专利名称：同时检测传染性微生物的抗原及抗体的方法
同时检测传染性微生物的抗原及抗体的方法本申请是申请日为2003年5月9日、申请号为03813516. 7、发明名称为“同时检 测传染性微生物的抗原及抗体的方法”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及传染性微生物特别是病毒微生物感染的体外检测，具体而言，涉及丙 型肝炎病毒(HCV)感染的体外检测。更准确地说，本发明也涉及一种方法，用于同时检测传 染性微生物特别是病毒微生物的抗原和针对该传染性微生物的抗体，还涉及实施该方法的 试剂和试剂盒。更具体而言，涉及一种同时检测HCV抗原和抗HCV抗体的方法，以及实施该 方法的试剂和试剂盒。丙型肝炎病毒感染是一种肝炎形式，最初被称为非甲非乙肝炎，是一个早就认识 到的健康问题，特别是在输血方面。1989年5月31日公布的专利申请EP 318 216描述了引起人类丙型肝炎 的病毒 (被称为HCV)的cDNA片段的克隆。也描述了编码该病毒的非结构蛋白(NS1-NS5)的5个 基因的序列(约占HCV总基因组的78% )，C100-3抗原(其含有NS3-NS4区的363个氨基 酸，与超氧化物歧化酶融合)，以及利用C100-3抗原检测抗HCV抗体的方法。这种检测抗 HCV抗体的“第一代”方法能够确定HCV是非甲非乙肝炎(现在世界上称为丙型肝炎)的一 个主要原因。然而，该方法不能检测70-80%以上的该病毒感染的血清。这种灵敏度的不足 使之不能进行感染的早期检测。Okamoto等人(1990a)和1990年9月19日公开的专利申请EP 388 232描述了 HCV病毒基因组的5’端序列，即编码导致丙型肝炎的病毒的结构蛋白(衣壳、基质、包膜) 的基因序列。Okamoto等人(1990b)发表了 HCV衣壳的氨基酸39-74序列作为靶标通过ELISA 检测抗HCV抗体的用途。Hosein等人(1991)的文章描述了一种检测抗HCV抗体的免疫测定法，它以使用结 构(衣壳在AA 1-120区中)和非结构(NS3-NS4 在AA1200-1800区中)合成肽抗原为基 础。已经证明了合成肽在抗HCV抗体检测中的优点，以及结构与非结构抗原组合的优点这 种组合可提高灵敏度，因此可以及早检测。此处所述的测定法能够早4-10周检测抗体。该 文也显示，不存在主要的优势免疫表位，例如，已知AIDS病毒同样如此。Nasoff等人(1991)指出，衣壳的大多数优势免疫反应性表位位于N端区(AA 1-40)，针对这些表位的抗体在感染后很快产生。检测抗HCV抗体的“第二代”测定法(即以同时使用非结构和结构捕获抗原为基 础的测定法)比第一代测定法有显著进步。然而，它们仍然缺乏灵敏性具体的，它们最多 检测95-98%的采自HCV感染患者的血清。因此，这种检测还不能足够早期地检测，仍然会 使感染的捐献血液在输血中不被注意地通过。实际上，为了降低输血后的危险，必须在感染 之后在出现抗体之前尽可能早地检测病毒本身的存在。感染与血清转变(即抗体出现)之 间的阶段被称为“血清学窗口期”。有多个研究团队(Garson等人(1990) ；Shieh等人(1991))提出，为了解决上述 灵敏度和早期检测问题，可通过PCR (聚合酶链反应)检测病毒RNA。该方法实际上可以极其灵敏地早期检测HCV感染，也就是说，只在接触病毒几天后，即循环抗病毒抗体增多之前 4-8周即可检测。目前，这是检测生物液体中的病毒的参考方法。然而，用于HCV的PCR方法也遇到许多困难。首先，它包括进行RNA提取、纯化，然 后将RNA逆转录为cDNA的前期步骤，病毒材料的一部分在这些前期步骤中丢失。其次，它 需要特殊、昂贵的扩增设备。另外，它也不能同时处理大量样品，并且常常产生污染。目的在于早期检测HCV感染的另外一种方法旨在检测循环病毒抗原(衣壳)。这 种抗原也在血清抗HCV抗体出现前几周出现。Takahashi等人(1992)描述了一种ELISA技 术，它利用一对抗体检测衣壳抗原。然而，这种抗原的检测难以建立，这主要是因为血液中可检测的抗原滴度低，以及 可以获得的免疫试剂的质量问题。Hajime Tokita等人(2000)描述了一种使用一对单克隆抗体(5F11和5E3)的夹 心型免疫测定法，在市场上被称为“ Immucheck F HCV Ag CoreKokusai”，它可获得极其灵敏 的检测。该文章的作者强调，衣壳蛋白中的Thr49Pro突变可降低测定的灵敏度。Peterson 等人(2000)也在研究早期检测衣壳抗原，他们建立了一种ELISA技术，该技术不需要预处 理样品即可利用抗衣壳单克隆抗体检测HCV的衣壳抗原。该文章通过比较三种独立的测定 法(PCR检测HCV RNA，ELISA检测抗HCV抗体和衣壳抗原)表明，能够有效地检测在感染早 期血清阴性阶段(即检测到RNA约1天后)采集的血袋中的循环HCV衣壳抗原。丙型肝炎病毒感染的早期检测，以及在感染持续期间检测血清转变后抗体反应的 可能性，仍然是当前的一个目标，特别是对于输血而言。根据建立简单、灵敏、特异、可重复、经济、易于进行并且能够自动化——旨在进行 大量筛选——的方法的观点，最希望首先在血清学窗口期检测HCV抗原，然后在血清转变后 追踪患者的血清学进化，联合抗HCV抗体的检测和HCV抗原的检测。然而，这就提出了一个重要问题，即对于HCV抗原的测定，血清中存在的抗HCV抗 体与标记的抗HCV抗体之间的干扰问题。因此，为了检测一种指定抗体，向固相上引入一种 靶抗原，而这种靶抗原与标记抗体或用于同时夹心法检测抗原的抗体可识别的抗原可能具 有相同的表位，这将不可恢复地使标记的一种或多种抗体与固相结合，因此使测定产生假 阳性反应。对于在同一固相上同时检测抗HCV衣壳抗体和HCV衣壳抗原的系统，尤其如此。因 此，为了检测抗HCV衣壳抗体，衣壳抗原在固相上沉积，其中这种衣壳抗原与标记的抗HCV 衣壳抗体或用于检测衣壳抗原的抗体可识别的抗原具有相同的表位，这将使标记的一种或 多种抗体与固相结合，使测定产生假阳性反应。