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检测氯丙嗪的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

时间:2025-07-02    作者: 管理员

专利名称:检测氯丙嗪的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域
一种检测氯丙嗪(CPZ)的试剂盒及其检测方法,属于时间分辨荧光免疫分析 (TRFIA)技术领域,用于对尿液、组织、饲料等样品中氯丙嗪的含量检测。
背景技术
氯丙嗪是吩噻嗪类代表药物,这种药主要在肝脏代谢,易产生药物残留,残留的氯丙嗪和部分具有原药活性的代谢物能引起白细胞减少和粒细胞缺乏症,从而引起人体肝脏、肾脏的病变,还会引起眼部并发症等。目前有关动物源性食品中氯丙嗪及其代谢物的测定方法主要为理化检测法,如用 GC-MS测定猪肝中的氯丙嗪残留量,检出限为lug/kg,用高效液相色谱法测定饲料中的氯丙嗪残留量,检出限为0. 05mg/L。固相微萃取(SPME)-气相色谱法,检出限为0. 84ug/L0但这些方法仪器设备昂贵,操作复杂,灵敏度低,且不适用于大批量样品的检测,无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。而时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)由于其特异性强、 灵敏度高、操作简便、廉价,且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测CPZ的试剂盒及其检测方法,用于对尿液、组织、 饲料等样品中氯丙嗪含量的检测。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测 CPZ0技术方案该检测CPZ的试剂盒是由(1)96或48孔包被板,(2)缓冲液,(3)氯丙嗪标准,(4)氯丙嗪的抗体冻干品,(5)铕标记的羊抗鼠抗体,(6)洗涤液,(7)增强液所组成。本发明测定方法测定的基础是标记免疫反应。包被有CPZ-OVA的微孔板,加入 CPZ标准或已处理好的样品到各自的微孔中,再加入CPZ抗体,振荡反应,游离的CPZ与微孔板上的CPZ-OVA竞争CPZ抗体,洗涤液洗涤,没有连接的CPZ抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗鼠抗体,进行标记免疫反应,再用洗涤液洗涤,反应后没有连接的EU3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后,在紫外光的激发下发射很强的荧光,用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,荧光强度与样品中的浓度成反比,对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。


