专利名称：同位素硫标记乙肝基因脱氧核糖核酸探针的制作方法
技术领域：
本发明属于一种药物制备方法。
目前对乙肝病人及带毒者检查血内是否有HBV的复制，对流行病学，临床诊断、治疗及机理研究上都有重要意义。敏感性及将异性较强的方法是利用HBV-DNA探针检查血清标本内是否有病毒基因的存在，用32P标记的DNA探针经分子杂交直接检测血液及其他标本中的乙型肝病毒(HBV)，据《中华传染病杂志》1983年第一期报导，用32P标记的DNA探针已用于临床及实验室研究，但由于32P的半衰期短以及辐射强度较大，杂交过程繁锁，在临床使用上受到一定影响。为了解决上述的标记问题，可以采用本发明35S代替P标记乙肝DNA探针。由于35S半衰期较长，而且无扩散，加上简化了杂交方法，故可以广泛应用于临床和试验。
本发明35S标记乙肝DNA探针的制备方法是通过以下步骤实现的。
1.取一定量的HBV，DNA质粒或片段;
2.加入放射性底物35SαdATP;
3.加入dCTP、dGTP、TTP;
4.加入DNAase、I和DNA多聚酶及大片段酶;
5.加入标记缓冲液Nick、BSA;
6.在恒温约14℃的水浴中反应数小时;
7.加入中止液;
8.用饱合酚及氯仿提取DNA;
9.经离心后过G50柱，收集穿流峰即制成35S标记的HBV-DNA探针;
10.浓缩后冻存。
本发明35S标记乙肝DNA探针，其35S半衰期为86天，(32P为14天)，使用时间已近于标准试剂合的使用时间，故可以广泛应用。
又因35S无扩现象，斑点清晰，辐射强度亦较32P小，因此使用安全，本发明一个重要用途是利用它检测血清中HBV-DNA的存在，以35S标记的HBV探针检测血清中HBV病毒的方法，达到探针长效化和杂交方法简单化，故能适用于临床及实验室的广泛应用其灵敏度可达2.5-10Pg。
实施例取DNA质粒或片段，2μl加入放射性底物，35SdATP10-100μci，并加入0.5mMdCTP，dGTP，TTP各2μl，然后加入DNAasel湍NA多聚酶及大片段酶各1μl，并加入标记缓冲液在14℃水溶中反应6小时，然后加入中止液;再用半饱合酚及氯仿提取DNA，经10k离心2分，过G50柱，收集穿流峰即可制成35S标记的HBV-DNA探针，浓缩后于-30℃冻存。
权利要求
1.一种标记乙肝DNA探针的方法，其特征在于它的基材为35S。
2.按照权利要求1所述的标记乙肝DNA探针的方法，其特征在于标记时反应时间为数小时。
3.按照权利要求1所述的标记乙肝DNA探针方法，其特征在于反应时加入酶的种类为DNAaseI、DNA多聚酶、大片段酶
4.按照权利要求1所述的标记乙杆DNA探针方法，其特征在于分离游离35S的方法是过G50柱。
5.按照权利要求1所述的标记乙肝DNA探针方法，其特征在于加入标记缓冲液Nick缓冲液、BSA。
6.按照权利要求1所述的标记乙肝DNA探针方法，其特征在于它是由以下步骤实现的(1)取一定量的HBV，DNA质粒或片段(2)加入放射性底物35SαdATP;(3)加入dCTP、dGTP、TTP;(4)加入DNAase、I和DNA多聚酶及大片段酶(5)加入标记缓冲液(6)在恒温约14℃的水浴中反应数小时(7)加入中止液(8)用饱合酚及氯仿提取DNA(9)经离心后过G50柱，收集穿流峰即制成35S标记的HBV-DNA探针(10)浓缩后，于-30℃冻存。
全文摘要
本发明1.取一定量的HBV，DNA质粒或片段；2.加入放射性底物3.加入dCTP、dGTP、TTP；4.加入DNAase、I和DNA多聚酶及大片段酶；5.加入标记缓冲液；6.在恒温约14℃的水浴中反应数小时；7.加入中止液；8.用饱合酚及氯仿提取DNA；9.经离心后过G50柱，收集穿流峰即制成10.浓缩后冻存。
文档编号G01N33/576GK1044341SQ8810714
公开日1990年8月1日 申请日期1988年10月27日 优先权日1988年10月27日
发明者孙勉, 王申五, 肖元朴, 张启云 申请人:北京第一传染病医院