基、或I个碱基 3个喊基。作为所述荧光标记寡核苷酸中的寡核苷酸，除了寡核苷酸之外，还包括经修饰的寡核苷酸。所述寡核苷酸的构成单位例如可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、人工核酸等。所述人工核酸例如可以为DNA、RNA、作为RNA类似物的LNA(锁核酸)；作为肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid);作为交联核酸的BNA(桥联核酸)等。所述寡核苷酸可以由所述构成单位中的一种构成，也可以由多种构成。本发明中使用的用于检测NPMl基因exonl2突变的的探针的碱基序列的不例，可以为P5 :5’ -cactgcCAGAcagagatc-3’(序列编号56), P6 5’ -cactgcCATGcagagatc-3’(序列编号 57), P7 :5’ _cactgcCAGGcagagatc_3’(序列编号58) ,Pl :5’ -tgccagagatcttgaatagcc-3 (序列编号 4) ,P2 :5’ -ctattttcttaaagagacttcctccac-3’(序列编号5)。荧光染料可以使用特开2001-286300号公报、特开2002-119291号公报记载的荧光染料。具体示例可以为Pacific Blue (商标)、FAM(商标)、TAMRA(商标)、B0DIPY FL(商标)等。将荧光染料结合至寡核苷酸的方法，可以按照常用的方法，例如特开2001-286000号公报、特开2002-119291号公报中记载的方法进行。本发明可以通过使用(P5)、(P5，)，(P6)，(P6，)、(P7)、(P7，)、(Pl)、(PI，)、(P2) 或(P2’)中的任意一种寡核苷酸，例如通过使用(P5)、(P6)、(P7)或(P5’)、(P6’)、(P7’)这三种寡核苷酸，例如通过使用(PD和(P2)或(P1’ )和(P2’ )这2种寡核苷酸，通过使用本实施例3、4所示的序列编号56-58所示的探针,或者通过如实施例1、2所示的序列编号4、5所示的探针，对NPMl基因exon 12突变进行检测(图3)。本发明的探针优选为，未与目标序列杂交时荧光染料发出荧光，与目标序列杂交时，荧光染料的荧光减少或增加。本发明的探针也可以为未杂交时荧光染料发出荧光，与目标序列杂交时，荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。此外，本发明的探针优选为从5’或3’末端起数第I 3位的碱基用荧光染料标记。更优选为，3’末端用荧光染料标记。此外，本说明书中称为“从5’末端起数第I 3位”的情况，为以5’末端为第I位开始计数，“从3’末端起数第I 3位”的情况，为以3’末端为第I位开始计数。此外，本发明探针中被荧光染料标记的碱基，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’中为序列编号2的第145位的碱基，P1、P1’中为序列编号I所示的第135位碱基，在P2、P2’中为如序列编号I的第182位碱基。使用本发明的寡核苷酸能够检测的NPMl基因exonl2的突变，例如记载在表I中。倉泛够检测由 typeA、typeB、typeD、typeC、typeE、typeGm、typeKm、typeNm、typeOm、typeQm、type3>type4>type6>type7>typel3>typelO、typeG+、typeH+、typel+、typej+、和 typel 组成的组中的选择的至少一种以上的突变。表I■ZPM1 琳lasexonl2s 凇>#。齡贼
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在表I中的碱基序列中，例如突变型A的④的部分插入了“tctg”。另外，突变TypeE的⑨的部分插入了 “ctcttgccc”,⑩的“ggagg”缺失。实施例中研究了检测的突变所在的行中记载了 ☆号。在使用(P5)、(P5’)、(P6)、(P6’)、(P7)、(P7’)寡核苷酸的情况下，能够检测出typeA、typeB、typeD、typeC、typeGm、typeKm、typeNm、typeOm、typeQm、type3、type4、type13、typeG+、typeH+、typel+、typej+ 和 typel 等。使用序列编号I所示的碱基序列中位于第153-156位碱基的区域的5’端的序列的探针、使用例如(PD、(Pr )寡核苷酸时，能够检测出typeA、typeB、typeD以及type7等。使用序列编号I所示的碱基序列中位于第153-156位碱基的区域的3’端的序列的探针，例如使用(P2)、(P2，)寡核苷酸时，能够检测出typelO、typeE以及type6等。此外，通过使用本发明的(P5)、(P5，)、(P6)、(P6，)、(P7)、(P7，)中任何一种寡 核苷酸、或者(Pl)或(Pr )和(P2)或(P2’ )寡核苷酸，能够检测NPMl基因ex0nl2有无突变，使得能够诊断急性髓系白血病的易患性、病理状态和/或预后。通过使用本发明实施例所示的序列编号56、57、58、4、5的探针，能够检测NPMl基因exonl2的突变。序列编号56 58、4所示的探针中，3’末端用荧光染料标记；序列编号5所示的探针,5’末端用突光染料标记。本发明的检测方法的特征在于使用上文所述的本发明的探针。