专利名称：示踪磁性纳米颗粒的新方法
技术领域：
本发明涉及一种示踪磁性纳米颗粒的新方法，具体的说，本发明建立了一种新的体内原位、无标记示踪磁性纳米颗粒的方法，可以用于不同磁性纳米颗粒的示踪，对于研究磁性纳米颗粒体内的分布及代谢情况，评价磁性纳米颗粒的生物安全性具有重要的意义。
背景技术：
磁性纳米材料指具有磁响应性的纳米材料，在外加磁场的作用下这些纳米材料具有强的磁响应信号。常用的磁性纳米材料为三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等。磁性材料可通过不同的方法制备出不同尺度(I-IOOOnm)和不同形貌的纳米结构，还可利用有机高分子包埋技术在磁性纳米颗粒的基础上制备微米级的磁性微球。磁性纳米材料具有较好的磁响应性，在生物医学和电子等方面应用前景广泛，如 (1)通过DNA或蛋白质分子偶联到磁性纳米材料表面，结合纳米材料的磁性可以制备亲和层析用于生物样品的快速分离和高效纯化(参见，J. M. Nam, C. S. Thaxton, C. A. Mirkin， Science 301,1884 (2003) ；Q. A. Pankhurstl, J. Connolly, S. K. Jones, J. Dobson, J. Phys. D :Appl. Phys. 36, R167(2003)；禾口 I. Safarik, Μ. Safarikova, Biomagn Res Technol.2, 7(2004)) ； (2)通过磁性纳米材料表面进行合适的化学修饰，使材料表面的电荷发生改变，或者特定的化学基团，可以将药物分子或基因结合在材料表面，利用外加磁场的导向， 可以将药物或外源基因向特定的部位进行输送，从而实现药物或基因的靶向运输(参见， J. Panyam, V. Labhasetwar, Adv Drug DelRev 55,329(2003)；禾口 5. N. Morishita, et al., Biochem Biophys Res Commun. 334，1121 Q005)) ； (3)磁性纳米颗粒可以用于活体或细胞水平的磁共振成像，建立高空间分辨率的活体实时成像技术，已经进入临床用于活体成像诊断(参见，M. G. Harishingani, et al.，N. Engl. J. Med. 348, 2491 (2003) ；Α. S. Arbab, et al. , Radiology 229,838(2003)；禾口 I. J. de Vries, et al. , NatBiotechnol. 23, 1407(2005)) ； (4)磁性纳米材料可以用于肿瘤的治疗，通过药物靶向和磁靶向把磁性纳米颗粒集中在肿瘤部位，在外加磁场的作用下，磁性纳米颗粒可以产生高热，杀死肿瘤部位的细胞，实现肿瘤治疗的目的(参见，A. Ito, et al.，Cancer Lett. 212,167(2004)；和 F.Sonvico，et al. ,Bioconjug Chem. 16,1181(2005))。由于磁性纳米颗粒在生物医学领域的广泛应用，因此，考察磁性纳米颗粒在体内的分布及代谢情况，建立纳米材料安全性评价方案具有重要的意义。此外，很多神经退行性疾病，比如帕金森病(PD)和老年痴呆症等，病人脑内都观察到了铁沉积(D. Berg，et al. Ultrasound Med Biol，25，901 (1999))。因此示踪铁在脑组织的沉积情况对于研究神经退行性疾病的发病机理，以及评价其治疗药物的治疗效果都有着重要的作用。

发明内容
本发明提供一种磁性纳米颗粒的新用途，利用其具有过氧化物酶的活性，催化过氧化氢和沉淀型氢供体反应，导致氢供体生成沉淀，通过观察沉淀可以示踪其在体内的分布及代谢情況。因此，利用该原理，本发明提供了利用具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒在哺乳动物体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，该方法包括1)将所述具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒注入所述哺乳动物体内；2)在注射所述磁性纳米颗粒后经过适当时间，取所述哺乳动物的脏器组织，进行组织切片；和3)利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性催化过氧化氢和沉淀型氢供体反应，导致氢供体生成沉淀，通过观察沉淀确定组织中磁性纳米颗粒的分布、和含量。在本发明的优选实施方案中，所述磁性纳米颗粒包括!^e3O4磁性纳米颗粒或 Y-Fe2O3磁性纳米颗粒。在本发明的另ー个优选实施方案中，所述的磁性纳米颗粒为葡聚糖修饰磁性纳米颗粒或ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒。此外，本领域技术人员应该理解，本发明所用的磁性纳米颗粒不限于上述，一般地，具有过氧化酶活性的磁性纳米颗粒都适合用于本发明，例如，聚乙ニ醇包覆的磁性纳米颗粒、聚丙烯酸包覆的磁性纳米颗粒等。