专利名称：检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，更具体地说，涉及一种检测黄曲霉毒素 Bl的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是一种强致癌性极毒物质，是黄曲霉和寄生曲霉中 产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及饲料制品中。黄曲霉毒素根据分子结构差 别主要分为四类B1、B2、GU G2，其中，黄曲霉毒素Bl简称AFBl是目前最常见也是毒性最 强的化学致癌毒物，它在WTO确定的重点研究毒物中被列为首位。黄曲霉毒素Bl分子式为C17H12O6，化学结构式一j^^Y^z1其结构式
权利要求
1.一种检测黄曲霉毒素Bl的化学发光免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉 毒素Bl校准液，固体载体，酶标记结合物，化学发光底物液A、B,及浓缩洗涤液，其特征在 于，所述固体载体为微孔板，且所述微孔板由黄曲霉毒素Bl单克隆抗体包被，所述酶标记 结合物是辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B 1完全抗原，所述化学发光底物液A含鲁米 诺或异鲁米诺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准液、酶标记结合物与化学发光 底物液A、B总和的体积比是1 1 2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液A含有 鲁米诺或异鲁米诺1 20mmol/L4-羟基联苯0. 1 0. 5mmol/L4-碘代苯基硼酸0. 01 0. lmmol/L硼酸缓冲溶液50 500mmol/L pH 8. 0 10. 0 ；所述的化学发光底物液B含有过氧化脲1 5mmol/L吐温200. 05 0. 5 % (体积)磷酸盐缓冲溶液10 50mmol/L pH 7. 0 7. 6 ；所述化学发光底物液A与B的体积比为1 1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液A含有 鲁米诺或异鲁米诺lOmmol/L4-羟基联苯0. 3mmol/L4-碘代苯基硼酸0. 05mmol/L硼酸缓冲溶液200mmol/L pH 8. 0 10. 0 ；所述的化学发光底物液B含有过氧化脲3. 5mmol/L吐温200.1% (体积)磷酸盐缓冲溶液20mmol/L pH 7. 0 7. 6。
5.根据权利要求1 4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有 NaCl12 20% (重量)KCl0. 1 0. 7% (重量)吐温200. 05 0. 2 % (体积)Tris-HCl 缓冲液 50 500mmol/L pH 7. 2 7. 6。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有 NaCl16% (重量)KCl0. 4% (重量)吐温200.1% (体积)Tris-HCl 缓冲液 200mmol/L pH 7. 2 7. 6。
7.—种检测黄曲霉毒素Bl的化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，其特征在于， 所述方法包括如下步骤A、制备包被微孔板将含7. 30g/L的柠檬酸三钠和4. 45g/L的柠檬酸，pH值为4. 5 4.8的包被液与黄曲霉毒素Bl的单克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上，用生理 盐水洗涤后，用含 0. 2g/L NaH2PO4 · 2H20，2. 9g/LNaH2P04 · 12H20、10g/L BSAjP lmL/L 生物 防腐剂，PH值为7. 0 7. 5的封闭液封闭上述洗涤后的载体；B、制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素Bl采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化 物酶标记的黄曲霉毒素Bl完全抗原溶液，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗原工作浓度， 并溶解于(重量)牛血清白蛋白，lOmmol/L pH 7. 2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗原工 作溶液；C、制备发光底物液化学发光底物液A含有 鲁米诺或异鲁米诺 4-羟基联苯 4-碘代苯基硼酸 硼酸缓冲溶液 化学发光底物液B含有 过氧化脲 吐温20磷酸盐缓冲溶液 D、制备浓缩洗涤液 浓缩洗涤液含有 NaCl KCl吐温20Tris-HCl缓冲液20mmol/L0. 1 -0. 010. 5mmol/L 一 0. lmmol/L50 500mmol/L pH 8·0 10.01 5mmol/L0. 05 0· 5% (体积)10 50mmol/L pH 7. 0 7. 6 ；12 20% (重量)0. 1 0.7% (重量)0. 05 0. 2% (体积)50 500mmol/L pH 7. 2 7. 6E、制备黄曲霉毒素Bl校准液用黄曲霉毒素Bl的纯品配制，分装0. 05,0. 15,0. 5、 2. 5,7. 5、10ng/ml共6瓶，过滤除菌、分装、低温储存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化学发光底物液A含有 鲁米诺或异鲁米诺 lOmmol/L 4-羟基联苯0. 3mmol/L4-碘代苯基硼酸0. 05mmol/L硼酸缓冲溶液200mmol/L pH 8. 0所述化学发光底物液B含有10. 0过氧化脲 吐温20磷酸盐缓冲溶液 所述浓缩洗涤液含有 NaCl KCl吐温20Tris-HCl缓冲液7. 63. 5mmol/L 0. 1% (体积) 20mmol/L pH 7. 016% (重量) 0.4% (重量) 0. 1% (体积) 200mmol/L pH 7. 2 7. 6〔
9.一种检测黄曲霉毒素Bl的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)样品前处理将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20%乙醇提取，取上层液4°C保存，使用时用 PBS-BSA等体积稀释为样品液；2)使用前述1 6任一项所述试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲 霉毒素Bl的含量；其中，所述步骤幻包括A、加样进行免疫反应在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素Bl校准品或样品液25 100 μ L/孔，然后加入酶标记结合物50 150 μ L/孔，混勻后20 37°C温育20 160min ；B、加底物液将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液25 200μL/孔，避光反应 0 15min ；C、读值定量在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标 准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素Bl的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中反应温度为37°C；所述 黄曲霉毒素Bl校准品或样品液的加入体积为50 μ L/孔，所述酶标记结合物的加入体积为 50 μ L/孔，所述化学发光底物液的加入体积为100 μ L/孔；温育时间为60min，避光反应时 间为5min。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B1校准液，固体载体，酶标记结合物，化学发光底物液A、B，及浓缩洗涤液，其中，所述固体载体为微孔板，且所述微孔板由黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被，所述酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原，所述化学发光底物液A含鲁米诺或异鲁米诺。本发明还公开了一种黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法及检测黄曲霉毒素B1的方法。使用本发明制备的试剂盒检测黄曲霉毒素B1，具有操作简便，灵敏度高，特异性好，高效、线性范围宽，与病原学检验结果符合度极高等特点，为把好食物及饲料入口关提供保证。
文档编号G01N33/577GK102072958SQ20101053605
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者唐宝军, 柴淑芳, 胡国茂 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司