即本发明的检测方法可以使用一个以上的、含有序列编号2所不的碱基序列中的编号157 160的碱基的区域(对应于序列编号I的编号153 156的碱基)的探针，也可以使用一个以上的上述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’的探针。另外，本发明的检测方法，可以使用序列编号I所示的碱基序列中、以第153-156位碱基的区域为末端的一个以上的探针；也可以使用上述P1、P1’、P2以及P2’中一个以上的探针。本发明的检测方法例如特征在于，使用本发明的探针，并包括以下步骤。(I)向含有核酸的试样中，添加本发明的探针，使探针与上述核酸进行杂交的步骤；(II)改变温度，使由上述核酸与上述探针组成的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体解离的信号的变动的步骤；(III)分析上述信号的变动，检测上述试样中的单链核酸的Tm值的步骤；以及(IV)根据上述Tm值，检测上述试样中的单链核酸中，目标多态性的有无或含有多态性的单链核酸的丰度比的步骤。本发明的检测方法，除使用本发明的探针外，也可以按照常规的核酸扩增以及熔解曲线分析(Tm分析)的方法进行。而且，本发明的检测方法也可以包括在进行上述步骤(I)之前或进行步骤(I)的同时，进行核酸扩增的步骤。核酸的扩增方法优选为使用聚合酶的方法，例如PCR、ICAN、LAMP等。在使用聚合酶的方法进行扩增时，优选在本发明的探针存在下进行扩增。根据所用探针来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说是容易的。这样在核酸扩增后，仅对探针的Tm值进行分析，因此反应结束后无须处理扩增产物。这样就不必担心扩增产物带来的污染。而且，由于可以在与扩增所需的仪器相同的仪器内进行检测，因此无须搬运容器。因此，容易实现自动化。
此外，在步骤(III)确定Tm值时，不仅包括确定Tm的温度，而且包括确定Tm的峰高，能够根据峰高确定具有多态性的碱基序列的丰度比。此外，在更加定量地确定具有多态性的碱基序列的丰度比时，优选制成如下所示的标准曲线，根据其确定丰度比。关于定量地确定具有多态性的碱基序列的丰度比的方法，下面以确定野生型和特定的突变型的丰度比为例进行说明。但是，该方法仅为示例而已，确定具有多态性的碱基序列的丰度比的方法不限于此。首先，将野生型核酸Wt和突变型核酸Mt这两种核酸以各自不同的丰度比配制多个核酸混合物，对与多个核酸混合物的每一个，使用熔解曲线分析装置等得到熔解曲线。图I(A)为以某一个核酸混合物的温度与荧光强度的关系表示的熔解曲线；以及图I(B)为以温度与荧光强度的微分值的关系表示的熔解曲线(也称微分熔解曲线)。通过从微分熔解曲线中检测峰来检测核酸Wt的熔解温度Tmw以及核酸Mt的熔解温度TmM，并分别设定含有Tmw和TmM的温度范围。对于包含Tmw的温度范围A Tw，例如可以设定为如下 的温度范围即以Tmw和TmM之间的荧光强度微分值为最小的温度为下限，以与荧光强度的峰的底部对应的温度为上限的温度范围。此外，对于包含TmM的温度范围ATM，可以设定为如下的温度范围即，以Tmw和TmM之间的荧光强度微分值为最小的温度为上限，以与荧光强度的峰的底部对应的温度为下限的温度范围。而且，对于温度范围ATw以及温度范围ATm可以设定为相同的幅度(例如10°C )或不同的幅度(例如，温度范围ATwS 10°C，温度范围ATm为7°C)。此外，可以将温度范围A Tw和温度范围A Tm分别设定为各自的熔解温度Tm减X°C 加X°C的幅度内(X可以为15°C以内，优选为10°C以内)。然后，分别对温度范围A Tw和温度范围A TM，计算通过与微分熔解曲线的温度范围的下限对应的点和与上限对应的点的直线与微分熔解曲线所包围的面积(图I(B)的斜线部分)。作为面积计算方法的一个示例，具体按照下述方法进行计算。以温度T处的荧光强度微分值为f (T)，温度T处的基础值为B(T)，按照下述式(I)进行计算。面积S = {f (Ts+1)-B (Ts+1)} + {f(Ts+2))-B (Ts+2)}+... +R(IV1)-B OV1M …(I)其中，Ts为各温度范围的下限值，Te为上限值。各温度T对应的基础值B(T)是按照下述式(2)计算的值，其表示荧光强度检测信号中包含的背景水平。从荧光强度微分值减去该基础值，就去除了荧光强度检测信号中包含的背景的影响。B(T) = aX (T_TS)+f (Ts)... (2)其中，a= {f (Te) -f (Ts)} / (Te-Ts)根据上述式(I)、式(2)可以求出各核酸混合物中，温度范围ATw中的面积SwW及ATm中的面积SM，做出表明面积比与各核酸混合物的丰度比关系的标准曲线。图2为标准曲线的一个示例，其中横轴为丰度比(核酸Mt相对于核酸混合物的总量的比例)，纵轴为面积比(sM/sw)。此外，面积比也可以设定为SW/SM。根据使用实际试样获得的熔解曲线和微分熔解曲线计算出面积比，可以基于上述的方法预先绘制的标准曲线，来确定实测试样中含有的具有多态性的碱基序列的丰度比。本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。上述DNA为双链DNA时，例如优选为，包括在进行杂交步骤之前，通过加热，使上述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离为单链DNA，在接下来的杂交步骤中，能与检测用探针发生杂交。