在本发明的优选实施方案中，所述哺乳动物包括，但不限干，小鼠、大鼠、兔、狗等。 在经过纳米材料生物安全性验证后，所述磁性纳米颗粒可以进一歩应用于人。因此，在本发明的更优选的实施方案中，所述哺乳动物为人。在本发明的一些实施方案中，上述步骤1)中将磁性纳米颗粒注入哺乳动物体内的方法包括，但不限干，静脉内注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、吸入等。在本发明的优选实施方案中，本领域技术人员经过有限次简单的实验能够确定步骤2)中注射所述磁性纳米颗粒后至取动物脏器组织时经过的时间，在特别优选的实施方案中，所述时间为0. 25小时-72小吋，优选为5小吋，其取决于所用的磁性纳米颗粒的种类、受试的哺乳动物本身的因素、磁性纳米颗粒在哺乳动物脏器中的代谢速率等因素；其中步骤2、中所述动物组织脏器组织为肝、脾、肺、肾、淋巴结、或胸腺等。在本发明的一些实施方案中，上述步骤幻中所述的沉淀型氢供体包括3，3' -二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)、四甲基联苯胺(TMB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。在本发明的优选实施方案中，上述步骤幻中所述的沉淀型氢供体是3，3' - ニ氨基联苯胺四盐酸盐(應)。在本发明的优选实施方案中，所述利用具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒体内示踪磁性纳米颗粒的新方法还包括在动物组织切片后，将组织切片在0. 3% H2O2的甲醇中孵育30分钟，以抑制内源过氧化物酶的活性，去除了组织本身的背景，提高灵敏性。根据本发明的研究結果，证明所述磁性纳米颗粒主要被动物组织中的单核巨噬细胞吞噬(參见图3)。在本发明的优选实施方案中，所述组织切片可以通过常规的石蜡切片技术、冰冻切片技术获得。在本发明的ー个具体实施方案中，本发明提供利用具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒在体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，其包括1)将所述具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒注入哺乳动物体内；2)在注射所述磁性纳米颗粒后经过适当时间，取所述动物脏器组织，进行组织切片；和
3)加入3，3' - ニ氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色液，磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性催化过氧化氢和3，3' - ニ氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)反应，导致DAB形成棕黄色沉淀，通过观察棕黄色沉淀确定组织中磁性纳米颗粒的分布、和含量。综上所述，本发明提供下述1. ー种利用具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒在哺乳动物体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，其包括1)将所述具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒注入所述哺乳动物体内；2)在注射所述磁性纳米颗粒后经过适当时间，取所述哺乳动物的脏器组织，进行组织切片；和3)利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性催化过氧化氢和沉淀型氢供体反应，导致氢供体生成沉淀，通过观察沉淀确定组织中磁性纳米颗粒的分布、和含量。2.根据第1项所述的方法，其中所述的磁性纳米颗粒包括!^e3O4磁性纳米颗粒和 Y -Fe2O3磁性纳米颗粒。3.根据第1项所述的方法，其还包括在动物组织切片后，将组织切片在0. 3% H2O2 的甲醇中孵育30分钟。4.根据第2项所述的方法，其特征在于所述的磁性纳米颗粒为葡聚糖修饰磁性纳米颗粒或ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒。5.根据第1项所述的方法，其中步骤2)中所述的时间为0. 25小时-72小吋。6.根据第5项所述的方法，其中步骤2)中所述的时间为5小吋。7.根据第5项所述的方法，其中步骤幻中所述的沉淀型氢供体包括3，3' -ニ氨基联苯胺四盐酸盐、四甲基联苯胺或3-氨基-9-乙基咔唑。8.根据第1项所述的方法，其中所述动物脏器组织为肝、脾、肺、肾、淋巴结、或胸腺。9.根据第1项所述的方法，其中所述组织切片可以通过石蜡切片技术、冰冻切片技术获得。10.根据第1项所述的方法，其中所述磁性纳米颗粒主要被动物组织中的单核巨噬细胞吞噬。