专利名称：一种西瓜霜的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种中药的质量控制方法，特别涉及一种西瓜霜的质量控制方法。
背景技术：
西瓜霜为《中国药典》2005年版一部已收载的品种，为葫芦科植物西瓜的成熟新鲜 果实与皮硝经加工制成，成熟西瓜的水溶性成分，主要由碳水化合物和氨基酸类成分组成， 前者约占干重的80 90%，后者约占干重的10%。其主含硫酸钠(Na2S04)。为类白色至 黄白色的结晶性粉末，无臭、味咸。味咸、性寒。入心、胃、大肠经。具有清热泻火，消肿止痛 之功效，用于咽喉肿痛，喉痹，口疮等疾病。该药材在清代乾隆年间的《疡医大全》已被收载， 临床应用已达200余年，一直被历代医家所推崇。但是，一直以来，西瓜霜没有一套正式的 质量控制方法，不利于保证西瓜霜应用的有效性和安全性。本申请人已经申请了专利号为200610097190.X，名称为“一种西瓜霜的质量控制 方法”的发明，授权公告日为2008年5月7号，公开号为CN1614387A，该发明公开了一种西 瓜霜的质量控制方法，该方法主要包括鉴别、检查、氨基酸及微量元素检测和/或含量测定 方法。为了进一步增强西瓜霜的质量控制，增强其专属性和重现性，防止假药或劣药流入市 场，申请人在上述质量控制方法的基础上进一步研究探索，提出一种新的原理科学、操作性 强、重现性好、能够有效控制西瓜霜质量的控制方法。

发明内容
本发明的的目的在于提供一种西瓜霜的质量控制方法。为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种西瓜霜的质量控制方法，该方法包括西瓜霜的含量测定方法和/或鉴别方 法，所述的含量测定方法为含氮量的测定取西瓜霜20 25g，精密称定，连同称取的滤纸置干燥的500ml 凯氏烧瓶中；然后依次加入无水硫酸钠IOg和硫酸铜粉末0. 5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸 20-40ml ；在凯氏烧瓶口放一小漏斗并使凯氏烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶 液的温度保持在沸点以下，等泡沸停止，强热至沸腾，待溶液成澄明的绿色后，继续加热 25-45分钟，放冷，沿瓶壁缓缓加水220-280ml，振摇使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液 100-120ml，沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，照2005年版《中国药典》附录IX L第一法氮测 定法测定，即得；西瓜霜按干燥品计算，含总氮量不得少于0. 10% ；所述的鉴别方法为氨基酸的鉴别取西瓜霜l_3g，加入6mol/L盐酸溶液10_30ml，于沸水浴中加热回 流1-4小时，放冷，滤过，滤液蒸干，用50-80%乙醇20ml分次洗涤残渣及析出的结晶，搅拌， 滤过，合并滤液，蒸干，残渣用水15_40ml溶解，上强酸性阳离子交换树脂柱，用50-300ml水 洗脱，弃去水液，再用氨溶液50-200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇Iml使溶 解，作为供试品溶液，另取谷氨酸对照品和苯丙氨酸对照品适量，分别用70%乙醇溶解制成每Iml各含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照2005年版《中国药典》附录VI B薄层色谱 法试验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、两种对照品溶液各1 μ 1，以0. 5cm宽条带状分别点于同 一硅胶G板上，以正丁醇冰醋酸水为展开剂，展开，取出，晾干，显色；供试品色谱中，在与对 照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。所述的含量测定方法还包括硫酸钠的含量测定取西瓜霜适量，置102°C -120°c干燥至恒重后，取0. 1-2. Og, 精密称定，加水30-750ml，振摇5_30分钟，滤过，沉淀用水50ml分3次洗涤，滤过，合并滤 液，加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液，至不再生成沉淀，置水浴上加热 20-60分钟，静置1小时，用无灰滤纸或称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗 液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0. 6086相乘，即得供试样中含 有硫酸钠的重量；西瓜霜按干燥品计算，含硫酸钠不得少于90. 0%。所述的鉴别方法还包括以下方法中的一种或多种a、钠盐的鉴别取钼丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显 鲜黄色；b、硫酸盐的鉴别取供试品溶液，加氯化钡试液，即生成白色沉淀分离，沉淀在 盐酸或硝酸中均不溶解。所述的质量控制方法还包括西瓜霜的检查方法，所述的检查方法为以下方法中的 一种或多种a、重金属检查取本品l.Og，依2005年版《中国药典》附录IX E第二法检查，含重 金属不得过百万分之十。b、砷盐检查取本品0. 20g,加水23ml溶解，加盐酸5ml，依2005年版《中国药典》附 录IX F第一法检查，含砷量不得过百万分之十。所述的含氮量的测定方法为取西瓜霜22g，精密称定，连同称取的滤纸置干燥的500ml凯氏烧瓶中；然后依次 加入无水硫酸钠IOg和硫酸铜粉末0. 