本发明中，本发明的探针相对于上述试样DNA的添加比例(摩尔比)，无特别限制，但是为充分确保检测信号，优选为相对于上述试样DNA为I倍以下，更优选为0. I倍以下。此时，试样中的DNA，例如可以为，产生了检测目标多态性的检测对象DNA和未产生上述多态性的非检测对象DNA的合计，也可以为含有产生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未产生上述多态性的非检测对象序列的扩增产物的组合。此外，试样DNA中上述检测对象DNA的比例，一般是未知的。但是，结果表明，上述探针添加比例(摩尔比)，相对于检测对象DNA(含有检测对象序列的扩增产物)，可以为10倍以下，5倍以下，或3倍以下。此外，对于其下限无特别限制，例如可以为0.001倍以上，0.01倍以上，或0. I倍以上。本发明的探针相对于上述DNA的添加比例，可以为相对于双链DNA的摩尔比，也可以为相对于单链DNA的摩尔比。对Tm值进行说明。对含有双链DNA的溶液进行加热时，260nm处的吸光度会升高。这是由于，加热使双链DNA两链之间的氢键发生断裂，解离为单链DNA(DNA的熔解)的缘故。根据这一现象，熔解温度Tm值一般定义为吸光度达到最大值吸光度50%时的温度。 在本发明中，所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、PI、PI’、P2、P2’荧光标记寡核苷酸与具有互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值和与非互补的DNA杂交时的Tm值之差，例如可以为5°C以上。通过所述Tm值之差为5°C以上，能够以更高的灵敏度检测上述突变。另外，所述Tm值之差可以为5°C以上、或7°C以上等。增大所述Tm值之差的方法有使探针序列中含有与其杂交的碱基序列错配的碱基的方法、以及例如NatureBiotech(1997) vol 15p. 331-335中记载的方法等。本发明中，用于确定Tm值的、对伴随温度变化信号的信号变动的测定，可以基于如前面所述的原理测定260nm的吸光度来进行，但是优选测定如下信号所述信号为以向本发明的探针上添加的标记的信号为基础、并根据DNA与探针的杂交体形成的状态而变动的信号。因此，本发明所用的探针优选使用上述的标记化探针。上述标记化探针例如可以为与目标序列未发生杂交时发出荧光，并且与目标序列发生杂交时，荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸；或与目标序列未发生杂交时发出荧光，并且与目标序列发生杂交时，荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。若是前者所述探针，则与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时，不显示信号或信号弱，而通过加热探针游离时即显示信号，或信号增加。若是后者所述探针，则与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时，显示信号，而通过加热探针游离时即出现检测信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测出基于这种标记的信号变化，能够与前述进行260nm的吸光度测定一样，确定熔解的发生和确定Tm值。标记化探针的标记物质，可以为如前所述，但优选为荧光染料标记探针。作为核酸扩增时作为模板的核酸，含有核酸即可，无特别限制，其可以为，血液、口腔粘膜混悬液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋的组织、胃液、胃洗液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意生物来源或或可由生物来源的材料。作为模板的核酸，可以从该来源获得后直接使用，或为对该试样特性进行改变而在预处理后使用。下面对于以进行PCR的情况为例进一步进行说明。PCR所用的引物对除了扩增本发明探针能够杂交的区域以外，还可以与常规的PCR引物对的设计方法同样地对引物对进行设定。引物的长度以及Tm值一般为12mer 40mer、40 70°C,或16mer 30mer、55 60°C。引物对中各引物的长度可以不相同，但是，优选为，两个引物的Tm值基本相同(一般的相差在2°C内)。而且,Tm值可以为通过最邻近碱基对法(Nearest Neighbor)计算得出的值。作为引物对的一个示例，可以为由含有序列编号16、17所示的碱基序列的引物组成。PCR优选为在本发明所用的探针的存在下进行。这样，扩增反应结束后，无须精制扩增产物，进行Tm分析。根据所用的探针，本领域技术人员容易对引物的Tm值、PCR的反应条件做出调整。根据Tm值分析的结果对NPMl基因exonl2突变的检测可以根据常规的方法进行，本发明中的检测包括突变有无的检测和含有多态性的核酸的丰度比的确定。而且，通过本发明的探针以及多态性检测方法，能够检测出NPMl基因的eXonl2突变，并能够根据检测出的突变的有无，诊断急性髓系白血病的患病容易性、病理状态和/或预后。 〈2>本发明试剂盒本发明试剂盒为用于本发明的检测方法的试剂盒。该试剂盒的特征在于含有本发明的多态性检测用探针。而且，本发明的试剂盒也可以用于诊断急性髓系白血病的患病容易性、病理状态和/或预后。