传统的示踪磁性纳米颗粒体内分布的方法存在一定的局限性(1)放射性标记方法，是利用59Fe作为原料，合成磁性纳米颗粒，该方法虽然保持了材料的原有的特性且灵敏度高，但存在放射性污染、检测复杂、费时等缺点；( 荧光标记方法，是通过静电吸附或共价偶联将荧光分子与磁性纳米颗粒结合，但荧光分子在体内不稳定，容易淬灭，不能很好的指示材料的代谢情况；另外，通过静电吸附与磁性纳米颗粒结合的荧光分子在体内容易从材料上脱落，在没有到达组织前可能已经从材料上释放出来，检测到的可能是游离的荧光分子，不能很好的示踪材料在各组织、脏器的分布，而通过共价偶联的方法修饰磁性纳米颗粒，可能会造成材料本身特性的改变，比如造成磁性纳米颗粒的交联；(3)普鲁士蓝(PB)染色法，是在酸性条件下，三价铁与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，该方法虽然不需对材料进行预标记，但存在检测灵敏度低的缺点。(4)电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OEQ，该方法是通过測定各脏器铁元素含量，分析磁性纳米颗粒在体内的分布，但是由于体内含有内源性铁离子，ICP无法区別内源铁离子和注射的磁性纳米颗粒，会对分析造成干扰。与传统示踪方法相比，利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性示踪其在体内的分布及代谢情況，具有更多的优势(1)组织切片后，只需加入DAB显色底物，即可观察到磁性纳米颗粒在体内的分布，操作简单、方便；(2)无需对材料进行预标记，很好的保持了材料原有的特性；C3)由于磁性纳米颗粒具有比辣根过氧化物酶更高的催化活性，可以很好的催化DAB形成棕黄色沉淀，检测灵敏度高；(4)将组织提前用过氧化氢处理，可以抑制内源过氧化物酶的活性，去除了组织本身的背景。


从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图1.石蜡切片分析葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在小鼠肝、脾、肺、肾、淋巴结和胸腺的分布“ + ”表示加入DAB显色，“-”表示未加DAB显色；图2.冰冻切片分析葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在小鼠肝、脾、肺、肾、淋巴结和胸腺的分布；图3.葡聚糖修饰磁性纳米颗粒被各脏器巨噬细胞吞噬；图4.葡聚糖修饰磁性纳米颗粒及ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在肝脏中的代谢；图5.葡聚糖修饰磁性纳米颗粒及ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在脾脏中的代谢；图6.葡聚糖修饰磁性纳米颗粒及ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在肺脏中的代谢；图7.葡聚糖修饰磁性纳米颗粒催化DAB染色与普鲁士蓝(PB)染色灵敏度比较；图8. ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒催化DAB染色与普鲁士蓝染色灵敏度比较。
具体实施例方式以下通过实施例来进ー步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。磁性纳米颗粒的制备1.葡聚糖修饰!^e3O4磁性纳米颗粒配制0. lmol/L FeCl3 ·6Η20 (购自北京化学试剂公司)的乙ニ醇溶液，加入无水醋酸钠，使其终浓度为0. 05mol/L,再加入分子量为10000的葡聚糖(购自Sigma)，使其终浓度为0. 05mg/ml。将上述混合物置于密闭的50ml反应釜(型号HZ50，购自郑州合众仪器有限公司)中，100°C下反应25小吋，得到葡聚糖修饰的磁性纳米颗粒(即葡聚糖修饰的!^e3O4 磁性纳米颗粒)。2. ニ氧化硅包覆!^e3O4磁性纳米颗粒2. Ii^e3O4磁性纳米颗粒的制备将FeCl2 · 4H20(购自北京化学试剂公司)和FeCl3 · 6H20(购自北京化学试剂公司)溶液按2 1的摩尔比加入三ロ瓶中，N2保护下升温至55°C，搅拌加入ニ价铁摩尔数 10倍的NaOH溶液(S卩，NaOH溶液的浓度是ニ价铁摩尔浓度的10倍)并升温至65°C反应半小吋，继续升温至90°C，反应半小吋，停止反应，搅拌下冷却至室温，产物为!^e3O4磁性纳米材料，真空冷冻干燥。取3g Fe3O4粉末，加入到通N2除氧的200ml 0. 5mol/L的柠檬酸三钠(购自北京化学试剂公司)溶液中，在超声下使!^e3O4充分分散，然后在60°C、通队搅拌12小时，然后在体系冷却至室温后利用磁铁将产物分离出来，依次用95%乙醇、去离子水洗涤并干燥，得到Fe3O4粉末。2. 2 ニ氧化硅包覆的!^e3O4磁性纳米颗粒取0. 2g在2. 