图1 CPZ-TRFIA反应示意图。图2 CPZ-TRFIA标准曲线图。图3:检测氯丙嗪的试剂盒示意图。(1)96或48孔包被板,(2)缓冲液,(3)氯丙嗪标准,⑷氯丙嗪的抗体冻干品,(5)铕标记的羊抗鼠抗体,(6)洗涤液,(7)增强液。
具体实施方案
实施例1按下列步骤制备试剂盒和检测尿液样品(l)Eu3+_羊抗鼠抗体的制备取溶解于50mmol/LPBS pH7. 0的5g/L羊抗鼠抗体Hml,经PD-10柱转换缓冲条件,洗脱液为含0. 155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8. 5缓冲液。收集蛋白峰, 经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A^K)),用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L。取 500-1000 μ 1稀释后的羊抗鼠抗体加入含0. 2-0. 4mg的Eu3+-N2_[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中,30°C磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/ L Tris-HCl pH7. 8缓冲液平衡的kpharose CL-6B柱(1 X40cm)层析,A280监测收集蛋白峰,稀释分装备用。(2)包被板固相抗原制备将CPZ-OVA 用 50mmol/L Na2C03_NaHC03 pH9. 6 缓冲液稀释至 5mg/L 的包被液, 96 (或48)孔微孔板各孔加100μ 1,4°C放置过夜。弃去包被液,冲洗两次,加150μ 1含3g/ LBSA的上述缓冲液封闭,4°C放置过夜。弃去封闭液,真空抽干,板条密封后置-20°C冷冻保存。(3)试剂的配制A.标准氯丙嗪(CPZ) (0ng/ml,0. 05ng/ml,0. lng/ml,0. 5ng/ml, lng/ml,5ng/ ml),从CPZ纯品中稀释得到,稀释液为甲醇水=7 3。B.缓冲液8mmol/L NaCl,0. 1% BSA,0. 2%牛 IgG、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)、0. lml/LTween-80 禾口 0. NaN3 的 Tris-HCl ρΗ7· 8。C.洗涤液14.5mmol/L NaCl、0. 2ml/LTween_80 和 0· 2 % NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl ρΗ7·8。D.增强液的配制1升pH3. 2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15 μ mol β -萘甲酰三氟丙酮(β -ΝΤΑ),50 μ mol 三正辛基氧化膦(Τ0Ρ0),Iml 曲拉通 X-100 (Triton X-100)。(4)试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量,盒中的材料如下A. 1X96孔板(8条X 12孔,可以拆分为单孔)包被有CPZ-OVA0B. 6 X CPZ 标准液,1. Oml/ 瓶,标准液浓度为:0ng/ml,0. 05ng/ml,0. lng/ml, 0.5ng/ml,lng/ml, 5ng/ml。C. 1 X CPZ抗体冻干品,用时0. 5ml蒸馏水溶解。D. 1XEU3+-羊抗鼠抗体冻干品,用时0. 5ml蒸馏水溶解。Ε. IX 增强液15ml。F. IX洗涤液30ml,用时以蒸馏水1 25稀释。G. IX 缓冲液30ml。(5)测定之前注意事项A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C )。B.使用之后立即将所有试剂放回2_8°C。C.如果样品量大建议使用多通道移液器。D.在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔。
E.取出需用数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封,保存于2-8°C。(6)具体检测步骤如下取CPZ-OVA板条,加入50 μ 1的CPZ标准或处理好的样品到各自的微孔中,每个标准和样品必须使用新的吸头,加缓冲液1 5000稀释的CPZ抗体50 μ 1,移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体,37°C振荡1小时,洗涤液洗四次,加缓冲液1 400稀释的 Eu3+_羊抗鼠抗体100 μ 1,37°C振荡45分钟,用洗涤液洗六次,加200 μ 1增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的CPZ含量,见表1和图2,该例的样品浓度为0. 3ng/ml。表 1
CPZ标准点样品CPZ浓度 (ng/ml)00.52510500.3荧光值 (cps)41526336589630124521456214256345263380325实施例2按下列步骤制备试剂盒和检测猪肉样品(1)制备试剂盒同实施例1的(1) (5)。(2)具体检测步骤如下取备好的猪肉样品5.00g,经勻浆机破碎,依次加入IOmL乙酸乙酯和LOmL 1. Omol/LNaOH 溶液,以 12000r/min 均质 Imin,静置 0. 5h 后 3000r/min 离心 5min,取 5mL 上清液,用1. Omol/LHCl调pH至7. 0后备用。取CPZ-OVA板条,加入50 μ 1的CPZ标准或处理好的样品到各自的微孔中,每个标准和样品必须使用新的吸头,加缓冲液1 5000稀释的CPZ抗体50 μ 1,移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体,37°C振荡1小时,洗涤液洗四次,加缓冲液1 400稀释的 Eu3+_羊抗鼠抗体100 μ 1,37°C振荡45分钟,用洗涤液洗六次,加200 μ 1增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的CPZ含量,见表3和图2,该例的样品浓度为0. lng/ml。表2
CPZ标准点样品CPZ浓度 (ng/ml)00.52510500.1荧光值 Ccps)4152633658963012452145621425634526340256权利要求
1.一种检测氯丙嗪(CPZ)的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒,其特征是由96或48孔包被板(1)96或48孔包被板( 缓冲液C3)氯丙嗪标准(4)氯丙嗪的抗体冻干品(5)铕标记的羊抗鼠抗体(6)洗涤液(7)增强液所组成。
2.一种用权利要求1所述的试剂盒氯丙嗪的方法,其特征是取包被有CPZ-OVA的微孔包被板,加入CPZ标准或处理好的样品到各自的微孔中,再加入CPZ抗体,振荡反应,洗涤液洗涤,加铕标记的羊抗鼠抗体,进行标记免疫反应,洗涤液洗涤,加增强液振荡后测量荧光强度cps,对照标准曲线计算样品中的CPZ含量。
3.根据权利要求2所述的检测氯丙嗪的方法,其操作为取包被有CPZ-OVA的微孔包被板,加入50 μ 1的CPZ标准或处理好的样品到各自的微孔中,加50 μ 1以缓冲液( 稀释的CPZ抗体,25°C振荡1小时,洗涤液洗三次,加以缓冲液( 稀释的ΙΟΟμ 1EU3+-羊抗鼠抗体,25°C振荡0. 5小时,用洗涤液洗六次,加200 μ 1增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps, 从标准曲线计算样品中的CPZ含量。
全文摘要
一种检测氯丙嗪(CPZ)的试剂盒及其检测方法,属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域,用于对肉类,鱼类等动物性食品中氯丙嗪含量的检测。本发明配制的试剂盒,采用TRFIA检测CPZ,测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有CPZ-OVA,加入CPZ标准或样品,再加入CPZ抗体。游离的CPZ与微孔板上的CPZ-OVA竞争CPZ抗体,没有连接的CPZ抗体被洗涤除去,加入Eu3+-羊抗鼠抗体,标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体被洗涤除去。加增强液后,用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps,荧光强度与样品中的CPZ浓度成反比,对照标准曲线即可确定被测样品中CPZ的含量。本发明提供的检测CPZ试剂盒结构简单,使用方便、廉价、灵敏度高。
文档编号G01N21/64GK102236012SQ20101016034
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者于国君, 匡燕云, 叶卫翔, 岳振峰, 张珏, 张艺, 朱海, 金坚, 陈蕴, 黄飚 申请人:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心

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