为了避免这种干扰的危险，Chiron公司进行了检测患者的衣壳抗原以及只检测 抗NS3/NS4抗体的测定。为此，Chiron首先使用与固相附着的NS3/4a抗原来捕获待测样 品中的抗HCV抗体，然后使用同样为附着的单克隆抗HCV衣壳抗体(cll-3和cll-7)。在 过氧化物酶标记的单克隆抗体存在下，利用与SOD (超氧化物歧化酶)融合的抗原检测捕获 的抗体，而捕获的抗原利用同样以过氧化物酶标记的另外一种单克隆抗体检测(第七届国 际输血学会欧洲会议(VII European Congress of thelnternati onal Society of Blood Transfusion)巴黎，2001 年 7 月 15-18 日)。针对干扰问题，专利申请EP 1 020 727 (Advanced Life ScienceInstitute)提供了一种同时测定HCV衣壳抗原和抗HCV衣壳抗体的方法(一种“combo”型测定法)，其中该 抗原被针对衣壳表位的抗体捕获并标记，其中这些衣壳表位与同时用来捕获并显示或检测 抗衣壳抗体的衣壳表位不同。它给出了一个代表性实施例，其中在通过夹心法检测抗原、同 时通过间接法检测抗体的测定中，为了检测抗原，使用针对HCV衣壳的氨基酸(AA) 100-氨 基酸130序列的表位的第一抗体(捕获抗体)，和针对序列AA40-50的表位的第二抗体(检 测抗体)，为了检测抗体，使用的捕获抗原自身含有序列AA1-42和AA66-80。然而，该方法不是没有缺点，特别是它需要使用针对表位的抗体，而这些表位彼此 相距较远，且实际上是次要的、相对非免疫原性的表位时。由于缺乏序列A43-65，也具有无 法检测针对该序列的抗体，因而灵敏性降低的缺点。另外，它是通过 衣壳蛋白的两个区域捕获衣壳抗原及捕获抗衣壳抗体，这两个区 域明显不同，即不重叠(AA 1-42和AA 66-80，用于检测抗体，AA 100-130，用于检测抗原)， 这与本发明不同。专利申请WO 01/96875 A2 (Chiron)特别描述了一种同时检测衣壳和抗NS 3和抗 NS4抗体的测定法(一种“不完全combo”，图2)，它使用N-月桂酰肌氨酸作为去污剂。另 一方面，它在图8和第33页非常概括地提到了一种“完全combo”测定法，即一种同时检测 衣壳抗原(通过夹心法)和抗HCV衣壳和抗HCV非结构蛋白抗体(通过双抗原夹心法)的 测定法。为了捕获抗原，它使用可识别HCV衣壳N端大部分(AA 10-53)的两种抗体cll_3 和cl-7，为了检测，它使用可识别HCV衣壳C端部分(AA 120-130)的第三抗体cll_14。为 了检测抗体，使用的捕获抗原是含有多种表位的一种融合抗原(“MBFA 12”，见专利申请WO 01/96875的表2)，作为与超氧化物歧化酶、NS3、NS4和NS5抗原和几种HCV株的一系列衣壳 序列的融合含有突变R47L的AA 9-53,AA 64-88和AA67-84。序列AA 54-63和AA 54-66 在这两个系列的序列中缺失。然而，专利申请WO 01/96875 A2的“完全combo”测定法的实际实施并没有描述。 因此，本领域技术人员不可能确切地肯定图8的combo测定法是否能够起作用，更不用说它 是否能够解决所提出的问题，即，尽可能早地检测HCV感染。无论如何，在最好的情况下，专 利申请WO 01/96875 A2的combo显然也无法检测针对丢失的序列AA 54-63和AA 54-66 的所有抗体。结果是具有灵敏度降低的危险。专利申请EP 1 251 353 A2 (Ortho-Clinical Diagnostics)描述了一种“完全 combo”测定法，它使用相同的抗体检测衣壳，但是没有说明它们的来源或它们的表位特 异性。另外，它说明使用的去污剂是BRIJ或MYRJ类型的去污剂，对于Ortho Clinical Diagnostics销售的衣壳抗原检测试剂盒的N-月桂酰肌氨酸来说，这种去污剂是优选 的(参见实施例3W012])。抗衣壳抗体使用一种(通过诱变)修饰的衣壳抗原检测 C22KSN ▽ 47，48 (与SOD融合产生的蛋白质，含有缺失氨基酸47和48的衣壳序列AA 10-99)或C22KSR47L(与SOD融合产生的蛋白质，含有衣壳序列AA 10-99，在位点47处以 亮氨酸替换精氨酸)。专利申请WO 03/002 749 A2 (Abbott)描述了用于检测HCV衣壳抗原的多种抗原 和测定法。它描述的唯一的“完全combo”测定法——被称为“真正的Combo”(

图1，第59 页)利用一种生物素化肽检测抗衣壳抗体，该生物素化肽对应于衣壳的氨基酸11-28，固定 在固相中。为了检测衣壳，它使用在固相中的来自Advanced Life Science Institute的抗体Cll-14(识别衣壳序列AA 45-50)与吖啶标记的C11-10 (识别衣壳序列AA 32-36)的组合。因此，专利申请WO 03/002 749 A2通过两个明显不同的(即不重叠的)衣壳位点(AA 11-28，用于检测抗体，AA45-50，用于检测抗原)实现了衣壳抗原的捕获和抗衣壳抗体的捕 获，这与本发明不同。因此，为了解决所提出的问题，本发明的作者努力发展了另外一种方法。现在已经发现了一种同时检测HCV抗原和患者针对该抗原的抗体的方法，该方法 避免了这种干扰问题，并且达到了与PCR接近的检测灵敏度和早期检测水平，同时，能够在 血清转变后追踪患者的血清学进化。本发明的作者通过人工结构修饰使得用来捕获抗体的靶抗原的某些表位不同，解 决了这一问题。这样修饰的表位随后被破坏。同时，选择用来捕获和/或检测抗原的抗体， 使得它们精确识别患者抗原上存在的未修饰的表位，因而它们不能结合不再显示这些相同 表位的修饰的抗原。由于这些表位不再相同，因此在用来捕获和/或检测HCV抗原的抗体 与患者的抗体之间不再存在任何竞争。