1中获得的!7e304粉末用80ml乙醇和16ml蒸馏水稀释，超声20分钟， 加入aiil 25%氨水(购自北京化学试剂公司)，滴加Iml正硅酸乙酯(TEOS)(购自Sigma)， 40°C超声5小吋，用磁铁分离，用95%乙醇、去离子水清洗数次。将按上述方法制备的磁性纳米颗粒用于下述实施例。上述葡聚糖修饰磁性纳米颗粒和ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒也可以通过商购途径获得，例如，葡聚糖修饰磁性纳米颗粒可以从中国科学院理化技术研究所购得，ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒可以从上海交通大学购得。实施例1、利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶的活性，示踪其在组织中的分布将葡聚糖修饰磁性纳米颗粒(购自中国科学院理化技术研究所，或按前文所述的方法制备)按40mg/kg体重的剂量经尾静脉注射BALB/c小鼠(购自北京实验动物中心，重 20士2克，4-6周齢)，注射葡聚糖修饰磁性纳米颗粒后5小时后处死小鼠，分別取肝、脾、肺、 肾、淋巴结和胸腺。利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性，催化DAB在磁性纳米颗粒存在的地方形成棕黄色沉淀，检测磁性纳米颗粒在各组织、脏器的分布。具体方法如下所取的小鼠脏器组织用4%多聚甲醛(购自北京化学试剂公司) 固定12- 小吋，用70%乙醇溶液冲洗，再由70-80-90-95-95-100%乙醇逐级脱水35分钟，浸入1 1乙醇/ ニ甲苯(购自北京化学试剂公司)溶液5分钟，取出再浸入ニ甲苯20 分钟透明2次；迅速投入已热熔的石蜡(溶点56-58°C )(购自Leica)中4小吋，取出浸蜡组织移入含熔蜡的纸盒中，切面朝下，待石蜡表面凝结后包埋，浸入冷水中凝固。用Leica 石蜡切片机(型号冊2125，购自Leica)将石蜡包埋组织切成4 μ m切片，在载玻片上42°C 展片，自然干燥后50°C烤片6小吋。入100% ニ甲苯(购自北京化试剂公司)脱蜡三次，每次5分钟，再入100-95-80-70-50%乙醇和蒸馏水中水化。然后在含有0. 3% H2O2 (购自北京化学试剂公司)的甲醇中孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰，PBS洗涤三次，最后用新鮮配置的DAB显色液(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色操作按试剂盒说明书进行)显色，显色完毕之后用苏木素(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)复染細胞核。如图1所示，通过磁性纳米颗粒催化DAB显色，可以清楚的观察到磁性纳米颗粒主要分布在肝、脾和肺中，而在肾、淋巴结和胸腺中没有分布。这ー结果说明，利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶的活性，可以指示其在组织中的分布情況。由于磁性纳米颗粒具有比辣根过氧化物(HRP)更高的稳定性，具有更广阔的应用范围。除了石蜡切片，冰冻切片也是分析组织结构变化及损伤的重要手段之一。为了证实超低温对磁性纳米颗粒的酶活性没有影响，我们将BALB/c小鼠组织经OCT (optimum cutting temperature compound)包埋，_80°C冷冻，切片。切片在预冷的丙酮(购自北京化学试剂公司)里固定5分钟，然后再含有0. 3% H2O2的甲醇中孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰，PBS洗涤三次，用新鮮配置的DAB显色液显色(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色操作按试剂盒说明书进行)，显色完毕之后用苏木素复染細胞核。结果如图2所示，磁性纳米颗粒经超低温处理依然保持着良好的催化活性，可以很好的示踪其在各组织的分布。实施例2、磁性纳米颗粒主要被各脏器巨噬细胞吞噬磁性纳米颗粒通过尾静脉进入体内，主要是被单核吞噬细胞系统吞噬，为了证实葡聚糖修饰磁性纳米颗粒确实被各脏器巨噬细胞吞噬，我们用抗巨噬细胞特异性抗体 anti-F4/80 (购自Abcam公司，F4/80能够特异识别巨噬细胞)进行免疫组化。具体方法如下BALB/c小鼠组织经OCT包埋，进行冰冻切片。切片在预冷的丙酮里固定5分钟，然后再含有0. 3% H2O2的甲醇中孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰。PBS洗涤三次，用 5%羊血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)封闭封片，然后加入anti-F4/80抗体， 4°C孵育过夜。