专利名称：Acf检测方法
技术领域：
本发明涉及通过使用对于畸变隐窝灶(aberrant crypt foci, ACF)特异性高表达的分子来检测ACF的方法。本申请要求基于2010年6月30日在日本提交的日本专利申请2010-148649的优先权，将其内容引入于此以作参考。
背景技术：
结直肠癌在日本是死亡的首要原因，并且在美国是死亡的第二大原因。美国每年 发现约150，000结直肠癌的新病例，这些病例中每年死亡超过50，000例(美国癌症协会(American Cancer Society)估计)。另一方面，由于结直肠癌从良性瘤发展到恶性瘤通常需要几十年，期望早期风险评估和发现从而有助于良好的预后和预防。目前一般所采用的结直肠腺瘤和肿瘤筛选方法的典型实例包括潜血试验、钡灌肠、全结肠镜检和S状结肠镜检。然而，例如在潜血试验的情况中，由于存在其中除腺瘤或肿瘤以外的因素所引起的血检出的病例，不能说这对于结直肠腺瘤和肿瘤具有高度特异性，并且当用于早期检测目的时易于产生假阳性。另一方面，尽管钡灌肠能够检测形态大的晚期癌症，但其存在难以检测小型病变的缺点。另外，由于内窥镜检查使得病变部位(affected site)直接可视化，因此检测结果是高度可靠的，并且这些检查已显示有利于减少结直肠癌的死亡率和发生率。然而，由于病变部位在癌症早期可能极小，因此存在难以通过内窥镜检查检出该病变部位的问题。如此，由于还未完全研发出有效检测结直肠癌和早期结直肠癌的高危群体的检测技术，因而存在许多仅在疾病阶段已发展到一定程度后才进行诊断的情况。因此，期望在早期便能够低损或无损地进行风险评估并发现结直肠癌的高灵敏度和高特异性检测方法。作为从早期病变阶段检测结直肠癌的方法目前所关注的是包括使用核酸和蛋白质分析技术在分子水平上分析的方法。例如，对家族性腺瘤性息肉(familial adenomatouspolyposis, FAP)的遗传易感性是结直肠癌风险因素的典型实例，而通过对受试者进行遗传分析可进行结直肠癌的风险评估。最近，在FAP方式中具有或不具有特征遗传易感性的群体中，已知年龄(50岁以上)和生活方式因素如肥胖、饮酒和吸烟使结直肠癌的未来风险增力口。因此，可由生活方式引起的分子异常(表观遗传学、表达异常)作为预测未来结直肠癌的方式引起注意。事实上，在全基因组相关研究(GWAS)的过程期间已发现了大量表明参与结直肠癌的分子。为了检测大肠中存在的分子异常的目的，已研发了用于分析存在于粪便和血液中的核酸的技术。然而，由于源自于极小病变的核酸仅痕量存在，因而难以早期检测分子异常。在分析装置的敏感度方面，也难以反映血液中测量为Imm以下的微小病变的变化。另外，粪便包含大量肠道细菌以及从病变以外区域剥离的上皮细胞，并且存在大量干扰(noise)。因此，当使用粪便作为样本时，为了检测早期结直肠腺瘤或结直肠肿瘤，需要在癌化和肿瘤发展早期在表达水平上比正常组织增加程度大的优异的分子标记物。因此，还未实现通过检测大肠中早期分子异常来进行结直肠癌早期风险评估的技术的发展。另一方面，畸变隐窝灶(ACF)首先由Bird等人在1987年报道为在施用致癌物(氧化偶氮甲烷)的大鼠大肠中亚甲基蓝浓染的微小病变。ACF构成形态学上可检测的最初形态异常(参见，例如，非专利文献I)，由于还观察到细胞增殖活性急增和K-ras突变，已表明ACF参与结直肠癌和结直肠腺瘤的发病。