专利名称：环境水体微生物快速检测方法及试剂的制作方法
专利说明环境水体微生物快速检测方法及试剂 本发明涉及一种快速、定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞等微生物数量的快速检测方法及试剂。江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等各种水体中微生物数量是评判其洁净程度的重要指标，常规方式是工作人员采集水样，然后带回实验室分类培养，从培养到肉眼可见的菌落需要1～15天时间(根据微生物种类而定)，且操作繁琐，局限于实验室，对操作人员的技术水平要求高，容易出现人为的误差。而迄今为止，作为自然环境中的微生物，能够进行人工培养的只是很少一部分，一般认为只有5～10％，没有单独一种培养基或一套物理、化学条件能够满足样品中所有微生物的生理要求。同时，培养基的制备、平板培养和菌落计数工作量大、费时、费力。因此，野外环境及生产现场监测迫切需要建立一套简便、灵敏、快速的微生物数量检测方法。
ATP生物发光技术是目前有望实现即时检测微生物的最快的方法，它的原理是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)以荧光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在Mg2+存在时，能将化学能转化为光能。反应式表示为
ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线形关系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，一般范围是0.28×10-10～8.9×10-10μg，平均为3×10-10μg。而微藻细胞ATP含量约是细菌的100倍。因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为几分钟。由于生物发光法无需培养过程，操作简便，灵敏度高，数分钟内可得到结果，它在微生物污染及生物量检测中的应用得到迅速发展，许多国家已将它作为环境卫生现场监督检测的有效手段，而国内尚处于起步阶段。然而ATP生物发光法的灵敏度要求样品中细菌浓度最低不少于103cells/mL，但这种灵敏度有时达不到检测的要求；另外，ATP生物发光反应是酶反应，样品中的许多因素均会干扰反应，直接使用生物发光法进行微生物快速检测则不能有效地检出其中的含菌量，从而造成假阳性或假阴性。因此，ATP生物发光法虽然灵敏、快速，但上述不足之处使它的应用受到了很大的限制。本发明的目的在于提高目前ATP生物发光法的灵敏度，消除样品中干扰酶反应的物质对测定体系的影响，提供环境水体微生物快速检测方法及试剂，解决存在的干扰问题，显著提高检测的灵敏度和缩短检测所需的时间。
本发明所提供的环境水体微生物快速检测方法包括两部分，一是用微孔滤膜进行样品前处理，去除水中干扰物质，将微生物分类、富集；二是用细胞ATP释放剂Ec对样品进行处理，释放出样品中的微生物细胞ATP，然后进行发光检测。
本发明可大大缩短检测时间，15min内可完成细菌总数和微藻细胞数量的检测。
本发明的环境水体微生物快速检测方法具体操作方法(1)样品前处理a.参照常规取样方法取水样100～1000mL(根据样品的洁净程度而定)，振摇使样品分散均匀，然后用经灭菌处理的20μm的微孔滤膜抽真空过滤样品，去除大于20μm的颗粒杂质，洁净的饮用水可省去此步骤；b.水样再依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；(2)微生物细胞ATP提取a.分别取过滤样品后的8μm及0.22μm的微孔滤膜，置于50mL无菌烧杯中，各加入1mL无菌去离子水和1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，振荡均匀，作用1～5min；
b.分别取1mL用pH7.8、浓度为25mmol/L的Tricine缓冲液配制的10-6～10-10mol/LATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；c.用空白微孔滤膜做同样处理作为空白样。
(3)ATP生物发光测定a.吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；b.同时做10-6～10-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测。
(4)样品中ATP浓度的计算根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系可以作一线性回归方程Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]。
因此，根据样品的CPM值从回归方程可以计算样品中的ATP含量样品中ATP浓度(g/L)＝505×10(A+BLg[CPM])注CPM值为1min发光脉冲计数值，505为ATP的分子量。
(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算每个细菌的ATP含量以平均数3×10-10μg计，微藻细胞ATP含量约是细菌的100倍，即3×10-8μg，因此 本发明所提及过滤漏斗和微孔滤膜，前者可用一次性使用无菌制品或经灭菌处理达到无菌要求可反复使用的产品，后者一般为一次性使用无菌制品。
本发明所提及的微生物细胞ATP释放剂Ec含有1～30g/L TritonX-100
0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)制作过程为每升无菌超纯水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加热使其溶解，振匀即成，所有试剂采用分析纯。该试剂可在室温条件下1～5min内完成微生物细胞ATP的提取，简便、快速。