5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸30ml ；在凯氏烧瓶口放一小 漏斗并使凯氏烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸停 止，强热至沸腾，俟溶液成澄明的绿色后，继续加热30分钟，放冷；沿瓶壁缓缓加水250ml， 振摇使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液lUml，沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，照2005年 版《中国药典》附录IX L第一法氮测定法测定，即得；西瓜霜按干燥品计算，含总氮量不得 少于0. 10%。所述的硫酸钠的含量测定方法为取西瓜霜适量，置105°C干燥至恒重后，取0. 4g，精密称定，加水150ml，振摇10分 钟，滤过，沉淀用水50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液，加盐酸Iml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加 入热氯化钡试液，至不再生成沉淀，置水浴上加热30分钟，静置1小时，用无灰滤纸或称定 重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒 重，精密称定，与0. 6086相乘，即得供试样中含有硫酸钠的重量；西瓜霜按干燥品计算，含 硫酸钠不得少于90.0%。所述的检查方法为砷盐检查取西瓜霜0. 20g，加水23ml溶解，加盐酸5ml，依2005年版《中国药典》附录IX F第一法检查，含砷量不得过百万分之十。所述的氨基酸的鉴别方法为取西瓜霜2g，加入6mol/L盐酸溶液15ml，于沸水浴 中加热回流2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，用70%乙醇20ml分次洗涤残渣及析出的结晶，搅 拌，滤过，合并滤液，蒸干，残渣用水20ml溶解，上732强酸性阳离子交换树脂柱，用水200ml 洗脱，弃去水液，再用氨溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇Iml使溶解， 作为供试品溶液，另取谷氨酸对照品和苯丙氨酸对照品适量，分别用70%乙醇溶解制成每 Iml各含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照2005年版《中国药典》附录VI B薄层色谱法 试验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、两种对照品溶液各1 μ 1，以0. 5cm宽条带状分别点于同 一硅胶G板上，以正丁醇冰醋酸水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%茚三酮乙醇溶液，在 105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 斑点。所述的氨基酸的鉴别方法中，薄层色谱法展开温度t为5°C -30°C，相对湿度RH为 -80%，展开剂正丁醇-冰醋酸-水的体积比为2 1 1-4 1 1。所述的氨基酸的鉴别方法中，薄层色谱法展开温度t为27°C，相对湿度RH为 72%，展开剂正丁醇-冰醋酸-水的体积比为3 1 1。本发明质量控制方法含有如下鉴别、检查、含量测定方法中的一种或几种，本发明 质量控制方法中的鉴别、检查、含量测定方法为鉴别方法自如下方法中的一种或几种西瓜霜的水溶液显钠盐(2005年版《中国药典》第一部附录IV)与硫酸盐(2005年 版《中国药典》第一部附录IV)的鉴别反应。钠盐取钼丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色。硫酸盐取供试品溶液，加氯化钡试液，即生成白色沉淀分离，沉淀在盐酸或硝 酸中均不溶解。氨基酸取西瓜霜l_3g，加入6mol/L盐酸溶液10_30ml，于沸水浴中加热回流1-4 小时，放冷，滤过，滤液蒸干，用50-80%乙醇20ml分次洗涤残渣及析出的结晶，搅拌，滤过， 合并滤液，蒸干，残渣用水15_40ml溶解，上强酸性阳离子交换树脂柱，用50-300ml水洗脱， 弃去水液，再用氨溶液50-200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇Iml使溶解，作为 供试品溶液，另取谷氨酸对照品和苯丙氨酸对照品适量，分别用70%乙醇溶解制成每Iml 各含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照2005年版《中国药典》附录？ B薄层色谱法试验， 吸取上述供试品溶液5 μ 1、两种对照品溶液各1 μ 1，以0. 5cm宽条带状分别点于同一硅胶 G板上，以正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，显色；供试品色谱中，在与对照 品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。检查方法自如下方法中的一种或几种重金属取西瓜霜1. Og,依法检查(附录IX E第二法)，含重金属不得过百万分之砷盐取西瓜霜0. 20g，加水15-30ml溶解，加盐酸3_10ml，依法检查(附录IX F第 一法)，含砷量不得过百万分之十。含量测定方法自如下方法中的一种或几种硫酸钠
