专利名称：一种牛初乳的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种牛初乳制品的制备方法，特别是牛初乳制品制备中牛初乳原料的验收、检测方法。
牛初乳和牛常乳的不同不仅在于其色、味、粘度和酸度、密度、冰点、酒精度等物理、化学现象，更重要的是在于牛初乳中所含有的免疫物质大大高于牛常乳，这是牛初乳与常乳的根本生化和细胞学的区别。在制备牛初乳制品中，如何检测和验收牛初乳的原料乳是很重要的环节。CN89105457牛初乳提炼方法专利中对原乳验收提出用常规验收和PH验收与密度验收的方法，这种验收方法存在以下缺点首先是用PH值和密度来验收原乳的方法是不科学的，因为牛在患某种体内疾病或乳腺疾病时即使不是初乳也会出现与初乳相仿的PH值和密度，其次是PH值和密度并非牛初乳内在质量的检验标准，如常乳处理不当，它的PH值和密度值同样可以和牛初乳PH值和密度重合。人们之所以要利用牛初乳是因为其内含大量丰富的营养和免疫物质，因此只有当检测到初乳中这些所需营养和免疫物质达到一定标准时，这种原料制备出的牛初乳制品才是真正有价值的。否则牛初乳产品质量就得不到保证。
牛初乳所含有细胞中以巨噬细胞量居多，近期的研究发现，它除了具有吞噬功能外还能分泌多种免疫细胞因子，参与机体免疫功能的调节和维持，因此在制备初乳产品时加强初乳原料细胞活力指标检测，对于保证初乳产品质量和有效成份功能具有重要意义，但已知技术中未见对牛初乳这方面的检测。
本发明的目的就是为了克服上述已有技术的缺点和不足之处提供一种牛初乳的检测方法，特别是对牛初乳有效细胞的检测方法。
本发明的检测方法依次为取样、常规检测和特异细胞检测，所述细胞检测包括细胞定量检测，巨噬细胞检测以及巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶(ANAE)的细胞化学方法测定，其中1细胞检测和巨噬细胞检测又包括离心脱脂，留取沉淀细胞，进行细胞计数等步骤，也可以用离心脱脂留取沉淀细胞，缓液冲洗，细胞培养、巨噬细胞贴壁分离和细胞筛选、计数等步骤，其中2巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶的细胞化学方法测定，步骤为用配制的染色剂对细胞分别作细胞染色，显示过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶(ANAE)并对其阳性细胞计数。
本发明的优点是能准确区别牛初乳与常乳，还能严格把握牛初乳制品原乳验收的质量，以保证用于制备初乳制品的原乳中有效成份的功能。
下面用实施例来进一步说明本发明方法的实施例。
实施例1取牛初乳50ml经1200rpm离心30分钟脱脂，保留沉淀细胞，用等渗液对沉淀细胞缓冲液洗两次，分离细胞，并筛选、剔除杂质，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度，加入培养皿中。放入37℃5％CO2培养箱培养30～60分钟，取出后弃悬浮细胞，加入新的培养液轻轻吹打贴壁细胞，再以1000rpm离心10分钟，涂片、染色、添加溶液作用10～40分钟，室温37℃左右，再用水液冲洗，再用染色剂复染。结果酶活性呈棕色。然后计数收集贴壁细胞，结果细胞总计数60.8±4.41×107/L，巨噬细胞数31.60±7.62×107/L。
实施例2取牛初乳50ml，经1200rpm离心30分钟脱脂，保留沉淀细胞，用等渗液对沉淀细胞缓冲液洗3～5次加入含10％小牛血清的RPM1-1640培养液调节细胞浓度，加入培养皿，放入37℃左右5％CO2培养箱培养30左右，加入新的培养液轻轻吹打贴壁细胞，再以1000rpm离心10分钟。取沉淀细胞用不同细胞计数器进行细胞计数。巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)检测。先取二氧基联苯胺10mg，加缓冲液(PH7～8)10ml，0.20％，H2O210ml，充分混合调节PH至7.2过滤待用，取牛初乳涂片、染色，滴加上述试剂作用10～40分钟(室温37℃)，然后用蒸馏水冲洗，再用甲绿复染。结果酶活性处呈棕色，过氧化酶阳性率32％。
实施例3沉淀细胞内含α-醋酸萘酯酶检测，取0.8ml，1％萘酚，溶于50％丙酮，再加40ml蒸馏水搅匀，再加入40mg坚牢蓝B盐，过滤待用。牛初乳涂片在10％福尔马林中，4％甲醛，生理盐水液中固定5分钟，用自来水冲洗5分钟晾干，放入孵育液中，在37℃下作用30～90分钟，用自来水冲洗，用2％甲绿再复染。结果阳性反应为棕墨色沉淀，在巨噬及单核细胞之胞质、胞核着非特异性的浅黄色，α-醋酸萘酯酶阳性率86％。
对牛初乳的验收检测，合格者可作牛初乳制品的原料乳，不合格者弃之或作它用，用本发明的方法检测牛初乳是产品质量保证的重要环节。
权利要求
1.一种牛初乳的检测方法，包括取样、常规检测和特异细胞检测，其特征在于所述细胞检测包括细胞定量检测、巨噬细胞的定量检测以及巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶的细胞化学方法测定。
2.根据权利要求1所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述细胞检测包括离心脱脂、留取沉淀细胞并进行细胞分离，筛选，计数。
3.根据权利要求1所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述细胞检测和巨噬细胞检测包括离心脱脂，留取细胞，配制缓冲洗液，漂洗、去除悬浮细胞和杂质，细胞培养，细胞贴壁分离和细胞计数。
4.根据权利要求1、3所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述缓冲洗液为对留取的沉淀细胞缓冲液洗1～5次。
5.根据权利要求1、3所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述细胞培养为在温度36.5℃～37.7℃的5％CO2培养箱中培养30～60分钟。
6.根据权利要求1、2所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述巨噬细胞贴壁分离为吹打贴壁细胞，并经800～1200rpm离心10～30mm。
7.根据权利要求1所述的牛初乳检测方法，其特征在于所述巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶(ANAE)的细胞的化学方法测定为用配制的染色剂，对细胞分别作细胞染色，显示过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶(ANAE)，并对其阻性细胞计数。
全文摘要
本发明涉及一种牛初乳制品制备中牛初乳原料的验收检测方法，包括取样，常规检测和特异细胞检测，所述细胞检测包括细胞定量检测，巨噬细胞检测以及巨噬细胞内含过氧化物酶(PO)和α-醋酸萘酯酶(ANAE)的细胞化学方法测定，细胞检测又包括离心脱脂留取沉淀细胞和细胞计数，以及配制缓冲液对细胞分别作细胞染色并对其阳性细胞计数。用本发明的方法检测牛初乳制品的原料乳，是产品质量保证的重要环节
文档编号G01N33/04GK1118877SQ9411216
公开日1996年3月20日 申请日期1994年5月12日 优先权日1994年5月12日
发明者徐 明, 何志英, 张德福, 顾敦瑜 申请人:上海市健生科技开发公司