与现有水平的一些技术不同，衣壳抗原和抗衣壳抗 体的捕获能够在衣壳的单一的、相同的蛋白质区域上发生，而且避免漏检某些抗衣壳抗体， 如下文所述。由于已经在衣壳的N端部分鉴定了多种表位，该蛋白质区最适于获得对衣壳抗原 和抗衣壳抗体的极灵敏的检测。根据本发明，能够利用最具免疫反应性的序列同时检测抗体和抗原，从而提高检 测灵敏度。当然本发明不只限于丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的检测。也包括以下所述的 用来检测感染的方法、试剂和试剂盒和/或感染监测的概括，这种感染可以是由任何种类 的传染性微生物(例如病毒，如引起不同类型的甲、乙、丙、丁或戊型肝炎的病毒，逆转录病 毒，特别是引起人类(HIV-1、HIV-1之0组、HIV-2)或猴AIDS的逆转录病毒，巨细胞病毒 (CMV)，黄病毒，包括登革病毒，以及细菌、微生物寄生虫等)引起的，希望同时检测其抗原 和抗体。本发明在此用丙型肝炎病毒(HCV)更具体地描述，属于本领域技术人员容易理解 的极广泛的范围。定义此处的术语“丙型肝炎病毒”或“HCV”包括导致丙型肝炎的病毒的所有株和所有 类型、亚型和基因型。本发明的方法实际上旨在检测所有HCV感染，无论其来源和基因型如 何。具体包括在欧洲、美国、日本等地流行的病毒的众所周知的类型和亚型(即6种主要基 因型1、2、3、4、5、6，及其亚型 la、lb、3a等)。参见 Stuyver 等人(1994) ；Bukh(1995) 术语“人类免疫缺陷病毒”或“HIV”是指导致人类AIDS的逆转录病毒的所有株和 所有类型、亚型、群和基因型。术语HIV具体包括HIVs-I (HIV-1之M组，HIV-I之0组)和 各种HIV-2及其变体。在本发明的上下文中，“生物样品”优选地包括生物液体，如血液、血浆、血清、尿、 脑脊液、唾液等。术语“抗体”是指任何完整抗体或抗体的功能性片段，其含有或者由至少一个抗原 结合位点组成，使得该抗体能够结合抗原化合物的至少一个抗原决定簇。关于抗体片段的 例子，可以提到Fab、Fab，和F(ab，)2片段，以及scFv(单链可变片段)链、dsFv(双链可变片段)链等。这些功能片段具体地能够通过基因工程技术获得。在本发明中使用的单克隆抗体或单特异性多克隆血清通过常规技术产生，其细节 在下文给出。术语“捕获抗体”是指抗体或抗体的一部分，优选地与固相结合的抗体或抗体的一 部分，它通过亲和力结合能够滞留生物样品中存在的微生物的抗原，例如HCV或HIV的抗原。生物样品中抗体和抗原的存在通过“检测单元”显示。关于抗原的检测，本发明具 体提供利用至少一种“检测抗体”的检测。这种标记的检测抗体能够通过亲和结合与捕获 的抗原结合，通过识别与捕获抗体所识别的位点不同的表位位点或者由于衣壳中存在重复 基序而相同的表位位点。关于抗体的检测，具体地可以使用标记的抗免疫球蛋白或抗同种 型抗体，例如抗免疫球蛋白G。术语“标记的”是指直接标记(通过酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等) 和间接标记(例如通过本身直接标记的抗体，或者使用包含标记的“亲和对”的试剂，例 如， 但不是唯一地，标记的抗生物素蛋白_生物素对，等等)。术语“抗原性片段”是指一种传染性微生物的天然或重组蛋白质的全部或部分，如 丙型肝炎病毒或HIV，其在感染的患者或免疫的动物中能够诱导抗体合成。具体而言，可以 是衣壳蛋白的全部或部分，或者是HCV的非结构蛋白的全部或部分，特别是NS3和NS4，无论 它们是否是通过基因工程技术获得的。也可以是HIV的gag基因编码的蛋白质的全部或部 分，特别是P25 (HIV-I)或P26 (HIV-2)，或者是包膜基因编码的蛋白质的全部或部分，特别 是 gp41(HIV-I)或 gp36(HIV-2)。术语“捕获抗原”是指一种分离的抗原片段，其优选地与固相结合，它能够被针对 微生物的抗体(如抗HCV抗体或抗HIV抗体)识别，并且能够与后者亲和结合。术语“检测抗原”是指一种标记且修饰类似捕获抗原的抗原(即含有至少一个 已经破坏的表位位点或表位)。它使得能够通过竞争法检测捕获的抗原，或者通过常规抗 原-抗体-抗原夹心法(也被称为“双抗原夹心”法(Maiolini等人(1978))检测抗体。根据本发明，具体地在通过抗原_抗体_抗原夹心法的抗体检测中，捕获抗原和/ 或任选地使用的检测抗原含有至少一个已经破坏的表位位点或表位。“表位位点”或“表位” 是可被抗体识别的氨基酸序列，可使其特异性结合。对于HCV蛋白，已经鉴定了衣壳蛋白的几种表位。具体知道位于氨基酸16与氨基 酸40之间以及位于氨基酸44与氨基酸47之间的表位。例如，也可以参考文章或公开内 容 Okamoto 等人(1990) ；Nasoff 等人(1991) ；Leahy 等人(1991) ；Takahashi 等人(1992)； Sal Iberg等人(1992)；禾口 Ishida(1993)。本领域技术人员也知道HCV非结构蛋白的多种表位。在NS3蛋白上，已知位于氨基 酸1188与氨基酸1493之间的表位(Yang等人(1995))和位于氨基酸1175与氨基酸1334 之间的表位(Yang等人(1999))和位于氨基酸1460与氨基酸1532之间的表位(Clayes等 人(1995))。最众所周知的NS4表位之一，表位5-1-1 (AA 1689-1706)，在Cerino等人(1991) 中提及。对于HIV，现有技术中也描述了几种表位。具体包括HIV-1(M组)P25蛋白位于氨基酸293与350之间的表位，以及Gnarm等人(1987)描述的gp41的优势免疫表位，或该序 列的变体；还包括P26蛋白的表位，特别是例如带有与上述HIV-1P25的表位序列同源的序 列之表位，或者HIV-2 gp36的表位，特别是Gnarm等人(1987)描述的gp 36的优势免疫表 位，或该序列的变体。