取西瓜霜适量，置102 °C _120°C干燥至恒重后，取0. 1_2. 0g，精密称定，加水 30-750ml，振摇5_30分钟，滤过，沉淀用水50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液，加盐酸1ml，煮 沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液，至不再生成沉淀，置水浴上加热20-60分钟，静置 1小时，用无灰滤纸或称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物 的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0. 6086相乘，即得供试样中含有硫酸钠(Na2SO4) 的重量；西瓜霜按干燥品计算，含硫酸钠(Na2SO4)不得少于90.0%。含氮量取西瓜霜20 25g，精密称定，连同称取的滤纸置干燥的500ml凯氏烧瓶中；然后 依次加入无水硫酸钠IOg和硫酸铜粉末0. 5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸20-40ml ；在凯氏烧瓶口 放一小漏斗并使凯氏烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等 泡沸停止，强热至沸腾，俟溶液成澄明的绿色后，继续加热25-45分钟，放冷，沿瓶壁缓缓加 水220480ml，振摇使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液100_120ml，沿瓶壁流至瓶底，自 成一液层，照氮测定法(附录IX L第一法)测定，即得；西瓜霜按干燥品计算，含总氮(N) 量不得少于0. 10% ；发明人对氨基酸的鉴别方法进行了大量研究，内容如下氨基酸的鉴别A氨基酸的提取研究(1)直接提取用甲醇对西瓜霜进行回流提取、或超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加 稀乙醇Iml使溶解，作为供试品溶液。结果两种供试品溶液均未见有明显的TLC斑点。(2)水解取西瓜霜2g，置具塞试管中，加6mol/L盐酸溶液15ml，密塞，摇勻，置 105°C烘箱中加热6小时，蒸干，残渣加甲醇20ml溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇Iml 使溶解，作为供试品溶液。结果供试品有较好的色谱，但各斑点分离度欠理想。(3)结论西瓜霜中的氨基酸成分多以肽或蛋白质形式存在，需要酸水解才能游离 出来。由于硫酸钠含量高，水解后应进行精制处理。B氨基酸的精制通过对多种树脂进行比较研究，发现中国药典2005年版一部421页“四味珍层冰 硼滴眼液”鉴别(4)项下采用的精制方法最好，最后拟定的精制条件为西瓜霜水解液蒸干，残渣加水20ml溶解，过SA_2型氢型阳离子交换树脂柱(内径 1. 5cm，长IOcm)，用水200ml洗脱，弃去水液，再加10%氨溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸 干，残渣加稀乙醇Iml使溶解，作为供试品溶液。结果供试品色谱中呈现分离度良好的色谱 斑点。C不同展开系统的选择将各供试品溶液、西瓜对照溶液、对照品溶液，分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，分别选择两种展开剂进行展开展开剂一液化苯酚-0.1%硼砂水溶液G 1)10°C以下放置的下层溶液展开剂二正丁醇-冰醋酸-水G 1 1)结果展开剂一在薄层色谱中的斑点清晰，展开剂二在薄层色谱中班点拖尾明显。 故选择展开剂一作为西瓜霜的展开剂。D显色条件选择氨基酸的经典显色方法喷以茚三酮试液，热风吹至斑点显色清 晰
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E对照品的选择(1)对照药材或对照品以同样的方法制备西瓜的对照药材溶液，虽然与供试品色谱有较好的对应关系， 但是，考虑到如下因素①、氨基酸种类繁多。②、同一氨基酸多分D型和L型。③、供试品 中的氨基酸多通过水解获得，难免共存一定量由2 3个氨基酸组成的短链肽，使不同成分 有相同或非常相近化学位移的可能性大增。④、不同品种、季节及产地的西瓜，氨基酸含量 变化较大这4种因素，都会使供试品的色谱有一定的变化，如果采用对照药材，在重现性方 面的风险较大。因此，选择化学对照品较为理想。(2)化学对照品的选择①初选取丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天门 冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸苯丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸等18种氨基 酸的化学对照品，加70%乙醇分别制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。薄层鉴别色谱图见

图1。其中1、11、17 西瓜对照2、丝氨酸，3、甘氨酸，4、组氨酸，7、脯氨酸、8、色氨酸，9、胱氨酸，10、苏氨酸，13、酪 氨酸，14、天门冬氨酸，15、亮氨酸，16、异亮氨酸6、080801 批样品12、080803 批样品18、080805 批样品19、六种氨基酸对照品溶液从上至下依次为苯丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、 精氨酸、赖氨酸展距8cm 展开温度t :25°C，相对湿度RH 70-80 %。②精选选取跟供试品色谱斑点化学位移接近的色氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、组氨酸， 进行再研究。薄层鉴别色谱图见图2。其中1、四种氨基酸对照品溶液(从上至下依次为色氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、组氨酸)2、080801 批样品3、080803 批样品4、080805 批样品图二表明，与供试品色谱对应最好的是谷氨酸，其次是色氨酸，但色氨酸的对应的 斑点在供试品色谱中比较模糊，位置和颜色也有一定的不确定性。组氨酸虽然与供试品中 最显著的斑点接近，但颜色和化学位移均有差距。蛋氨酸与供试品色谱中对应的斑点在颜 色和化学位移上均有差距。③确定通过上述研究，在氨基酸的化学对照品中，最理想的是谷氨酸。薄层鉴别色谱图见图3。其中1、谷氨基酸对照品2、080803 批样品3、070701 批样品
