专利名称：鼻咽癌双标记物金标测试卡的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及鼻咽癌检测试剂，特别涉及一种鼻咽癌双标记物金标测试卡。
背景技术：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生在鼻咽部细胞的癌症，其病变 首发于鼻咽粘膜上皮，向上可侵及颅底，向下可转移到颈部淋巴结，多发年龄在35-50岁之 间。据世界卫生组织统计，全球受到鼻咽癌发病威胁的人口数超过4亿，但超过80%的鼻咽 癌患者集中在中国南方、台湾、香港和东南亚地区。目前的情况是大多数患者被确诊时已届 晚期，即使经过治疗，五年生存率仅为20%以下。如果能早期诊断，及时进行治疗，则5年生 存率可提高到80%以上。可见鼻咽癌的早期诊断是患者获得长期生存的最主要途径。 目前有很多采用金标抗体制作的检测各种疾病的测试卡，测试卡具有便携、操作 简单，甚至无需到医院即可对自身进行初步诊断，也可用于大规模筛查疾病。如专利号为， 200520006609. 6.名称为"胶体金膀胱癌检测试剂条"就采用了胶体金标技术，检测尿液中 的细菌角蛋白，从而判断膀胱癌，但试剂条将胶体金，抗体固定于试剂条上，采用了简单的 免疫区析技术，胶体金表抗体随待测液一起区析至包被抗体的检测线，待测液中的其他杂 蛋白对于检测过程形成严重的噪音，影响检测灵敏度和特异性。对于鼻咽癌的早期检测，目 前没有适合早期检测的试剂条类产品，由于早期检测贵在敏感性特异性高，而将目前这些 测试条换成包被鼻咽癌标记抗原或抗体，很难达到早期检测的目的，假阴性比例会比较高。 当研究发现了一些可用于包被试剂条的标志性抗体或抗原时，更要求特制的测试条以发挥 这些标志物的检测功能。 多年来实验研究和临床实践已经证明，EB病毒感染与鼻咽癌的发生密切相关。EB 病毒是一种Y疱疹病毒，全球接近95%的成人携带此病毒，EB病毒被激活感染鼻咽部细 胞，由潜伏期进入裂解复制状态时，导致鼻咽部细胞发生异常分裂增生造成癌变。鼻咽癌患 者血清中具有针对多种EB病毒抗原的抗体谱， 一般通过检测血清EB病毒抗体来评估患鼻 咽癌的危险度，为鼻咽癌的诊断和筛查提供了有效的检测指标。因为抗VCA/IgG抗体在EB 病毒急性感染期较早出现，终身可保持高水平或升高，因而成为EB病毒急性感染或既往感 染的良好指标。VCA/IgG抗体检测法虽然对EB病毒感染十分灵敏，但对鼻咽癌并不特异，因 为高效价的VCA-IgG还可见于单核细胞增多症、Burkitt' s淋巴瘤，及免疫抑制的病人等 等。Rta是EB病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因BRLFl的编码转录激活 蛋白，申请号200610113403的专利中，公开Rta蛋白是EB病毒进入裂解复制状态必需的 激活元件而且仅仅在鼻咽癌发生时表达。大量的临床试验已经表明检测血液中的抗Rta/ IgG抗体对诊断鼻咽癌具有极高的特异性，目前鼻咽癌血清学诊断倾向于多指标联合应用。 广西梧州肿瘤研究所蔡永林等曾对EB病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(NA1) 以及裂解立即早期抗原Rta等4种EB病毒抗原的抗体不同组合对鼻咽癌的诊断价值作过 评价性研究，结果显示，单一指标而言，VCA抗体的敏感度最高，其余3项的敏感度相似；而 Rta抗体的特异度最高，其它3种抗体的特异度相近。在以logistic回归模型联合ROC曲线评判各种指标组合方案中，发现抗病毒衣壳抗原VCA和抗立即早期抗原Rta两者的抗体 在血清学诊断鼻咽癌时具有很好的互补作用，因而诊断效能是其他双指标组合中最高的， 是为最佳组合指标，有助于提高诊断效率。从成本_效益的角度讲，VCA和Rta的免疫球蛋 白抗体应是鼻咽癌临床血清学诊断最有效的组合之一。 虽然根据上述研究成果，人们可以对鼻咽癌进行早期检查，但基于酶联免疫反应 原理进的检测难以摆脱待测血清中非特异性抗体的干扰，且步骤繁琐，对试剂要求严格，检 测效率低，不适合大规模高效率的早期筛查工作。