之后加入HRP标记的山羊抗大鼠ニ抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)， 孵育组织切片，最后用新鮮配置的DAB显色液显色(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色操作按试剂盒说明书进行)。显色完毕之后用苏木素复染細胞核。如图 3所示，葡聚糖修饰磁性纳米颗粒主要分布在抗体特异识别的巨噬细胞内(DAB将其染色成棕黄色的細胞)，说明磁性纳米颗粒主要被单核巨噬细胞吞噬。实施例3、磁性纳米颗粒在体内代谢我们利用葡聚糖修饰磁性纳米颗粒和ニ氧化硅包覆的磁性纳米颗粒(购自上海交通大学)的过氧化物酶活性，分析了他们在体内代谢的情況。将葡聚糖修饰磁性纳米颗粒和ニ氧化硅包覆的磁性纳米颗粒分别以40mg/kg体重的剂量经尾静脉注射小鼠，分別在注射后0. 25小吋，5小时和72小时后处死小鼠，取肝、脾和肺脏，分析磁性纳米颗粒在各脏器的代谢情況。小鼠尾静脉注射葡聚糖修饰磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析肝脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后材料在肝脏内有大量散在分布，而尾静脉注射72小时后葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在肝脏的分布减少(图4上)，说明葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在72小时后被肝脏所清理。小鼠尾静脉注射ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析肝脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后材料在肝脏内有大量散在分布，而与葡聚糖修饰磁性纳米颗粒不同，尾静脉注射72小时后，ニ氧化硅包覆磁性材料在肝脏中依然有大量分布(图4下)，说明ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在72小时后不能被肝脏所清理。小鼠尾静脉注射葡聚糖修饰磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析脾脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后材料在脾脏内聚集分布在白髓和红髓的交界处即边缘区(marginal zone)，而尾静脉注射72小时后葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在脾脏中的分布减少(图5上)，说明葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在72小时后被脾脏所清理。小鼠尾静脉注射ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析脾脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后材料在脾脏内聚集分布在白髓和红髓的交界处即边缘区(marginal zone)，而与葡聚糖修饰磁性纳米颗粒不同，尾静脉注射 72小时后，ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在脾脏中依然有大量分布(图5下)，说明ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在72小时后不能被脾脏所清理。小鼠尾静脉注射葡聚糖修饰磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析肺脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后材料在肺脏内成点状分布，而尾静脉注射72小时后葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在肺脏中的分布减少(图6上)，说明葡聚糖修饰磁性纳米颗粒在72小时后被肺脏所清理。小鼠尾静脉注射ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒后0. 25小吋，5小时和72小时后，处死小鼠，分析肺脏中磁性纳米颗粒的分布，发现5小时后ニ氧化硅包覆磁性纳米颗粒在肺脏内成点状分布，而与葡聚糖修饰磁性纳米颗粒不同，尾静脉注射72小时后，ニ氧化硅包覆磁性材料在肺脏中依然有大量分布(图6下)，说明ニ氧化硅包覆磁性材料在72小时后不能被肺脏所清理。实施例4、磁性纳米颗粒催化DAB染色与普鲁士蓝染色灵敏度比较与传统检测磁性纳米颗粒在体内分布的普鲁士蓝染色比较，利用磁性纳米颗粒的催化活性示踪其分布的灵敏度更高。具体方法如下将葡聚糖修饰磁性纳米颗粒以40mg/ kg体重的剂量经尾静脉注射BALB/c小鼠，分別在注射后0. 