4、070601 批样品5、西瓜的阴性对照样品展距8cm 展开温度t :25°C相对湿度RH -80%综上所述，初步拟定的TLC鉴别为取西瓜霜2g，置具塞试管中，加6mol/L盐酸溶液15ml，密塞，置105°C烘箱中加热 6小时，放冷，加水10ml，摇勻，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加至SA-2型氢型阳 离子交换树脂柱(内径1.5cm，长IOcm)上，用水200ml洗脱，弃去水液，再加10%氨溶液 IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加稀乙醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取谷氨酸对 照品，加70%乙醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液5 10 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为 黏合剂的硅胶G薄层板上，以液化苯酚-0.1%硼砂水溶液G 1)10°C以下放置的下层溶 液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在 与谷氨酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的班点。发明者对本鉴别进行进一步研究，内容如下西瓜霜系由西瓜的成熟新鲜果实与皮硝经加工制成，成熟西瓜的水溶性成分，主 要由碳水化合物和氨基酸类成分组成，因此，要建立西瓜霜的薄层鉴别，主要针对氨基酸类 成分。西瓜霜中的氨基酸类成分多以肽或蛋白质形式存在，需要经过酸水解才能游离出来， 由于西瓜霜是西瓜与皮硝经加工制成，所以，提取液中含有大量的硫酸钠，供试品溶液的制 备主要是去除硫酸钠的干扰。经试验，西瓜霜的酸水解液蒸干后，残留物中析出大量的结 晶，用70%乙醇分次洗涤残留物，水解物溶于70%乙醇，可除去大部分的无机盐，但70%乙 醇的极性较大，仍能溶出部分硫酸钠，使供试品色谱图中斑点拖尾(图4)。其中样品1.赖氨酸(广州药检所提供的留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701cc65)；3.脯氨酸(广州药检所提供的留样1003JSY0200)；4.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；5.谷氨酸(广州药检所提供的留样1112JSY0216)；6.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；7.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；8.供试品(070601桂林三金药业股份有限公司)。薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500 μ m)。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)。显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :25°C相对湿度RH :70%将供试液通过强酸性阳离子交换树脂柱净化处理，用氨溶液洗脱，可要进一步去 除无机盐的干扰，所得的薄层色谱图斑点集中清晰，分离度较好，同法制备的西瓜霜阴性对 照无干扰(图幻。其中样品
1.赖氨酸(广州药检所提供留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701cc65)；3.脯氨酸(广州药检所留样1003JSY0200)；4.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；5.谷氨酸(广州药检所提供留样1112JSY0216)；6.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；7.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；8 11.供试品(070601、070701、070801、070803桂林三金药业股份有限公司)12.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)。薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500 μ m)。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :25°C相对湿度RH :70%在方法建立的过程中，曾参考《中国药典》2005年版一部“西瓜霜”项下硫酸钠含 量测定方法，于盐酸水解液中加入氯化钡试液，产生硫酸钡沉淀，以去除硫酸钠的干扰，因 为样品中所含硫酸钠的量较大，需要加入大量的氯化钡试液，而且产生的氯化钠仍会干扰 鉴别，因此方法不可行。为简化操作，曾试用不上柱，于水解液中直接加入强酸性阳离子交 换树脂，搅拌使氨基酸吸附，先用水分次洗涤除去无机盐，再用氨溶液将氨基酸洗出，但是 用此法硫酸钠不能完全除去，色谱图中斑点仍有少许拖尾，此方法也未采用。方法中对西瓜 霜蛋白水解的时间也分别作了水解2小时和6小时比较，所得的色谱图基本一致，因此，水 解时间定为2小时。不同品种、季节及产地的西瓜，氨基酸的种类和含量有所不同，方法建立中在选择 氨基酸对照品时，根据桂林三金药业股份有限公司提供的广西壮族自治区分析测试研究 中心关于西瓜霜中氨基酸的检验报告，主要以含量较高的天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬 氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸进行甄别筛选，同时也采用了丝氨酸、异亮氨酸、组氨酸、 色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和亮氨酸进行筛选，从企业提供的4批样品测定 结果(图2)可以看出，4批样品中均能检出谷氨酸、苯丙氨酸与缬氨酸(量较少)，批号 为070701、070801和070803的样品中均能检出赖氨酸和精氨酸，其中批号为070803的样 品含量较高，薄层色谱中斑点清晰，批号为070601的样品未能检出此两种氨基酸。