“已经破坏的”表位位点或表位的表述是指该表位位点或表位在其(一级、二级、三 级和/或四级)结构内修饰，以致含有这种破坏的表位的捕获抗原或检测抗原可能无法同 时结合针对所检测的抗原的捕获抗体和/或检测抗体，但同时能够结合生物样品中可能存 在的针对该微生物的抗体，如抗HCV或抗HIV抗体，其是通过识别保持完整的其它一些表位 位点。因此，选择捕获和/或检测抗体，以特异性识别生物样品中存在的抗原上的所述目标 表位，这些表位是“完整”形式，即“未破坏的”或“天然的”形式。在本发明的上下文中，这 种完整形式的表位也被称为与破坏的表位“同源的”表位。当指抗体与抗原特异识别或结合时，术语“特异地”是指该抗体与该抗原相互作 用，而与其它抗原没有任何实质的相互作用，或者，如果是一种表位的“特异”识别问题，是 指实际上排他性地识别该表位。大于lOlmol—1的结合常数是优选的。捕获与检测抗体本发明中使用的抗体是抗原特异的抗体，因此，是单克隆抗体或单特异性多克隆 抗体，也就是说，它们只特异性识别一种表位。单克隆抗体能够根据Kdhler和MilStein(1975)描述的常规淋巴细胞融合和杂 交瘤培养方法获得。制备单克隆抗体的其它方法也是公知的(Harlow等人(1988))。单克 隆抗体的制备可包括免疫一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔乃至人等)，利用淋巴细胞融 合技术产生杂交瘤(Kohler和Milstein，(1975))。这种常用技术也有备选的技术。例如，通过表达用杂交瘤克隆的一种核酸，能够产 生单克隆抗体。也能够用噬菌体展示技术生产抗体，方法是将抗体cDNA导入载体内，一般 是丝状噬菌体(例如，对于大肠杆菌是fUSE5，Scott等人(1990))。后者组成文库，在其表 面展示scFv片段。Marks等人(1991)描述了构建这些抗体文库的方案。多克隆抗体能够按照常用程序，从针对一种抗原免疫的动物的血清中获得，这种 抗原实际上是肽。通常，多肽，特别是重组多肽，或者寡肽，例如可以用作免疫原。根据一种常规方 案，按照Benoit等人(1982)所述的程序，用lmg当量的肽免疫原免疫兔子。以4周的间隔， 给动物注射200 y g抗原，10-14天后采血。在第三次注射后，评价抗血清与利用氯胺-T法 制备的碘放射性标记的抗原肽结合的能力。然后用羧甲基纤维素(CMC)组成的离子交换柱 通过层析纯化。然后利用本领域技术人员公知的方法，例如使用DEAE S印hadex获得IgG 级分，将洗脱收集的抗体分子调节为希望的浓度。为了提高多克隆血清的特异性，能够利用用于免疫的固定于固相中的肽(如HCV 的衣壳肽AA 16-44和AA 39-74，作为非限制性实例)，通过免疫亲和层析(或免疫吸附层 析)纯化这些抗体。抗血清与这种固定于固相中的肽接触足够长的一段时间，以使该肽与 抗体分子免疫反应，从而在固相中形成一种免疫复合物。更具体而言，本发明人使用以下表1所示的特异性抗HCV抗体。表 1 对于检测HIV的Combo测定法，使用的抗体优选地是一种单克隆抗体，它可识别下 列多肽序列之一或变异HIV株的相应序列-HIV-1M 组的 P25 蛋白的表位，序列为 308QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID No. 24)；-P26蛋白的表位，特别是与序列号SEQ ID No. 24所示HIV_1 P25的表位同源的 序列的表位，例如含有序列QTDPAVKNWMTQTLL(SEQ ID No. 25)的一种表位(HIV-2分离株 ROD)。当然，生产或获得具有与上述抗体相似或相同的表位特异性的单克隆抗体也在本 领域技术人员掌握范围之内，它们适于实施本发明。捕获和/或检测抗原本发明中使用的捕获抗原和/或检测抗原含有至少一个已经破坏的表位位点。当 使用与捕获抗原和/或检测抗原都有相互作用危险的两种不同抗体时，抗原上至少两个位 点的破坏可能是必需的。例如，对于使用与捕获抗原固定于同一表面的捕获抗体和检测抗 体的夹心型免疫测定，同样如此。然后选择捕获抗体，使其可特异性识别患者的天然抗原上 的一个表位，该表位与捕获抗原上两个破坏的表位之一同源，同时选择检测抗体，使其可特 异性识别患者的天然抗原上的一个表位，该表位与捕获抗原上两个破坏的表位中的另一个 同源。捕获抗原和/或检测抗原可以含有或者由一种肽组成，这种肽模拟来自于微生 物，特别是HCV或HIV的抗原蛋白质之表位的全部或部分。优选地是衣壳蛋白的一种肽，检测抗衣壳抗体特别有利，特别是对于慢性肝炎，在 这种情况下只可见极少的抗原，可见较多的循环抗衣壳抗体。也可以是一种非结构蛋白的 肽，如NS3和/或NS4。不同的捕获或检测抗原也能够组合在一起。该实施方案使用几种不 同的捕获和/或检测抗原，例如能够同时检测抗衣壳抗体和针对HCV的非结构蛋白NS3和 /或NS4的抗体。同时检测抗衣壳抗体和抗NS3抗体是特别优选的。本发明也包括同时检 测衣壳抗原、抗衣壳抗体、针对E1和/或E2包膜结构蛋白的抗体、E1和/或E2包膜抗原， 和/或针对HCV的非结构蛋白NS3和/或NS4的抗体。能够想象的其它一些组合也是本发 明的一部分。