还在癌症患者和息肉患者的人大肠的离体样本中观察到亚甲基蓝浓染的病变，已报道这些病变的量在健康人、息肉患者和癌症患者中依序增加(参见，例如，非专利文献2)。基于这些发现，ACF更经常用作结直肠癌预防研究中的指标。测量尺寸为1_以下的ACF在一般内窥镜检查中很难检测到，而通常使用放大内窥镜检测。然而，放大内窥镜的使用需要大量时间来操作，因而其使用机会受到限制，并且难以用于早期结直肠癌的初步筛查。如此，还未实现通过在显微镜下或内窥镜下检测微ACF来评估结直肠癌风险的技术的研发。 另外，为了在分子水平上分析ACF，已对有用的分子标记物进行研究。更具体地，表达水平在ACF中波动的分子的已报道实例包括细胞周期素D1、环氧化酶2(C0X2)、连环素@ 1(0连环素)、诱导型氧化氮合成酶2(iN0S);表皮生长因子受体(EGFR)和⑶44分子(CD44)。然而，这些标记物中的每一种均基于小规模研究而被报道，并且不同于结直肠癌，还未有涉及关于ACF病变中分子改变的大规模研究的评估的报道。例如，在C0X2早期研究的实例(参见非专利文献3)中，由于使用整个大肠中所采集的样品来分析分子改变，ACF的特异性低，并且没有与周围(正常)组织比较来分析仅可归因于ACF的分子改变。另外，在细胞周期素Dl的早期研究(参见非专利文献4)、iN0S的早期研究(参见非专利文献5)和CD44的早期研究(参见非专利文献6)中，由于仅分析了免疫染色的数据，该研究缺乏定量和特异性，并且还未能应用到实际医疗中。此外，在iNOS的早期研究(参见非专利文献7)和EGFR的早期研究(参见非专利文献8)中，所述分析靶向于50个隐窝的相当大的ACF，然而未对早期微ACF的分子改变进行分析。如此，尽管已知多种分子，并已表明其具有能够用作ACF标记分子的能力，但这些均未被认为是足够可靠而批准临床应用。换言之，还未实现证明在以测量为Imm以下的微ACF为典型地代表的微病变阶段(即，在早期阶段)表达水平改变的分子的分析，以及通过分子生物学检测进行的结直肠癌未来风险的简单评估。现有技术文献专利文献专利文献I :日本未审查专利申请，首次公开号2007-229054非专利文献非专利文献I :Kelloff 等人，2006，Clinical Cancer Research, Vol. 12, No. 12, pp. 3661-3697.非专利文献2 :Takayama 等人，The New England Journal of Medicine, 1998, VoI. 339，No. 18，pp. 1277-1284.非专利文献3 :Fichera 等人，Journal of Surgical Research, 2007, Vol. 142, pp 239-245.
非专利文献4 Paulsen 等人,Cancer Research, 2005, Vol. 65, pp. 121-129.非专利文献5 :Xu 等人，World Journal of Gastroenterology, 2003, Vol. 9, No. 6,pp.1246-1250.非专利文献6 Boon 等人，Cancer Research, 2002，Vol. 62，pp. 5126-5128.非专利文献7 Takahashi 等人，Carcinogenesis, 2000，Vol. 21，No. 7，pp. 1319-1327.非专利文献8 Cohen 等人,Cancer Research, 2006, Vol. 66, pp. 5126-5128.