在采用 MerckeO预制板，适当增加展开剂的极性后，供试品薄层色谱中，可检出与天门冬氨酸薄层 Rf值一致的斑点(图 -2~)，但采用手工铺制的硅胶G薄层板时，在与天门冬氨酸Rf值相同 位置上，有一红色斑点干扰，未达到完全分离，因此，为保证薄层色谱的重现性，选取样品中 含量较高、薄层分离度好的谷氨酸和苯丙氨酸作为对照品。其它氨基酸如丝氨酸、异亮氨 酸、组氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和亮氨酸与供试品色谱中斑点的Rf值 有差异(图6)。其中样品1.赖氨酸(广州药检所留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701CC65)；
3.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；4.谷氨酸(广州药检所留样1112JSY0216)；5.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；6.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；7.脯氨酸(广州药检所留样1003JSY0200)；8.供试品(070803桂林三金药业股份有限公司)；9.丝氨酸(广州药检所留样1005JSY0203)；10.异亮氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900599)；11.组氨酸(广州药检所留样0803FSY0024)；12.色氨酸；13.蛋氨酸(广州药检所留样1052JSY0193)；14.甘氨酸(广州药检所留样1005JSY0203)；15.苏氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900760)；16.丙氨酸；17.亮氨酸；18.供试品(070801桂林三金药业股份有限公司)。薄层板硅胶60F254 板(Merck)。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1.5 1.5)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :25°C相对湿度RH 60%在相同温度、相对湿度条件下，比较不同薄层板的层析效果，结果硅胶60预制板 (Merck)较手工铺制的硅胶G薄层板斑点更为集中，但Rf值稍低，因此把展开剂调整为正丁 醇-冰醋酸-水(3 1.5 1.5)，使色谱图中待检测成分的薄层Rf值适中，分离度提高 (见图7-1、7-幻。青岛海洋化工厂生产的硅胶G预制板较手工铺制的硅胶G薄层板斑点集 中，但分离度比硅胶60预制板(Merck)稍差(图7-3)。考虑到方法的通用性，标准正文采 用以0.3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G板。薄层鉴别色谱图见图7-1、7-2、7-3，其中样品1.赖氨酸(广州药检所留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701cc65)；3.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；4.谷氨酸(广州药检所留样1112JSY0216)；5.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；6.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；7 10.供试品(批号070601、070701、070801、070803桂林三金药业股份有限公
司)；11.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)。薄层板图7-1 以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板；图7-2 硅胶 60 预制板(Merck)。
图7-3 硅胶G预制板(青岛海洋化工厂)。展开剂图7-1 正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)；图7-2 ;7_3 正丁醇-冰醋酸-水(3 1.5 1.5)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :25°C相对湿度RH :70%固定薄层板和相对湿度，比较在不同温度(25°C和27°C )条件下展开的薄层效果， 结果表明在此两种温度条件下展开对薄层色谱效果影响不大(见图7-2和图8)。图8:样品1.赖氨酸(广州药检所留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701cc65)；3.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；4.谷氨酸(广州药检所留样1112JSY0216)；5.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；6.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；7.供试品(批号070803桂林三金药业股份有限公司)。薄层板硅胶60预制板(Merck)。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1.5 1. 5)。