本发明所提及的样品处理解抑剂为内含葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物，具体制作过程为取0.1～15.0g分析纯环糊精溶解于pH 7.8的Tricine缓冲液(内含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌后分装至5个灭菌的小瓶，于4℃冰箱储存备用。该解抑剂可以排除阳离子、阴离子和两性离子表面活性剂等物质对分析的干扰。实施例1河水中细菌总数及微藻细胞数量的快速检测(1)样品前处理a.参照常规取样方法取河水样100mL，振摇使样品分散均匀，然后用经灭菌处理的20μm的微孔滤膜抽真空过滤样品，去除大于20μm的颗粒杂质；b.水样再依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；(2)微生物细胞ATP提取a.分别取过滤样品后的8μm及0.22μm的微孔滤膜，置于50mL无菌烧杯中，各加入1mL无菌去离子水和1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，振荡均匀，作用1～5min；b.分别取1mL用pH7.8、浓度25mmol/L的Tricine缓冲液配制的2×10-6～2×10-10mol/L ATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；c.将空白微孔滤膜做上述处理作为空白样；(3)ATP生物发光测定结果表明用过氧乙酸处理白色念珠菌ATCC10231达到100％杀灭时，换算成原液中的ATP浓度，低于CK溶液中的ATP浓度；用过氧乙酸处理大肠杆菌8099达到100％杀灭时，换算成原液中的ATP浓度低于CK溶液中的ATP浓度的1/10。因此应用生物发光法快速评估消毒剂的消毒效果，当换算成相当于原液中的ATP浓度，如果评估菌为真菌时，低于CK溶液中的ATP浓度则按无活菌计；如果评估菌为细菌时，低于1/10CK溶液中的ATP浓度，按无活菌计。实施例3过氧乙酸消毒剂消毒效果的ATP生物发光快速评估(1)消毒效果评估用菌悬液的制备在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培养基，培养大肠杆菌8099菌株20h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株45h，用接种针刮下斜面上的菌苔至生理盐水中制成的菌悬液，在室温下8000r/min离心5min，弃上清后的菌泥用生埋盐水悬浮，使细菌指示菌的数量为1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，直接作为不加有机物的评估用菌液(简称A液)。加有机物的菌悬液则将离心后的菌泥用生理盐水悬浮后再与30g/L的BSA(牛血清白蛋白)无菌溶液按1∶1比例混合后作为加有机物的消毒剂评估用初始菌液(简称B液)。
(2)过氧乙酸处理前标准备菌悬液活菌总数的ATP生物发光法测定分别取1mL评估用ATCC10231和8099的A液，加入1mLEc振匀，于室温(25℃)作用2min。取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8mL含解抑剂的发光检测缓冲液中，加上萤光素酶-萤光素试剂0.1mL，立即置发光仪中检测发光CPM值，同时进行空白和系列标准ATP的校正检测，并换算成ATCC10231及8099的活菌数量(X)，分别为1.05×107cfu/mL和9.45×107cfu/mL。
(3)过氧乙酸处理后残留活菌总数的ATP生物发光法测定用无菌超纯水稀释130g/L过氧乙酸原液至5.0g/L和2.5g/L，分别加入两种不同浓度过氧乙酸(5.0g/L和2.5g/L)消毒剂至评估用的ATCC10231和8099菌株的50～100mLA液或B液中，使其达到目标浓度，于室温下作用5min和10min之后，加入足够量的50g/L的无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)的磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)无菌溶液摇匀，(中和剂用量为1∶0.9时可中和过氧乙酸的作用)以中和过氧乙酸的作用。放置约10min后，将混合即3×10-8μg，因此 =5.18×10-53×10-13×100]]>=1.73×106]]> =7.71×10-53×10-11×100]]>=2.57×104]]>实施例2储水池水细菌总数及微藻细胞数量的快速检测(1)样品前处理a.参照常规取样方法取储水池水样1000mL，振摇使样品分散均匀；b.水样依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；2、微生物细胞ATP提取a.分别取过滤样品后的8μm及0.22μm的微孔滤膜，置于50mL无菌烧杯中，各加入1mL无菌去离子水和1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，振荡均匀，作用1～5min；b.分别取1mL用pH7.825mmol/L的Tricine缓冲液配制的2×10-6～2×10-10mol/LATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；c.将空白微孔滤膜做同样处理作为空白样。