发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的为提供通过在分子水平上分析大肠组织的被检区域来检测ACF的方法。用于解决问题的方案作为为解决前述问题而进行的深入研究的结果，本发明的发明人发现，GSTp,iNOS、CD44、EGFR、C0X2和Fzdl在测量为Imm以下的微ACF中的表达水平比正常组织中的表达水平增强，从而导致本发明的完成。S卩，本发明提供(I) 一种用于检测畸变隐窝灶(ACF)的方法，其包括检测存在于大肠组织的被检区域的选自由GSTp、iNOS、CD44、EGFR、C0X2和Fzdl组成的组的ACF特异性表达增加的一种或多种分子；(2)根据上述(I)所述的ACF检测方法，其中所述被检区域的直径为0.5mm以下；(3)根据上述(I)或(2)所述的ACF检测方法，其中所述被检区域包括疑似为ACF的区域；(4)根据上述(3)所述的ACF检测方法，其包括将在所述被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量与在同所述被检区域相同的大肠组织内的正常组织区域中ACF特异性表达增加的分子的量进行比较；(5)根据上述⑴至⑷任一项所述的ACF检测方法，其中所述被检区域为从生物体中采集的样本；(6)根据上述⑴至⑷任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子的检测在活体内进行；(7)根据上述⑴至(6)任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子通过荧光标记来检测；(8)根据上述⑴至(7)任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子为mRNA或蛋白质；(9) 一种 ACF 检测标记物，其为 GSTp、iNOS、CD44、EGFR、C0X2 或 Fzdl ;和(10) 一种用于评估受试者中结直肠癌和结直肠腺瘤的风险的方法，其使用根据上述(I)至(8)任一项所述的ACF检测方法基于在所述受试者的大肠组织的被检区域中ACF的检测结果来进行。发明的效果
根据本发明的ACF检测方法，可使用分子生物学技术检测ACF。特别地，本发明的ACF检测方法能够准确检测测量为Imm以下的微ACF。由于ACF被认为是结直肠癌和结直肠腺瘤的指标，因此本发明的ACF检测方法对于结直肠癌和结直肠腺瘤的早期检测及其风险评估是有用的。



图I描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品(正常周围组织样品)和ACF样品(ACF部位样品)中GSTp的相对表达水平的图。图2描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中iNOS的相对表达水平的图。图3描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中EGFR的相对表达水平的图。图4描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中CD44的相对表达水平的图。图5描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中Fzdl的相对表达水平的图。图6描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中Cdhl的相对表达水平的图。图7描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中Ctsb的相对表达水平的图。图8描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中PCNA的相对表达水平的图。图9描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中Ctnnb的相对表达水平的图。图10描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中Met的相对表达水平的图。