显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :27°C相对湿度RH :70%固定薄层板和温度，比较在不同相对湿度(70%和40% )条件下展开的薄层效果， 结果表明在此两种相对湿度条件下展开对薄层色谱效果无显著影响，低相对湿度时，斑点 的Rf值稍低，但分离度稍有提高(见图7-2和图9)。图9:样品1.赖氨酸(广州药检所留样0905JSY0337)；2.精氨酸(AJIN0M0T0 CO. 701cc65)；3.天门冬氨酸(AJIN0M0T0 CO. K900145)；4.谷氨酸(广州药检所留样1112JSY0216)；5.缬氨酸(AJIN0M0T0 CO. 706KL08)；6.苯丙氨酸(AJIN0M0T0 CO. 702NE93)；7.供试品(批号070803桂林三金药业股份有限公司)。薄层板硅胶60预制板(Merck)。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1.5 1.5)。显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观察。展开温度t :25°C相对湿度RH 40%对该鉴别方法进行方法学验证，供试品、对照品溶液的制备同拟定标准正文，阴性 对照溶液是分别按处方比例称取除西瓜外其余辅料，按制法制成阴性样品，再按正文供试
12品溶液的方法依法制得。展开及检视条件同正文。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色 谱相应位置上均显相同颜色的斑点。经方法验证，结果薄层色谱分离效果好，斑点清晰明 显，重现性、专属性好，阴性对照无干扰，3批样品按此方法进行检验，均符合规定。故收入正 文。见图10。其中样品1.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080501，桂林三金药业股份有限公司提供)3.西瓜霜(批号080503，桂林三金药业股份有限公司提供)4. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号:111576-200201)(位置=B)苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)(位置A)5.西瓜霜(批号080805，桂林三金药业股份有限公司提供)薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500 μ m)展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :30°C相对湿度RH :72%为简化操作，实验中比较有无“在残渣及析出的结晶中加入70%乙醇20ml (分4 次，每次约5ml)，搅拌，使残渣溶解，静置，倾出上清液，合并，蒸干”的步骤，减少此步骤硫酸 钠不能完全除去，色谱图中斑点仍有少许拖尾，此方法也未采用(见图11)。其中1.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080501，未经过70%乙醇搅拌洗涤)3.苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)4. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111576-200201)5.西瓜霜(批号080503，经过70%乙醇搅拌洗涤)薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500μπι)展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :30°C相对湿度RH :72%同时还对该薄层进行耐用性试验，分别考察手工制版和普通预制版(见图12 13)、不同温度、相对湿度(见图14)、条状点样(见图15)对薄层色谱的影响，结果表明本法 重现性好，专属性强。图12氨基酸薄层鉴别色谱图(手工制版)1.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080501，桂林三金药业股份有限公司提供)3. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111576-200201)(位置B)苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)(位置A)4.西瓜霜(批号080503，桂林三金药业股份有限公司提供)5.西瓜霜(批号080805，桂林三金药业股份有限公司提供)薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500μπι)
展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :30°C相对湿度RH :72%图13氨基酸薄层鉴别色谱图(普通预制版)1.西瓜霜(批号080501，桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080503，桂林三金药业股份有限公司提供)3.苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)4. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111576-200201)5.西瓜霜(批号080805，桂林三金药业股份有限公司提供)薄层板硅胶G预制板(青岛海洋化工厂生产，批号20081211)展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :30°C相对湿度RH :72%图14氨基酸薄层鉴别色谱图(相对湿度)1.西瓜霜阴性对照(桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080501，桂林三金药业股份有限公司提供)3.