同样，同时检测gag抗原、抗gag抗体和/或针对AIDS病毒(HIV-1、HIV-2等) 包膜的抗体也是本发明的一部分，其序列已经在Wain-Hobson等人(1985) ；Ratner等人 (1985) ；Sanchez-Pescador 等人(1985) ；Guyader 等人(1987)的文章中公布。优选地，将 要检测的gag抗原是HIV-1 P25蛋白或HIV-2 P26，所述抗gag抗体针对这些蛋白质。更优 选地，用于检测针对HIV-1和HIV-2包膜的抗体之包膜抗原是HIV-lgp41和HIV-2 gp36。类似地，Alcon等人(2002)描述的NS1抗原的检测，抗NS1抗体的同时检测，以及 抗登革病毒NS2、NS3和/或S4抗体的检测，也是本发明的一部分。使用的技术为本领域技术人员所公知。优选地，由于更加实用的原因，捕获和/或检测抗原是利用本领域技术人员公 知的标准技术生产的合成肽。例如，可以提到Merrifield型的合成，由于纯度、抗原特 异性和没有不希望的副产物以及易于使用等原因，它是有利的(Merrifield，(1963)； R. C. Sheppard(1971) ；Atherton 等人(1989))。可以使用来自 Millipore 的 “9050 Plus Pep合成仪”、来自Pers印tive的“Pioneer”合成仪、来自ABI的“433A”合成仪(Applied Biosystems Inc.)或来自Rainin的“Symphony”合成仪作为自动合成仪。也能够通过均相 合成获得这些肽。这些捕获和/或检测抗原上表位的破坏能够用多种方法进行。表位位点的这种修 饰需要的唯一条件是，捕获和/或检测抗原可能不结合捕获抗体和/或检测抗体，但是同时 基本上保留结合生物样品中可能存在的抗微生物抗体(具体而言，是抗HCV或抗HIV抗体) 的能力。在每个靶向表位位点中，至少一种氨基酸，优选地两种氨基酸的修饰可能足以破 坏该表位，而不会去稳定化未修饰的其它表位。具体而言，这种修饰可以通过氨基酸置换实 现，例如用甘氨酸或丙氨酸残基置换非甘氨酸残基，或者用一类氨基酸置换另一类氨基酸。 例如，能够用含有非极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸)置换含有极性侧链的氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酰 胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)，反之亦然。也能够用含有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸或 谷氨酸)置换含有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，反之亦然，或者用含有 线性侧链的氨基酸置换侧链含有环的氨基酸(例如酪氨酸或苯丙氨酸)，反之亦然。表位中 一个或多个氨基酸的缺失，或者一个或多个氨基酸的插入，特别是对于非天然氨基酸，也能 够破坏该表位。氨基酸的官能团，即具体地OH、NH2或SH基的修饰也是可能的。在本发明上下文使用的肽中，能够设想来源于所有种类的传染性微生物(例如病 毒，如引起不同类型的甲、乙、丙、丁或戊型肝炎的病毒，逆转录病毒，特别是引起AIDS的逆 转录病毒(HIV-l、HIV-2等)、CMV病毒、登革病毒，以及细菌、微生物寄生虫等)的肽，希望 同时检测其抗原和抗体。具体而言，通过非限制性的说明，具体可以提到HCV衣壳肽，更具体而言，是氨基 酸1-75、6-68和1-53的肽。这些序列对应于基因型1 (亚型la、lb、lc)的共有序列，在附 后的序列表中列出，分别被称为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 11MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YL36LPRRGPRL44GVr47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75
SEQ ID No. 26KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31ggv34yl36LPRRGPRL44GVR47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKA68SEQ ID No. 31MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGV34YL36LPRRGPRL44GVR47ATRKTS53同样，在本发明上下文中使用的肽或多肽是HIV的gag多肽或包膜多肽。具体而言，是对应于HIV-1P25蛋白的共有序列的一种肽，其序列在附后的序列表 中被称为序列号SEQ ID No. 23。SEQ ID No. 23293FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350也可以是含有HIV_lgp41的表位的一种肽，具体的是序列SEQ IDNo. 26到SEQ ID
No. 31的一种肽
SEQIDNo.26:LGLWGCSGKLIC,
SEQIDNo.27:LGIWGCSGKLIC,
SEQIDNo.28:LGLWGCSGKHIC,
SEQIDNo.29:LGMWGCSGKHIC
SEQIDNo.30:RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC
SEQIDNo.31；RILAVERYLKDQQLLGIWGSGKLICTTAVPWNAS.HIV-2的gag多肽或包膜多肽作为捕获和/或检测抗原的用途也是本发明的一部 分。具体的是gp36的多肽，其序列为如下的SEQ ID No. 32或SEQ ID No. 33 SEQ ID No. 32 :LNSWGCAFRQVC,SEQ ID No. 33 RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS.也可以是HIV-2的P26的一种多肽，例如与序列号SEQ ID No. 23所示P25蛋白的 多肽序列同源的一种多肽。用作捕获和/或检测抗原之修饰的肽或多肽也是本发明的一部分。具体地可以是 携带至少一个修饰的表位位点的衣壳肽片段。因此本发明的一个主题是来源于HCV衣壳蛋 白的一种肽或多肽，其携带至少一个完整的表位位点和至少一个破坏的表位位点，所述破 坏的表位位点不能被抗衣壳抗体识别。优选的肽具体地在氨基酸20-40组成的部分中和在 氨基酸44-47组成的部分中显示2个、3个或4个氨基酸的置换。下列突变是特别有利的和 优选的-氨基酸34、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 4，被称为“Cap 1-75 (G34-G44-G47) ” 的肽)SEQ ID No. 4 :Cap 1-75 (G34-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31ggg34yl36LPRRGPRG44Gvg47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75