图11描述了示出实施例I中在来自大鼠个体的对照样品和ACF样品中C0X2的相对表达水平的图。图12描述了实施例2中AOM大鼠的GSTp特异性荧光探针的荧光染色图像。图13为示出实施例2中图12的AOM大鼠的荧光染色图像中ACF部位的荧光强度和与ACF部位相同面积的正常组织区域的荧光强度的分析结果的图。图14描述了实施例2中AOM大鼠和正常大鼠的C0X2特异性荧光探针的荧光染色图像。图15为示出实施例2中图14的AOM大鼠的荧光染色图像中ACF部位的荧光强度和与ACF部位相同面积的正常组织区域的荧光强度的分析结果的图。图16描述了实施例2中使用荧光标记的抗GSTp抗体所获得的AOM大鼠的免疫染色图像。
具体实施方式
在本发明和本申请的说明书中，ACF特异性表达增加的分子是指在相同个体的大肠组织中在ACF中比周围正常组织中的基因表达水平增加的分子。另外，在本发明和本申请的说明书中，大肠是指包括阑尾、结肠、直肠和肛门的区域，而大肠组织是指包括大肠粘膜和大肠上皮的组织。在本发明和本申请的说明书中，区域直径是指该区域为圆或椭圆的情况下的直径(椭圆情况下为长径)；在该区域为除圆或椭圆以外的形状的情况下，当该区域接近于圆形时为近似圆的直径；或者在该区域的形状接近于近似椭圆形的情况下为近似椭圆的长径。本发明的ACF检测方法的特征在于，检测存在于大肠组织的被检区域的选自由谷胱甘肽 S-转移酶 pi (GSTp)、iNOS (N0S2)、CD44、EGFR、C0X2 和卷曲蛋白同系物 I (frizzledhomo I og I, Fzdl)组成的组的ACF特异性表达增加的一种或多种分子。尽管GSTp可能具有多种同工型，但仅需要这些同工型为在大肠组织中表达的那些，并且可仅检测到一种同工型，或者可检测到多种同工型。所有这六种ACF特异性表达增加的分子为在测量为Imm以 下的微ACF中比周围正常组织中的表达水平增强的分子。因此，这六种ACF特异性表达增加的分子是临床上有用的检测ACF并特别是检测微ACF的标记物分子，并且通过使用这些ACF特异性表达增加的分子的表达水平作为指标，可准确地检测相当大的ACF(即，其中形态异常已发展的ACF)以及早期微ACF。在本发明的ACF检测方法中，可检测前述六种ACF特异性表达增加的分子中的至少一种，或者对于单一被检区域可检测两种或更多种。尽管检测ACF特异性表达增加的分子的表达水平的被检区域不特别限定(只要其为大肠组织的区域)，但优选疑似为ACF的区域(疑似ACF区域)。疑似ACF区域的实例为通过亚甲基蓝染色而浓染的大肠组织的区域。尽管除ACF以外的区域最终也通过亚甲基蓝染色而被染色，但在本发明的ACF检测方法中，通过使用ACF特异性表达增加的分子的表达水平作为指标，可通过亚甲基蓝染色来准确地检测ACF。疑似ACF区域的其他实例包括其中通过内窥镜观察、显微镜观察或图像分析等观察到形态异常的区域。本发明中作为检测对象的六种ACF特异性表达增加的分子全部为在微ACF中比正常组织中的基因表达水平增加的分子。因此，在本发明中，可通过使用包含具有Imm以下的直径的疑似ACF区域的区域作为被检区域来检测微ACF。本发明的ACF检测方法中所使用的被检区域的尺寸不特别限定，并且虽然可考虑例如疑似ACF区域的尺寸等这类因素来适当地确定被检区域的尺寸，但疑似ACF区域优选占被检区域大的比例。在正常组织区域占被检区域的比例过大，甚至疑似ACF区域实际为ACF所存在的区域的情况下，变得难以检测被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量与正常组织中ACF特异性表达增加的分子的量之间的差异。例如，在被检区域包含直径1_以下的疑似ACF区域的情况下，被检区域的直径优选Imm以下、更优选小于1mm，甚至更优选0. 5mm以下。在本发明的ACF检测方法中检测到的ACF特异性表达增加的分子仅要求为反映基因表达水平的分子，并可为mRNA或蛋白质。即，本发明的ACF检测方法能够通过在RNA水平或蛋白质水平获得被检区域中ACF特异性表达增加的分子的信息来检测被检区域中的ACF。用于检测ACF特异性表达增加的各分子的方法仅要求为其中检测结果取决于被检区域中各分子的量或浓度的方法，并可从用于检测样本中的mRNA或蛋白质的已知方法中适当地选择和使用。特别地，用于检测ACF特异性表达增加的分子的方法优选与用于表达分析的方法一起进行。