西瓜霜(批号080503，桂林三金药业股份有限公司提供)4. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号:111576-200201)(位置=B)苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)(位置A)5.西瓜霜(批号080805，桂林三金药业股份有限公司提供)薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500μπι)展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :25°C相对湿度RH :72%图15氨基酸薄层鉴别色谱图(条状点样)1.西瓜霜(批号080501，桂林三金药业股份有限公司提供)2.西瓜霜(批号080503，桂林三金药业股份有限公司提供)
3. L-谷氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号:111576-200201)(位置=B)苯丙氨酸对照品(中检所提供，鉴别用，批号111615-200301)(位置A)4.西瓜霜(批号080805，桂林三金药业股份有限公司提供)薄层板以0. 3%羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G板(500μπι)展开剂正丁醇-冰醋酸-水(3 1 1)显色与检视喷以5%茚三酮乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰，日光下观
察展开温度t :30°C相对湿度RH :72%此外，发明人对西瓜霜中的含氮量进行了大量研究，内容如下
西瓜霜为葫芦科植物西瓜的成熟新鲜果实与皮硝经加工制成，为更全面地反映西 瓜霜的质量，我们拟增加一个有机成分的质量指标。成熟西瓜的水溶性成分，主要由碳水化 合物和氨基酸类成分组成，前者约占干重的80 90%，后者约占干重的10%。相对而言， 氨基酸类成分更能反映西瓜霜的质量，因为它是构建细胞、修复组织的基础材料，能促进伤 口、溃疡的愈合，与西瓜霜的功用一致。但氨基酸种类多，单一氨基酸的含量较低且波动较 大，如以其为指标，分析费用高，且因不稳定而难于应用。因此，选择“含氮量”代表氨基酸 类成分，希望作为新增含量测定内容用于西瓜霜的质量控制。按照中国药典2005年版一部附录IXL氮测定法的第一法(常量法)拟定，经方法 学考察及多批样品测定，本含量测定方法简便易行，准确可靠，具体方法学研究情况如下1、样品取样量的确定经过初步试验，西瓜霜含氮量约为0. 以上，根据氮测定法第一法(常量法)取 样要求，取样量约相当于含氮量25 30mg，经过折算，西瓜霜取样量应为20 25g。2、硫酸用量的确定由于西瓜霜的取样量相对较大，因此为了使消解作用完全，在试验中适当增加了 硫酸的用量，同时按比例相应地增加40%氢氧化钠溶液的用量，其余的试验条件和参数不 变。选用080805批样品进行考察，具体试验情况如下表1硫酸用量对比结果
权利要求
1.一种西瓜霜的质量控制方法，该方法包括西瓜霜的含量测定方法和/或鉴别方法， 其特征在于所述的含量测定方法为含氮量的测定取西瓜霜20 25g，精密称定，连同称取的滤纸置干燥的500ml凯氏烧 瓶中；然后依次加入无水硫酸钠IOg和硫酸铜粉末0. 5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸20-40ml ；在 凯氏烧瓶口放一小漏斗并使凯氏烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在 沸点以下，等泡沸停止，强热至沸腾，待溶液成澄明的绿色后，继续加热25-45分钟，放冷， 沿瓶壁缓缓加水220480ml，振摇使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液100_120ml，沿瓶壁 流至瓶底，自成一液层，照2005年版《中国药典》附录IX L第一法氮测定法测定，即得；西 瓜霜按干燥品计算，含总氮量不得少于0. 10% ；所述的鉴别方法为氨基酸的鉴别取西瓜霜l_3g，加入6mol/L盐酸溶液10_30ml，于沸水浴中加热回流 1-4小时，放冷，滤过，滤液蒸干，用50-80%乙醇20ml分次洗涤残渣及析出的结晶，搅拌，滤 过，合并滤液，蒸干，残渣用水15_40ml溶解，上强酸性阳离子交换树脂柱，用50-300ml水洗 脱，弃去水液，再用氨溶液50-200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇Iml使溶解， 作为供试品溶液，另取谷氨酸对照品和苯丙氨酸对照品适量，分别用70%乙醇溶解制成每 Iml各含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照2005年版《中国药典》附录VIB薄层色谱法试 验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、两种对照品溶液各1 μ 1，以0. 5cm宽条带状分别点于同一硅 胶G板上，以正丁醇冰醋酸水为展开剂，展开，取出，晾干，显色；供试品色谱中，在与对照品 色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于所述的含量测定方法还包括硫酸钠的含量测定取西瓜霜适量，置102°C -120°C干燥至恒重后，取0. 1-2. 0g，精密称定，加水30-750ml，振摇5_30分钟，滤过，沉淀用水50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液， 加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液，至不再生成沉淀，置水浴上加热 20-60分钟，静置1小时，用无灰滤纸或称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗 液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0. 6086相乘，即得供试样中含 有硫酸钠的重量；西瓜霜按干燥品计算，含硫酸钠不得少于90. 0%。