(3)ATP生物发光测定a.吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；b.同时做2×10-6～2×10-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测。；c.1min发光脉冲计数结果见表2。
表2 样品和ATP标准溶液的发光脉冲计数CPM值
(4)样品中ATP浓度的计算根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系可以作线性回归方程Lg[ATP]＝-12.763+1.097Lg[CPM](R＝0.984)。
因此根据样品的CPM值可以从回归方程计算样品中的ATP含量样品中ATP浓度(g/L)＝505×10(-12.763+1.097Lg[CPM])样品经0.22μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10(-12.763+1.097Lg[7723-377])＝1.52×10-6(g/L)样品经8μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10(-12.763+1.097Lg[6742-377])＝1.30×10-6(g/L)(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算每个细菌的ATP含量以平均数3×10-10μg计，微藻细胞ATP含量约是细菌的100倍，即3×10-8μg，因此
=1.52×10-63×10-13×1000]]>=5.07×103]]> =1.30×10-63×10-11×1000]]>=43]]>
权利要求
1.一种环境水体微生物快速检测方法，其特征在于首先将水样依次经过不同孔径(由大到小)的微孔滤膜过滤后，取下滤膜进行ATP发光检测；同时进行ATP标准溶液和空白微孔滤膜的发光检测，根据ATP浓度与其发光脉冲计数CPM值的对数关系作线性回归方程Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]；最后根据滤膜的CPM值推算样品的ATP浓度及水体微生物的含量。
2.权利要求1所述的检测方法，按下述步骤进行(1)样品前处理a.参照常规取样方法取水样100～1000mL(根据样品的洁净程度而定)，振摇使样品分散均匀，然后用经灭菌处理的20μm的微孔滤膜抽真空过滤样品，去除大于20μm的颗粒杂质，洁净的饮用水可省去此步骤；b.水样再依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；(2)微生物细胞ATP提取a.分别取过滤样品后的8μm及0.22μm的微孔滤膜，置于50mL无菌烧杯中，各加入1mL无菌去离子水和1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，振荡均匀，作用1～5min；b.分别取1mL用pH7.8、浓度25mmol/L的Tricine缓冲液配制的10-6～10-10mol/L ATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；c.用空白微孔滤膜做同样处理作为空白样；(3)ATP生物发光测定a.吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶—荧光素试剂，立刻摇匀，置于生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；b.同时做10-6～10-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测；(4)样品中ATP浓度的计算根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系作线性回归方程Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]样品中ATP浓度(g/L)＝505×10(A+BLg[CPM])(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算
3.权利要求2所述的检测方法，细胞ATP释放剂Ec含有1～30g/L TritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)
4.权利要求2所述的检测方法，解抑剂含有葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物。
5.权利要求4所述的检测方法，解抑剂的制作过程为取0.1～15.0g环糊精溶解于pH7.8Tricine缓冲液(内含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL。
全文摘要
本发明涉及一种快速、定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞数量的检测方法及试剂，首先将水样依次经过不同孔径(由大到小)的微孔滤膜过滤，取下滤膜进行ATP发光检测；同时进行ATP标准溶液和空白微孔滤膜的发光检测，根据ATP浓度与其发光脉冲计数的对数关系作线性回归方程Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]；最后根据滤膜的CPM值推算样品的ATP浓度及水体中细菌和微藻细胞等微生物的含量。本发明可以解决目前ATP生物发光法用于环境水体微生物快速检测过程中存在的干扰问题，显著提高检测的灵敏度和缩短检测所需的时间。
文档编号G01N21/76GK1680805SQ20041002679
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者张菊梅, 吴清平, 吴慧清, 郭伟鹏 申请人:广东省微生物研究所, 广州环凯生物技术有限公司