实用新型内容本实用新型根据上述领域的空白，提供一种基于胶体金标记机及反向免疫区析技 术而设计的鼻咽癌胶体金标记抗体检测卡，具有高特异性与灵敏性、易于操作的特点，适合 于高效筛查早期鼻咽癌。 鼻咽癌双标记物金标测试卡，包括可对折的底卡和面卡，所述底卡的反应面上从 左至右依次为加样区、试剂反应区和底卡吸水区；所述面卡的反应面上从左至右依次为左 吸水区，视窗区、金标抗体区和右吸水区，其特征在于，所述试剂反应区设置有检测线、所述 检测线上包被有鼻咽癌标志抗原蛋白，所述视窗区对应于所述底卡的试剂反应区，所述金 标抗体区对应于底卡吸水区靠近试剂反应区一端的区域。 所述加样区覆盖材料为玻璃纤维，所述试剂反应区覆盖材料为硝酸纤维素膜，所 述吸水区覆盖材料为棉浆板。 所述金标抗体区覆盖材料为固定有胶体金微粒标记的兔抗人抗体的胶体金结合 物垫。 所述检测线左侧还有包被了羊抗兔抗体的质控线。 所述检测线右侧还有可视的标记线。 所述玻璃纤维中包含有能与蛋白结合的有色染料，所述有色染料指0.4%台盼蓝。 所述鼻咽癌标志抗原蛋白指VCA抗原或Rta抗原。 所述鼻咽癌标志抗原蛋白指VCA抗原和Rta抗原，所述检测线包括两条，左边一条 检测线包被VCA抗原，右边一条检测线包被Rta抗原。 所述试剂反应区长25mm，宽4. 5mm ;所述加样区长10mm，宽4. 5mm ;底卡吸水区长 15mm，宽4. 5mm ;所述视窗区长25mm，宽3mm ;金标抗体区长5mm，宽4. 5mm ;所述左、右吸水 区，长10mm，宽4. 5mm。 所述面卡和底卡反应面在同一面且并排相联。 本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡，采用反流间接免疫层析技术，有效地排 除了非特异性抗体对测试的干扰。测定时先将缓冲液(PBS)加在面卡的右吸水区处层析至 金标抗体区人使金标抗体复溶，然后将待测血清加在底卡的加样区处在膜的区析作用下向 右端移动，若待测血清中有与标志抗原特异性结合的抗体存在，则与试剂反应区上包被在 检测线上的鼻咽癌标记抗原结合形成抗原抗体复合物。等待测血清被层析到试剂反应区 右边沿时，在底卡吸水区处加缓冲液，并立即将面卡反应面合在底卡反应面上，面卡左吸水 区处的强大吸水作用使试剂反应区上的液体反向流动，待测血清中非特异性抗体及无关物 向底卡的加样区方向反向区析，随后从面卡金标抗体区处来的金标兔抗人免疫球蛋白抗体与检测线上的抗原抗体复合物结合，则从视窗区可以看到检测线为深红色线条，则实验结
果为阳性；若血液标本中不含待测特异性抗体，在检测线处就不会形成抗原抗体复合体，金
标兔抗人免疫球蛋白抗体则不能固定在膜上检测线位置，于是在检测线处不出现深红色线
条，试验结果为阴性，该测试卡有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。由于金标抗体与
抗原抗体结合复合物各在一个卡上，待抗原抗体反应充分后才与基本抗体进行反应，提高
了检测的灵敏度，且反向区析的设计方式有效地排出了非特异性抗体的干扰。 本实用新型的加样区、试剂反应区、吸水区及金标抗体区所用材料可用本领域技
术人员熟知的与这些区域的功能符合的材料，本实用新型优选采用的玻璃纤维作为加样区
材料，硝酸纤维素膜作为试剂反应区材料，棉桨板作为吸水区材料，金标抗体区采用胶体金
结合物垫。 本实用新型优选在检测线左侧设置一条包被羊抗兔抗体的质控线，当金标抗体方 向层析到质控线时，在质控线应该呈红色，否则说明测试卡失效，质控线可防止检测结果假 阴性。 本实用新型还优先在检测线右边设置一条可视的标记线，作为提醒观察人员待测
血清被层析到了试剂反应区的右边沿，需要立即在底卡的吸水区滴加磷酸缓冲液。 本实用新型优选在玻璃纤维中溶入与蛋白结合的有色染料，可以是观察人员轻松