各方法可根据常规方法来进行。在ACF包含在被检区域的情况下，在被检区域中特异性表达增加的分子的量比在大肠组织的正常组织中的量多。因此，可通过比较存在于被检区域中的ACF特异性表达增加的分子的量与存在于大肠组织的正常组织中的ACF特异性表达增加的分子的数量，在被检区域中检测ACF。即，在被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量大于正常组织中的量的情况下，可判定ACF包含在该被检区域中，而在该量等于或低于正常组织中的量的情况下，可判定ACF不包含在该被检区域中。被检区域和正常组织区域之间ACF特异性表达增加的分子的量的比较可基于各区域的每单位表面积或每单位体积来进行，或者可基于各区域中所包含的每单位核酸量或每单位蛋白质量来进行。 在本发明中，被检区域和围绕被检区域的正常组织优选在相同个体的大肠中比 较。尽管在ACF特异性表达增加的各分子的表达水平上存在个体差异，但归因于个体差异的影响可通过在相同个体内的比较来消除。ACF特异性表达增加的分子在正常组织中可能不会检测到，并可仅在ACF中检测至IJ，这取决于所使用检测方法的类型和敏感度。在该情况下，在ACF特异性表达增加的分子在被检区域检测到的情况下，判定ACF包含在被检区域中，而在未检测到ACF特异性表达增加的分子的情况下，判定ACF不包含在被检区域中。在ACF特异性表达增加的分子为RNA的情况下，用于检测ACF特异性表达增加的各分子的方法的实例包括包含利用使用对各分子特异的引物的核酸扩增反应的方法，以及包含利用使用对各分子特的探针的杂交反应的方法。利用核酸扩增反应的方法的实例包括从包含在被检区域的RNA借助反转录反应合成cDNA，随后使用所得cDNA作为模板进行核酸扩增反应如RT-PCR，借此在被检区域检测ACF特异性表达增加的分子，或者定量测量能够与正常组织区域中的量相比较的程度。从被检区域提取RNA、反转录反应和RT-PCR或者其他核酸扩增反应可从本申请技术领域已知的技术中适当地选择和进行。当使用利用核酸扩增反应的方法时，扩增的ACF特异性表达增加的分子可通过使用荧光嵌入剂或荧光物质标记的引物来荧光标记，并定量检测。另一方面，当使用利用杂交的方法时，ACF特异性表达增加的分子可通过使用荧光物质标记的探针或已改性从而仅在杂交后发出荧光的探针来荧光标记，并在被检区域中定量检测。在ACF特异性表达增加的分子为蛋白质的情况下，ACF特异性表达增加的各分子可通过使用特异性识别各分子的抗体(特异性抗体)的免疫化学技术来检测。更具体地，在标记有标记物的各分子特异性抗体与存在于被检区域的该分子结合后，在被检区域中的ACF特异性表达增加的分子可通过测量来自标记物的信号而被荧光标记，并定量检测。用标记物标记可通过将标记物与各分子特异性抗体直接结合，或者通过结合到特异性结合有该特异性抗体的二抗来进行。标记物可从抗原抗体反应中通常使用的标记物中或者当检测两个分子结合的存在与否时使用的那些中适当地选择并使用。此类标记物的实例包括荧光物质、磁性物质和放射性同位素。从高敏感度和安全性的角度,优选将荧光物质用作标记物。抗原抗体反应可根据常规方法进行。除了免疫化学技术以外，可使用特异性指示ACF特异性表达增加的分子的活性的探针，并可通过检测该探针来检测蛋白质形式的ACF特异性表达增加的分子。ACF特异性表达增加的分子的检测可对于从生物体中采集的样本进行。例如，显微镜下从通过将手术切除生物体大肠组织的部分区域所采集的离体大肠组织所获得的样品中采集包含疑似ACF区域的被检区域的样品。此时，根据需要从相同的手术切除的大肠组织样品中采集正常组织区域，优选被检区域周围的正常组织的样品。另外，可通过用亚甲基蓝将生物体的大肠组织初步染色然后手术切除浓染区来直接从生物体中采集被检区域的样品(活体解剖样品)。还可以用与手术切除的大肠组织样品相同的方式从生物体中采集被检区域周围的正常组织样品。然后将以该方式采集的被检区域和正常组织区域的样品用于检测ACF特异性表达增加的分子。活体内大肠组织的亚甲基蓝染色可根据常规方法进行。ACF特异性表达增加的分子的检测还可在活体内进行。