25小时和5小时后处死小鼠， 取肝脏，经OCT包埋，进行冰冻切片。取两张连续切片在预冷的丙酮里固定5分钟，然后再含有0. 3% H2O2的甲醇中孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰。PBS洗涤三次，其中 ー张用新鮮配制的DAB显色液显色(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司， 显色操作按试剂盒说明书进行)，另ー张用普鲁士蓝显色(购自上海源叶生物科技有限公司)。结果如图7所示，与普鲁士蓝显色相比较，DAB显色具有更高的灵敏度。利用磁性纳米颗粒的催化活性和普鲁士蓝染色两种方法示踪ニ氧化硅包覆的磁性纳米颗粒的灵敏度比较，具体方法如下将ニ氧化硅包覆的磁性纳米颗粒以40mg/kg体重的剂量分别经尾静脉注射BALB/c小鼠，分別在注射后0. 25小时和5小时后处死小鼠，取肝脏，经OCT包埋，进行冰冻切片。取两张连续切片在预冷的丙酮里固定5分钟，然后再含有0. 3% H2O2的甲醇中孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰。PBS洗涤三次，其中ー张用新鮮配置的DAB显色液显色(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色操作按试剂盒说明书进行)，另ー张用普鲁士蓝显色(购自上海源叶生物科技有限公司)。 结果如图8所示，与普鲁士蓝显色相比较，DAB显色具有更高的灵敏度。
权利要求
1.一种利用具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒在哺乳动物体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，其包括1)将所述具有过氧化物酶活性的磁性纳米颗粒注入所述哺乳动物体内；2)在注射所述磁性纳米颗粒后经过适当时间，取所述哺乳动物的脏器组织，进行组织切片；和3)利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性催化过氧化氢和沉淀型氢供体反应，导致氢供体生成沉淀，通过观察沉淀确定组织中磁性纳米颗粒的分布、和含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的磁性纳米颗粒包括!^e3O4磁性纳米颗粒和 Y -Fe2O3磁性纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其还包括在动物组织切片后，将组织切片在0.3% H2O2 的甲醇中孵育30分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的磁性纳米颗粒为葡聚糖修饰磁性纳米颗粒或二氧化硅包覆磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述的时间为0.25小时-72小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤2)中所述的时间为5小时。
7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤幻中所述的沉淀型氢供体包括3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐、四甲基联苯胺或3-氨基-9-乙基咔唑。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述动物脏器组织为肝、脾、肺、肾、淋巴结、或胸腺。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织切片可以通过石蜡切片技术、冰冻切片技术获得。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性纳米颗粒主要被动物组织中的单核巨噬细胞吞噬。
全文摘要
本发明利用磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，建立了一种新的磁性纳米颗粒体内原位、无标记检测方法。该方法包括通过尾静脉注射的方法将磁性纳米颗粒注入小鼠体内，利用磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，催化3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)在磁性纳米颗粒富集的部位生成棕黄色沉淀，从而检测磁性纳米颗粒在不同组织、器官的分布，这种新的检测方法为建立纳米材料安全性评价方案奠定重要基础。
文档编号G01N33/58GK102565411SQ201010591290
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者冯静, 庄洁, 杨东玲, 阎锡蕴 申请人:中国科学院生物物理研究所