观察到待测液的层析情况。 本实用新型采用目前研究的鼻咽癌标志抗原VCA抗原和/或Rta抗原，VCA抗原 包被的测试卡用于早期预防，包被Rta抗原的测试卡由于早期诊断。 本实用新型进一步优选两种抗原同时包被同一张测试卡，可用于早期诊断并对待 测患者按检测结果进行病况分类，便于患者采取进一步措施，例如，测试卡上仅仅VCA抗原 的检测线，设置两条检测线，左边一条检测线包被VCA抗原，右边一条检测线包被Rta抗原， 使本实用新型成为双标记测试卡，检测的结果能将被检测的人群分为鼻咽癌高危、中危和 低危3个亚群，从而指导医生采取不同的随访措施。我们的测试卡用VCA/IgG做为初级筛 查物，若检测结果仅VCA/IgG呈现阳性则视为低危。若VCA/IgG及Rta/IgG都是阳性的视 为中危险度和高危险度，这样既简化了工作程序，减少了工作量，而又达到良好的灵敏度， 提高检测的特异性，还可以将筛查人群划分为不同的危险层次，大大提高了人群鼻咽癌筛 查的工作效率，对鼻咽癌人群普查实践具有很大价值。 本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡，优选做成以下规格所述试剂反应区长 25mm，宽4. 5mm ;所述加样区长10mm，宽4. 5mm ;底卡吸水区长15mm，宽4. 5mm ;所述视窗区 长25mm，宽3mm ;金标抗体区长5mm，宽4. 5mm ;所述左、右吸水区，长10mm，宽4. 5mm，便携，经
济，美观于一体。 本实用新型的底卡和面卡可以是分离的两块卡，也可以做成一边相联的可对折合 页卡，当做成合页卡时，需要保证底卡和面卡的反应面叠合后，底卡与面卡的左端对左端， 右端对右端。 综合来说，本实用新型用于检查鼻咽癌，灵敏度和特异性好，结构简单、使用方便、 检测快捷以及操作人员不需要技术培训，无须特殊的仪器设备，试剂稳定、便于保存，是"床 边检验(point of care test,P0CT)"的理想方法，尤其适于大规模筛查，市场空间广阔，便 于推广应用。


8-检；
图1A本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡的面卡反应面俯视示意图。 图IB本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡的底卡反应面俯视示意图。 图2A本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡的面卡断面示意图。 图2B本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡的底卡断面示意图。 其中2-左吸水区，3-视窗区，4-金标抗体区，5-右吸水区，6-加样区，7-质控线， 线，9-试剂反应区，10-标记线，ll-底卡吸水区.
具体实施方式实施例1. 如图1A，图1B，图2A及图2B所示，本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡，包括 可对折的底卡和面卡，所述底卡的反应面上从左至右依次为加样区6、试剂反应区9和底卡 吸水区11 ;所述面卡的反应面上从左至右依次为左吸水区2，视窗区3、金标抗体区4和右 吸水区5，其特征在于，所述试剂反应区9设置有检测线8、所述检测线8上包被有鼻咽癌标 志抗原蛋白，所述视窗区3对应于所述底卡的试剂反应区9，所述金标抗体区4对应于底卡 吸水区11靠近试剂反应区9 一端的区域。本实用新型采用反流间接免疫层析技术，有效地 排除了非特异性抗体对测试的干扰。测定时先将缓冲液(PBS)加在面卡的右吸水区5处与 金标抗体区4处使金标抗体复溶，然后将待测血清加在底卡的加样区6处在膜的层析作用 下向右端底卡吸水区11端移动，若待测血清中有待测抗体存在，则与试剂反应区9上包被 在检测线8上的鼻咽癌标记抗原结合形成抗原抗体复合物。待待测血清被层析到试剂反应 区9的右边沿时，在底卡吸水区11处加PBS缓冲液，并立即将面卡反应面合在底卡反应面 上，面卡左吸水区2处的强大吸水作用使试剂反应区9上的液体反向流动，待测血清中非特 异性抗体及无关物向底卡的加样区6方向反向层析，随后从面卡的金标抗体区4处来的金 标兔抗人免疫球蛋白抗体与检测线8上的抗原抗体复合物结合，则从视窗区3可以看到检 测线8为深红色线条，则实验结果为阳性；若血液标本中不合待测特异性抗体，在检测线8 处就不会形成抗原抗体复合体，金标兔抗人免疫球蛋白抗体则不能固定在膜上检测线8位 置，于是在检测线8处不出现深红色线条，试验结果为阴性. 本实用新型的加样区6、试剂反应区9、吸水区及金标抗体区4所用材料可用本领 域技术人员熟知的与这些区域的功能符合的材料，本实用新型优选采用玻璃纤维作为加样 区6的材料，硝酸纤维素膜作为试剂反应区9材料，棉桨板作为底卡和面卡上吸水区的材 料，金标抗体区4采用胶体金结合物垫。 