例如，将对于ACF特异性表达增加的分子特异的标记探针、直接或间接标记的ACF特异性表达增加的分子的特异性抗体或指示ACF特异性表达增加的分子的活性的特异性标记探针涂布或喷射在生物体大肠中的包含被检区域的区域中，在使探针或特异性抗体与ACF特异性表达增加的分子结合从 而标记ACF特异性表达增加的分子后，可通过检测标记物来检测ACF特异性表达增加的分子。在活体内检测ACF特异性表达增加的分子的情况下，ACF特异性表达增加的分子优选通过荧光标记检测。更具体地，首先用标记有荧光物质的探针或特异性抗体对ACF特异性表达增加的分子进行荧光标记。随后，用内窥镜或胃肠影像示波器(gastrointestinalvideo scope)光学检测从标记物发出的荧光，从而获得荧光图像。然后通过分析所得荧光图像可高敏感度和定量地检测ACF特异性表达增加的分子。ACF特异性表达增加的分子在活体内的检测可通过使用荧光内窥镜容易且有效地进行。更具体地，可使用内窥镜系统，例如部分插入生物体的体腔中从而获取所述体腔内被成像物的图像的内窥镜系统，并且该内窥镜系统设置有试剂排出手段(agent dischargemeans，其用于将与存在于被成像物中的特异性物质结合或反应的敏感性荧光剂或在被成像物中积累的荧光剂向被成像物排出)、用于控制试剂排出手段的排出控制手段、发出用于激发荧光剂的激发光和具有不同于激发光的光谱特性的照射光的光源单元、用于使来自光源单元的激发光和照射光向被成像物传播的光学器件(optics)以及设置在插入体腔的部位并能够捕捉由于激发光而从被成像物辐射的荧光图像和与由于照射光而从被成像物辐射的荧光不同频段的光的成像手段(参见，日本未审专利申请，首次公开号2007-229054)。将已用荧光物质标记的对ACF特异性表达增加的分子特异的探针或特异性抗体用于荧光剂。在本发明的ACF检测方法中，为了检测ACF特异性表达增加的分子所提供的样品仅要求是源自动物的大肠，并可为来自鱼类、鸟类、爬行动物或哺乳动物的样品。在本发明中，样品优选来自哺乳动物。哺乳动物的实例包括啮齿动物如小鼠、大鼠或豚鼠，除人类以夕卜的动物如狗、猫、牛、马、羊、猪或猴，以及人类。当判定ACF是否存在于被检区域时，关于被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量是否大于正常组织中的量的信息是有用的。因此，根据本发明的ACF检测方法所获得的检测结果作为为了诊断ACF所提供的信息是有用的。
另外，由于本发明中的六种ACF特异性表达增加的分子的表达水平指示ACF的存在，并由于ACF具有未来发展为结直肠癌的高度可能性，因而当评估存在结直肠癌风险时，以及在早期的未来结直肠癌风险的低侵入性评估期间，根据本发明的ACF检测方法所获得的检测结果充当极其有用的信息。例如，根据本发明的ACF检测方法，在受试者的大肠中被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量大于周围正常组织中的量，并且ACF已在该被检区域中检出的情况下，可将受试者评估为在未来具有结直肠癌和结直肠腺瘤发病的高风险。相反，被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量等于或小于周围正常组织区域中的量，并且ACF未在该被检区域中检出的情况下，可将受试者评估为在未来具有结直肠癌和结直肠腺瘤发病的低风险。实施例尽管下文通过指出本发明的实施例而提供本发明更详细的解释，但本发明不限于以下实施例。[实施例I]在相同个体的周围正常组织区域和疑似ACF区域之间比较包括GSTpl、iNOS (N0S2)、CD44、EGFR、FzdU Cdhl (钙粘蛋白 I)、Ctsb (组织蛋白酶 B)、PCNA (增殖细胞核抗原)、Ctnnbl (连环蛋白P )、Met (met原癌基因)和C0X2的所有11种候选分子的基因表达水平，从而识别那些对ACF特异性增加的基因表达水平的候选分子。更具体地，分别由从大鼠(其中通过施用氧化偶氮甲烷(AOM)而在大肠组织中诱导ACF的形成)采集的离体大肠组织样品来制备仅从显微镜下证实为ACF部位的区域采集的样品和仅从正常组织的周围区域采集的样品，并测量和比较各分子的表达水平。下文提供其详细描述。将五只F 344/N大鼠(雄性，4周龄)在一周的适应期后，每周一次皮下施用A0M(15mg/kg)共3周。在最终给药后经11至14周从各大鼠中取出大肠,从而获得ACF样品。