120110]-氨基酸31、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 5，被称为“Cap -75(g31-g44-g47) ” 的肽)
0111]SEQ ID No. 5 :Cap 1-75(G31-G44-G47)
0112]1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqig31ggv34yl36lprrgprg44g
0113]vg47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75
0114]-氨基酸36、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No.6，被称为“Cap -75 (g36-g44-g47) ” 的肽)
0115]SEQ ID No. 6 :Cap 1-75(G36-G44-G47)
0116]1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggv34yg36lprrgprg44g
0117]vg47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75
0118]-氨基酸34、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 7，被称为“Cap 「68 (g34-g44-g47) ” 的序列)
0119]SEQ ID No. 7 :Cap 6-68(G 34-G 44-G47)
0120]6kpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggg34yl36lprrgprg44gvg47at
0121]rktsersqprgrrqpipka68
0122]-氨基酸31、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No.8，被称为“Cap 「68(g31-g44-g47) ” 的肽)
0123]SEQ ID No. 8 Cap 6-68(G31-G44-G47)
0124]6kpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqig31ggv34yl36lprrgprg44gvg47at
0125]rktsersqprgrrqpipka68
0126]-氨基酸36、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No.9，被称为“Cap 「68 (g36-g44-g47) ” 的序列)
0127]SEQ ID No. 9 :Cap 6-68(G36-G44-G47)
0128]6kpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggv34yg36lprrgprg44gvg47at
0129]rktsersqprgrrqpipkarrpegrs75
0130]-氨基酸34、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 10，被称为“Cap -53 (g 34-g44-g47) ” 的肽)
0131]SEQ ID No. 10 :Cap 1-53(G34-G44-G47)
0132]1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggg34yl36lprrgprg44g
0133]vg47atrkts53
0134]-氨基酸31、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 11，被称为“Cap -53(g31-g44-g47) ” 的肽)
0135]SEQ ID No. 11 :Cap 1-53(G31-G44-G47)
0136]1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqig31ggv34yl36lprrgprg44g
0137]vg47atrkts53
0138]-氨基酸36、44和47被置换为甘氨酸残基(序列SEQID No. 12，被称为“Cap -53 (g36-g44-g47) ” 的肽)
0139]SEQ ID No. 12 :Cap 1-53(G36-G44-G47)
0140]1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggv34yg36lprrgprg44g