至于探针，关于本发明的探针，如上所述。本发明的检测试剂盒，除包含探针外，还可以包含本发明检测方法中进行核酸扩增所必需的试剂，特别是，用于使用DNA聚合酶进行扩增的上述引物。本发明检测试剂盒中的探针、引物以及其他试剂，可以分别进行收纳，也可以这些物质的一部分制成混合物。在本发明中，作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或引物的各个序列，以它们相互互补的关系为基础的记载事项，只要不特别指出，可以适用于每一序列以及与各个序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，由该互补的序列识别的序列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书整体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。下面，依据实施例对本发明进行具体说明。但是，这些实施例为本发明的示例，本发明不限于此。实施例实施例I (检测对象为互补链寡核苷酸、使用P1、P2探针的情况)以NPMl基因exonl2的喊基序列(序列编号1(野生型))为基础，如表2所不，设计出末端部含有C的探针。表2中，探针的位置表不序列编号I所不喊基序列中的喊基编号。3’末端的P意指发生磷酸化。通过TAMRA进行标记，按照常规方法进行。此外，作为检测对象使用的互补链寡核苷酸的序列如表2所示。表2中，寡核苷酸的位置表示序列编号I所示的碱基序列中的碱基编号。表权利要求
1.多态性检测用探针，其为用于检测NPMl基因的ex0nl2突变的探针，其特征在于，所述探针为由选自下述的P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、P1、ΡΓ、P2和P2，中的至少一种荧光标记寡核苷酸构成， (P5)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50喊基长的喊基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与编号145的喊基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P5’)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，并且与编号145的碱基对应 的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P6)寡核苷酸具有与序列编号2所不的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P6’)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号第145位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P7)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P7’)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145 156的碱基的12 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记 (PD寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (ΡΓ)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号135 150的碱基的16 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第135位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P2)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182位的碱基的19 50喊基长的喊基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号182的喊基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；以及 (P2’)寡核苷酸具有与序列编号I所示的碱基序列中的、含有编号164 182的碱基的19 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号182的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。
2.如权利要求I记载的多态性检测用探针，其中， P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号145的喊基对应的喊基， Pl以及Pr寡核苷酸在3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号.135的碱基对应的碱基， P2以及P2’寡核苷酸在5’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、与编号.182的喊基对应的喊基。