更具体地，用冷PBS洗涤离体大鼠大肠以除去其内容物，在纵向开口后，用60%甲醇和10%乙酸的溶液将组织固定。固定后，用0.2%亚甲基蓝将肠粘膜表层染色。从染色的大鼠 大肠中采集包含在显微镜下证实为ACF部位的部位的那些区域以用作ACF样品。此时，选择并采集测量为Imm以下的微ACF。同时采集周围正常组织作为对照样品。使用商购可得的最小型活体解剖设备从两只大鼠(大鼠I和2)中，以及使用直径小于0. 5mm的自制活体解剖设备从剩余的三只大鼠(大鼠A至C)中采集ACF样品和对照样品。使用PAXgene Tissue RNA Kit(QIAGEN Inc.)从所得ACF样品和对照样品中提取总RNA,并且使用生物分析仪(Agilent Technologies Inc.)证实所提取的RNA的质量。37°C下在已添加了 RIN7以上的RNA(5ng)的反应溶液(终体积20ii L)中进行RT反应60分钟，从而合成cDNA。对于预扩增反应，通过用所得cDNA为模板，使用用于扩增各候选分子的引物组进行少数个循环的预扩增反应。将示于表I的商购可得的引物(AppliedBiosystems Inc.)分别用于所述引物组。更具体地,分别添加10 ii L RT反应后的反应溶液、12. 5 u L预混合各引物组所得的溶液、25 u L核酸扩增试剂(Taqman Gene ExpressionMaster Mix, Applied Biosystems Inc.)和2. 5 U L超纯水,从而制备终体积为50 U L的反应溶液。将各反应溶液置于PCR装置(Eppendorf Corp.)中，95°C热处理10分钟后，进行PCR，其为14个由95°C 15秒和60°C 4分钟组成的热反应的循环。反应后，将反应液稀释20倍，并提供为实时PCR样品。[表 I]
权利要求
1.一种用于检测畸变隐窝灶(ACF)的方法，其包括 检测存在于大肠组织的被检区域的选自由GSTp、iNOS、CD44、EGFR、C0X2和Fzdl组成的组的ACF特异性表达增加的一种或多种分子。
2.根据权利要求I所述的ACF检测方法，其中所述被检区域的直径为0.5mm以下。
3.根据权利要求I或2所述的ACF检测方法，其中所述被检区域包括疑似为ACF的区域。
4.根据权利要求3所述的ACF检测方法，其包括将在所述被检区域中ACF特异性表达增加的分子的量与在同所述被检区域相同的大肠组织内的正常组织区域中ACF特异性表达增加的分子的量进行比较。
5.根据权利要求I至4任一项所述的ACF检测方法，其中所述被检区域为从生物体中采集的样本。
6.根据权利要求I至4任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子的检测在活体内进行。
7.根据权利要求I至6任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子通过荧光标记来检测。
8.根据权利要求I至7任一项所述的ACF检测方法，其中所述ACF特异性表达增加的分子为mRNA或蛋白质。
9.一种 ACF 检测标记物，其为 GSTp、iNOS、CD44、EGFR、C0X2 或 Fzdl。
10.一种用于评估受试者中结直肠癌和结直肠腺瘤的风险的方法，其使用根据权利要求I至8任一项所述的ACF检测方法基于在所述受试者的大肠组织的被检区域中ACF的检测结果来进行。
全文摘要
本发明公开了一种通过在分子水平分析结肠组织中的分析区域来检测ACF的方法。具体公开了一种检测畸变隐窝灶(ACF)的方法，所述方法的特征在于检测选自GSTp、iNOS、CD44、EGFR、COX2和Fzd1的ACF特异性上调的一种或多种分子；ACF检测方法的特征在于分析区域的直径为0.5mm以下；ACF检测的标记物为GSTp、iNOS、CD44、EGFR、COX2或Fzd1；并公开通过使用前述任一处所记载的ACF检测方法，基于受试者的结肠组织的分析区域中的ACF检测结果，来评估受试者中结直肠癌和结直肠腺瘤的风险的方法。
文档编号G01N33/68GK102985564SQ20118003178
公开日2013年3月20日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者堀野叶子 申请人:奥林巴斯株式会社