VG47ATRKTS53-氨基酸45和46的缺失SEQ ID No. 13 :Cap 1-75 (G34_del (45-46))1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRL44—r47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75-骨架长度的修饰SEQ ID No. 14 :Cap 1-75 (G34_ 3 A45)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34YL36LPRRGPRL440 a45vr47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75其中0 a代表丙氨酸_通过氨基酸插入和突变，骨架长度的修饰SEQ ID No. 15 :Cap 1-75(G34-G46-G46，)1mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqiv31ggg34yl36lprrgprl44g45g46g46, r47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75-极性转化SEQ ID No. 16 :Cap 1-75 (nL29-G30-G44_G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGnL29G30V31GGV34YL36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75其中nl代表正亮氨酸-氨基酸置换SEQ ID No. 17 :Cap 1-75(G34-F35-G44-G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34F35L36LPRRGPRG44gvg47atrktsersqprgrrqpipkarrpegrs75-氨基酸置换SEQ ID No. 18 :Cap 1-75 (G34-hS35_G44_G47)1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV31GGG34hS35L36LPRRGPRG44GVG47ATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRS75其中hS代表高丝氨酸。本发明也涉及来源于HIV的gag蛋白的一种肽或多肽，其携带至少一个完整的表 位位点和至少一个破坏的表位位点，所述破坏的表位位点不能被针对相同gag蛋白的抗体 识别。更具体而言，该多肽含有HIV-1P25蛋白的一种共有序列，具体地在氨基酸293-322组 成的部分中可能显示1、2、3、4或5个氨基酸的置换。优选地，这种修饰的多肽含有HIV-l(M) P25蛋白的共有序列，其中氨基酸295、298、310和312被置换为甘氨酸残基，氨基酸316被 置换为苯丙氨酸残基293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350 (SEQ ID No. 22)当使用这些肽序列时，为了使其能够更容易地与支持体或任何目的分子结合，在 N端位点添加氨基酸C-G-G_(即Cys-Gly-Gly-)可能是有利的。就此而言，肽C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47)是特别有利的。
检测方法本发明一般提供一种体外检测生物样品中微生物感染的方法，包括同时检测生物 样品中存在的该微生物的一种抗原和针对该微生物的一种抗体，该方法包括a)使生物样品接触一种针对该微生物的捕获抗体，和来源于该微生物的一种捕获 抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)显示形成的抗原-抗体复合物，任选地使用至少一种标记的检测抗体，和/或任 选地一种标记的检测抗原，该检测抗体能够结合已经被捕获的该微生物的抗原，该检测抗 原能够结合已经被捕获的针对该微生物的抗体；其中该微生物的捕获抗原包含(或者是)该微生物的抗原性片段，其中至少一个 表位已经被破坏；该捕获和/或检测抗体可识别已经被捕获的抗原的这个完整表位。应当理解，本发明的方法不只限于使用一个抗体/抗原对。也可以用几种不同的 捕获抗体和几种不同的捕获抗原进行。具体而言，本发明因此提供一种体外检测生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的 方法，包括同时检测生物样品中存在的HCV抗原和针对该HCV抗原的抗HCV抗体，该方法包 括a)使生物样品接触抗HCV捕获抗体和HCV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)显示形成的抗原-抗体复合物，任选地使用标记的检测抗体，和/或任选地标记 的检测抗原，该检测抗体能够结合已经被捕获的HCV抗原，该检测抗原能够结合已经被捕 获的抗HCV抗体；其中该HCV捕获抗原包含(或者是)HCV的抗原性片段，其中至少一个表位被破 坏；该捕获和/或检测抗体可识别已经捕获的抗原的这个完整表位。本发明也提供一种体外检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，包 括同时检测生物样品中存在的HIV抗原和针对该HIV抗原的抗HIV抗体，该方法包括a)使生物样品接触抗HIV捕获抗体和HIV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)显示形成的抗原-抗体复合物，任选地使用标记的检测抗体，和/或任选地标记 的检测抗原，该检测抗体能够结合已经被捕获的HIV抗原，该检测抗原能够结合已经被捕 获的抗HIV抗体；其中该HIV捕获抗原包含或者是HIV的抗原性片段，其中至少一个表位被破坏；该捕获和/或检测抗体可识别已经捕获的抗原的这个完整表位。优选地，该方法允许检测HIV-1，检测HIV-2，或同时检测HIV-1或HIV-2。