3.根据权利要求1-2任一项所述的质量控制方法，其特征在于所述的鉴别方法还包 括以下鉴别方法中的一种或多种a、钠盐的鉴别取钼丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色；b、硫酸盐的鉴别取供试品溶液，加氯化钡试液，即生成白色沉淀分离，沉淀在盐酸 或硝酸中均不溶解。
4.根据权利要求1-3任一项所述的质量控制方法，其特征在于所述的质量控制方法 还包括西瓜霜的检查方法，所述的检查方法为以下检查方法中的一种或多种a、重金属检查取本品l.Og，依2005年版《中国药典》附录IXE第二法检查，含重金属 不得过百万分之十；b、砷盐检查取本品0.20g，加水23ml溶解，加盐酸5ml，依2005年版《中国药典》附录 IX F第一法检查，含砷量不得过百万分之十。
5.根据权利要求1-4任一项所述的质量控制方法，其特征在于所述的含氮量的测定方法为取西瓜霜22g，精密称定，连同称取的滤纸置干燥的500ml凯氏烧瓶中；然后依次加入 无水硫酸钠IOg和硫酸铜粉末0. 5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸30ml ；在凯氏烧瓶口放一小漏斗 并使凯氏烧瓶成45°斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸停止， 强热至沸腾，俟溶液成澄明的绿色后，继续加热30分钟，放冷；沿瓶壁缓缓加水250ml，振摇 使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液lUml，沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，照2005年版 《中国药典》附录IX L第一法氮测定法测定，即得；西瓜霜按干燥品计算，含总氮量不得少于 0. 10%。
6.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于所述的硫酸钠的含量测定方法为取西瓜霜适量，置105°C干燥至恒重后，取0. 4g，精密称定，加水150ml，振摇10分钟，滤 过，沉淀用水50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液，加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热 氯化钡试液，至不再生成沉淀，置水浴上加热30分钟，静置1小时，用无灰滤纸或称定重量 的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精 密称定，与0. 6086相乘，即得供试样中含有硫酸钠的重量；西瓜霜按干燥品计算，含硫酸钠 不得少于90. 0%o
7.根据权利要求4所述的质量控制方法，其特征在于所述的检查方法为砷盐检查取西瓜霜0. 20g，加水23ml溶解，加盐酸5ml，依2005年版《中国药典》附录 IX F第一法检查，含砷量不得过百万分之十。
8.根据权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于所述的氨基酸的鉴别方法为取 西瓜霜2g，加入6mol/L盐酸溶液15ml，于沸水浴中加热回流2小时，放冷，滤过，滤液蒸干， 用70%乙醇20ml分次洗涤残渣及析出的结晶，搅拌，滤过，合并滤液，蒸干，残渣用水20ml 溶解，上732强酸性阳离子交换树脂柱，用水200ml洗脱，弃去水液，再用氨溶液IOOml洗 脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇Iml使溶解，作为供试品溶液，另取谷氨酸对照品和 苯丙氨酸对照品适量，分别用70%乙醇溶解制成每Iml各含0. 5mg的溶液，作为对照品溶 液；照2005年版《中国药典》附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5 μ 1、两种 对照品溶液各1 μ 1，以0. 5cm宽条带状分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇冰醋酸水为展开 剂，展开，取出，晾干，喷以5%茚三酮乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱 中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
9.根据权利要求1-8所述的质量控制方法，其特征在于所述的氨基酸的鉴别方法中， 薄层色谱法展开温度t为5°C -30°C，相对湿度RH为35% -80%，展开剂正丁醇冰醋酸-水 的体积比为2 1 1-4 1 1。
10.根据权利要求9所述的质量控制方法，其特征在于所述的氨基酸的鉴别方法中， 薄层色谱法展开温度t为27V，相对湿度RH为72 %，展开剂正丁醇-冰醋酸水的体积比为 3:1:1。
全文摘要
本发明公开了一种西瓜霜的质量控制方法，该方法可选包括西瓜霜的鉴别方法、检查方法及含量测定方法，所述的鉴别方法为氨基酸、钠盐及硫酸盐鉴别中的一种或多种；所述的检查为重金属检查、砷盐检查中的一种或多种；所述的含量测定包括含氮总量和硫酸钠的含量。该方法是一种原理科学、操作性强、重现性高、能够有效控制西瓜霜的质量的质量控制方法。
文档编号G01N31/00GK102125598SQ20101030022
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月12日 优先权日2010年1月12日
发明者邹节明 申请人:桂林三金药业股份有限公司