本实用新型优选在检测线8左侧设置一条包被羊抗兔抗体的质控线7，当金标抗 体区4的金标抗体反向层析到质控线7时，质控线7应该呈红色，否则说明测试卡失效，质 控线7可防止检测结果假阴性。 本实用新型还优先在检测线8右边设置一条可视的标记线10，作为提醒观察人员 待测血清被层析到了试剂反应区9的右边沿并可以在底卡吸水区11滴加磷酸缓冲液。 本实用新型优选在加样区6的玻璃纤维中溶入与蛋白结合的有色染料，可以使观 察人员轻松观察到待测血清的层析情况。[0038] 本实用新型采用目前研究的鼻咽癌标志抗原VCA抗原和/或Rta抗原，VCA抗原 包被的测试卡用于早期预防，包被Rta抗原的测试卡由于早期诊断。 本实用新型进一步优选两种抗原同时包被同一张测试卡，可用于早期预防和诊断 并对待测患者按检测结果进行病况分类，便于患者采取进一步措施，设置两条检测线8，左 边一条检测线包被VCA抗原，右边一条检测线包被Rta抗原。使本实用新型成为双标记测 试卡，检测的结果能将被检测的人群分为鼻咽癌高危、中危和低危3个亚群，从而指导医生 采取不同的随访措施。我们的测试卡用VCA/IgG做为初级筛查物，若检测结果仅VCA/IgG 呈现阳性则视为低危。若VCA/IgG及Rta/IgG都是阳性的视为中危险度和高危险度。这样 既简化了工作程序，减少了工作量，而又达到良好的灵敏度，提高检测的特异性，还可以将 筛查人群划分为不同的危险层次，大大提高了人群鼻咽癌筛查的工作效率，对鼻咽癌人群 普查实践具有很大价值。 本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡，优选做成以下规格所述试剂反应区9 长25mm，宽4. 5mm ;所述加样区6长10mm，宽4. 5mm ;底卡吸水区11长15mm，宽4. 5mm ;所述视 窗区3长25mm，宽3mm ;金标抗体区4长5mm，宽4. 5mm ;所述左、右吸水区2、5分别长10mm， 宽4.5mm。便携，经济，美观于一体。 本实用新型的底卡和面卡可以是分离的两块卡，也可以做成一边相联的可对折合 页卡，当做成合页卡时，需要保证底卡和面卡的反应面叠合后，底卡与面卡的左端对左端， 右端对右端。 本实用新型的使用过程 使用前，测试卡与待测血清都需恢复至室温，平放桌面。测定时先将缓冲液(PBS) 加在面卡的右吸水区5和金标抗体区4处使金颗粒标记的兔抗人免疫球蛋白抗体复溶，然 后将待测血清标本加在底卡的加样区6处，使其血清中的蛋白与台盼蓝染料结合并一起在 膜的层析作用下向底卡吸水区11端移动，若血清中有待测抗体VCA/IgG存在，则与硝酸纤 维素膜上左边一条检测线8处包被的VCA抗原结合形成抗原抗体复合物-1 。若标本中有待 测抗体Rta/IgG存在时，就与硝酸纤维素膜上右边一条检测线8处包被的Rta抗原结合形 成抗原抗体复合物_2 ;待台盼蓝染料被吸至标记线10处时，在底卡吸水区11处加缓冲液 PBS，并立即将面卡覆盖在底卡上，保持底卡的加样区6与面卡的左吸水区2在一端，左吸水 区2处的强大吸水作用使硝酸纤维素膜上的液体反向流动，血清中非特异性抗体及无关物 向加样区6处反向层析，随后从金标抗体区4处来的金标兔抗人免疫球蛋白抗体与抗原抗 体复合物-1及_2结合，分别在两条检测线处出现深红色线条，过量的金标兔抗人免疫球蛋 白抗体层析至质控线7处与羊抗兔免疫球蛋白抗体结合，出现深红色的质控线7。若血清 标本中不含待测特异性抗体，在检测线8处就不会形成抗原抗体复合体，金标兔抗人免疫 球蛋白抗体则不能固定在检测线8上，于是在检测线8处不出现深红色线条，试验结果为阴 性，而质控线7仍然出现深红色线条。 具体步骤如下 (1)将200 ii L缓冲液(PBS)加在右吸水区5及金标抗体区4处， (2)加一滴样本血液、血清、或血浆(25-50ul)到加样区6处， (3)接着在加样区6处加入50 ii L缓冲液(PBS)，开始计时， (4)观察到待测液超过标记线10时，合上底卡和面卡，[0049] (5)5分钟内读取试验结果，紫红色带出现，测试结果应在5-10分钟时读出，20分 钟后判定无效， (6)本检测结果参考 >阳性(+)两条深红色带出现，一条位于左侧检测线8，另一条位于质控线7，检测 结果表明样本中含有VCA/IgG抗体，水平高于正常值。 >阳性(+)两条深红色带出现，一条位于右侧检测线8，另一条位于质控线7，检测 结果表明样本中含有Rta/IgG抗体，水平高于正常值。 >阳性(+)三条深红色带出现，第一条位于左侧检测线，第二条位于右侧检测线， 第三条位于质控线7，检测结果表明样本中含有VCA/IgG与Rta/IgG，水平高于正常值。> 阴性(一)仅质控线出现一条深红色带，在测试线8无红色带出现。阴性结果表明样本中 VCA/IgG与Rta/IgG含量低到不能测出。 >无效质控线7没出现红色带，表明不正确的操作过程或样本不适当保存或制 备，或测试卡无效，应换新的测试纸和样品再测试。
权利要求鼻咽癌双标记物金标测试卡，包括可对折的底卡和面卡，所述底卡的反应面上从左至右依次为加样区、试剂反应区和底卡吸水区；所述面卡的反应面上从左至右依次为左吸水区，视窗区、金标抗体区和右吸水区，其特征在于，所述试剂反应区设置有检测线、所述检测线上包被有鼻咽癌标志抗原蛋白，所述视窗区对应于所述底卡的试剂反应区，所述金标抗体区对应于底卡吸水区靠近试剂反应区一端的区域。
2. 根据权利要求1所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述加样区覆盖 材料为玻璃纤维，所述试剂反应区覆盖材料为硝酸纤维素膜，所述吸水区覆盖材料为棉浆 板。
3. 根据权利要求1所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述金标抗体区 覆盖材料为固定有胶体金微粒标记的兔抗人抗体的胶体金结合物垫。
4. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述检测 线左侧还设置了包被有羊抗兔抗体的质控线。
5. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述检测 线右侧还有可视的标记线。
6. 根据权利要求2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述玻璃纤维 中包含有能与蛋白结合的有色染料，所述有色染料指0. 4%台盼蓝。
7. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于所述鼻 咽癌标志抗原蛋白指VCA抗原或Rta抗原。
8. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于，所述鼻 咽癌标志抗原蛋白指VCA抗原和Rta抗原，所述检测线包括两条，左边一条检测线包被VCA 抗原，右边一条检测线包被Rta抗原。
9. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于所述试剂 反应区长25mm，宽4. 5mm ;所述加样区长10mm，宽4. 5mm ;底卡吸水区长15mm，宽4. 5mm ;所述 视窗区长25mm，宽3mm ;金标抗体区长5mm，宽4. 5mm ;所述左、右吸水区，长10mm，宽4. 5mm。
10. 根据权利要求1或2或3所述的鼻咽癌双标记物金标测试卡，其特征在于所述面 卡与底卡并排相联且反应面在同一面。
专利摘要本实用新型鼻咽癌双标记物金标测试卡，属于医学诊断设备领域，鼻咽癌双标记物金标测试卡，包括可对折的底卡和面卡，所述底卡的反应面上从左至右依次为加样区、试剂反应区和底卡吸水区；所述面卡的反应面上从左至右依次为左吸水区，视窗区、金标抗体区和右吸水区，其特征在于，所述试剂反应区设置有检测线、所述检测线上包被有鼻咽癌标志抗原蛋白，所述视窗区对应于所述底卡的试剂反应区，所述金标抗体区对应于底卡吸水区靠近试剂反应区一端的区域。本实用新型基于免疫区析技术，具有高特异性与灵敏性、易于操作，检测快捷尤其适于大规模筛查，市场空间广阔，便于推广应用。
文档编号G01N33/574GK201489004SQ20092022243
公开日2010年5月26日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司