3.如权利要求I记载的多态性检测用探针，其中，P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、与编号145的碱基对应的碱基， Pl和ΡΓ寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与编号135的碱基对应的碱基， P2和P2’寡核苷酸在5’末端具有用荧光染料标记的、与编号182的碱基对应的碱基。
4.如权利要求I记载的多态性检测用探针，其中，Pl和ΡΓ寡核苷酸以与编号153 156的碱基中的任意碱基对应的碱基为5’末端，并且荧光染料标记的与编号135的碱基对应的喊基位于3’末端； P2和P2’寡核苷酸以与编号153 156的碱基中的任意碱基对应碱基为3’末端，以荧光染料标记的与编号182的碱基对应的碱基为5’末端。
5.如权利要求I记载的多态性检测用探针，其中， P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸以编号162的碱基为5’末端，在3’末端具有用荧光染料标记的与编号145的碱基对应的碱基， Pl和ΡΓ寡核苷酸以编号155的碱基为5’末端，在3’末端具有荧光染料标记的与编号135的碱基对应的碱基， P2和P2’寡核苷酸以编号156的碱基为3’末端，在5’末端具有荧光染料标记的与编号182的喊基对应的喊基。
6.如权利要求I 5中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，所述的寡核苷酸未与目标序列杂交时发出荧光，并且与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。
7.如权利要求6记载的多态性检测用探针，其中，所述的寡核苷酸未与目标序列杂交时发出荧光，而与目标序列杂交时荧光强度减少。
8.如权利要求I 7中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，所述探针为用于熔解曲线分析的探针。
9.如权利要求1 8中任意一项记载的多态性检测用探针，其中，？5、？5’、？6、？6’、卩7和P7’寡核苷酸的碱基长为12 35 ；P1和ΡΓ寡核苷酸的碱基长为16 35 ；P2和P2’寡核苷酸的碱基长为19 35。
10.NPMl基因的exonl2的多态性的检测方法，其特征在于使用权利要求I 9中任意一项记载的探针中的至少一种。
11.NPMl基因的exonl2多态性的检测方法，其特征在于包含下述(I) (IV)步骤 (I)向含有核酸的试样中，添加权利要求I 9中任意一项记载的探针，使探针与上述核酸进行杂交的步骤； (II)改变温度，使由上述核酸与上述探针组成的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体解离的信号变动的步骤； (III)分析上述信号的变动，检测出上述试样中单链核酸的Tm值的步骤；以及 (IV)根据上述Tm值，检测上述试样中单链核酸中，目标多态性的有无或含有多态性的单链核酸的丰度比的步骤。
12.如权利要求11记载的方法，还包括在进行步骤(I)之前或进行步骤(I)的同时，扩增 DNA。
13.对急性髓系白血病的易患性，病理状态和/或预后进行分析的方法，包括通过权利要求10 12中任意一项记载的方法，检测NPMl基因的exonl2的多态性的步骤；以及确定多态性的有无的步骤。
14.用于检测NPMl基因的多态性的试剂盒，其包含权利要求I 9中任意一项记载的探针。
15.如权利要求14记载的试剂盒，还包括用于扩增NPMl基因的序列编号I所示的碱基序列中含有与P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、P1、ΡΓ、P2、P2，寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。
16.如权利要求14或15记载的试剂盒，其中，上述引物为选自下述P3和P4以及P3’和P4’的多态性检测用引物， (P3)为以第106位碱基T为3’末端，且与序列编号I同源的10 50个碱基的寡核苷酸，和 (P4)为以第205位碱基T为3’末端，且与序列编号I的互补链具有同源性的10 50个碱基的寡核苷酸，以及 (P3’)为以第106位碱基T为3’末端，且具有与序列编号I的互补链在严谨条件下杂交的碱基序列的10 50个碱基的寡核苷酸，和 (P4’)为以第205位碱基T为3’末端，且具有与序列编号I的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列的10 50个碱基的寡核苷酸。
全文摘要
NPM1基因的exon12突变检测用探针，其特征在于该探针为由选自下述的P5和P5’中的至少一种荧光标记的寡核苷酸构成的多态性检测用探针。(P5)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；以及(P5’)寡核苷酸具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。
文档编号G01N21/64GK102758007SQ20121013686
公开日2012年10月31日 申请日期2012年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者细见敏也 申请人:爱科来株式会社