因此，根 据另外一种考虑，使用的HI V捕获抗原可包含(或者分别可能是)HIV-1捕获抗原、HIV-2 捕获抗原以及HIV-1和HIV-2捕获抗原，或HIV-1捕获抗原和HIV-2捕获抗原的组合。生物样品任选地可以在前期步骤中处理，或者在促使待测抗原暴露的条件下接触 捕获抗原和捕获抗体。有利的是，在检测前，优选地在接触使用的抗体前，用变性剂处理该样品。对于HCV衣壳的检测，或者HIVgag蛋白的检测，这种变性剂具体地可能包含一种或 多种非离子型去污剂，例如Nonidet P-40 (NP40)(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇，也被称 为IGEPAL CA630)，或者酸溶液。这种组合免疫测定可以根据本领域技术人员公知的多种形式进行固相或均相； 一步或两步；双夹心法(对于两种抗原和抗体检测的夹心法)；或与夹心法(用于抗原检 测)组合的间接法(用于抗体检测)，作为非限制性实例。根据一个优选实施方案，捕获抗体和捕获抗原固定于固相上。作为固相的非限制 性实例，可以使用微孔板，特别是聚苯乙烯微孔板，如丹麦Nunc公司所售。也可以使用固体 颗粒或珠；顺磁珠，如Dynal或Merck-Eurolab (法国)所售(商标为Estapor )，或者由聚 苯乙烯或聚丙烯制成的试管等。为了检测生物样品中存在的抗原，两种抗体(捕获和检测抗体)夹心类型的免疫 测定形式是特别有利的，而抗体能够用一种捕获抗原和与该抗体连接的一种标记的偶联物 显示(根据通常称为“间接形式”的形式)，例如标记的蛋白A或标记的抗免疫球蛋白或抗 同种型抗体。这些抗体也能够用一种捕获抗原和与该抗体连接的一种标记的抗原方便地检 测(根据被称为“抗原_抗体_抗原夹心法”或“双抗原夹心法”的形式)。通过竞争法检测抗原的免疫测定形式也是可能的。本领域技术人员也能够设想并 且公知其它一些免疫测定形式。根据本发明，通常选择捕获抗体和检测抗体(特别是夹心法使用的)，使得它们可 识别生物样品中存在的待检测的天然靶抗原，作为与捕获抗原上破坏的表位同源的一种完 整表位，并且使得它们不能识别捕获抗原上的破坏的表位。根据本发明，同时检测一种微生物的抗原和针对该微生物的抗体，特别是同时检 测HCV抗原和抗HCV抗体，或HIV抗原或抗HIV抗体，可以在一步中进行，即使生物样品同 时接触检测单元(具体而言，例如一种或多种检测抗体)和捕获抗体和捕获抗原。在此情 况下，用于检测抗原的免疫测定和用于检测抗体的免疫测定都优选地通过夹心法进行。此 外，检测单元，具体而言例如一种或多种检测抗体，能够在第二步加入混合物中，即在第一 种抗原-抗体复合物形成后。于是被描述为两步测定法。如上所述，捕获抗原具体地可以是HCV衣壳的一种抗原性片段，其中至少一个表 位位点已经被破坏。该捕获抗原也可含有HCV的非结构蛋白的抗原性片段，具体地但并非 唯一地是NS3或NS4，其中至少一个表位位点已经被破坏。最后，该捕获抗原也可含有衣壳 蛋白的抗原性片段(其中至少一个表位位点已经被破坏)与HCV非结构蛋白的抗原性片段 NS3或NS4(其中至少一个表位位点也已经被破坏)的组合。本领域技术人员能够设想的任 何一种变体都是本发明的一部分。根据本发明的一个优选实施方案，检测生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的方 法包括a)使该样品接触与固相结合的HCV捕获抗体和HCV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)分离固相与液相；d)使固相接触一种标记的检测抗体和一种或多种标记的抗免疫球蛋白或抗同种 型抗体，前一种抗体能够结合已经被捕获的HCV抗原，后一种抗体能够结合已经被捕获的抗HCV抗体，
用于捕获抗HCV抗体的抗原包含(或者是)HCV衣壳蛋白的抗原性片段，其中有两 个表位已经被破坏，该捕获和检测抗体都可识别已经被捕获的衣壳抗原的这些完整表位之一。根据另一个实施方案，本发明的方法可以检测HIV感染，如HIV-I或HIV-2感染。 优选地，该方法包含来源于HIV-I的捕获抗原和来源于HIV-2的捕获抗原，以便能够检测抗 HIV-I和抗HIV-2抗体。根据这一优选模式，能够使用根据本发明的方法没有区别地检测 HIV-I和/或HIV-2感染。该捕获抗原含有HIV的gag蛋白(例如HIV-1P25蛋白或HIV-2P26)的至少一个抗 原性片段，其中至少一个表位位点已经被破坏。该捕获抗原也可含有HIV的包膜蛋白(具 体地但不是唯一地，HIV-I gp41或HIV-2gp36)的抗原性片段。最后，该捕获抗原可以由 HIV-I和HIV-2的gag蛋白的抗原性片段(适当时添加的与HIV-I包膜蛋白和HIV-2包膜 蛋白的抗原性片段)的组合构成。本领域技术人员能够设想的任何变体都是本发明的一部 分。根据本发明的一个优选实施方案，检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)感染 的方法包括a)使该样品接触与固相结合的HIV捕获抗体和HIV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)分离固相与液相；d)使固相接触一种标记的检测抗体和一种或多种标记的抗免疫球蛋白或抗同种 型抗体，前一种抗体能够结合已经被捕获的HIV抗原，后一种抗体能够结合已经被捕获的 抗HIV抗体；用于捕获抗HIV抗体的抗原包含(或者是)HIV的gag蛋白的抗原性片段，其中至 少一个表位已经被破坏，该捕获和检测抗体都可以识别已经被捕获的gag抗原的这些完整表位之一。优选地，根据本发明的方法旨在检测HIV-I或HIV-2的感染，或者HIV-1和HIV-2 的感染。根据后一种选择，用于捕获抗HIV抗体的抗原是HIV-I gag蛋白的片段与HIV-2 gag蛋白的片段的组合。ELISA测定、放射免疫测定或其它任何一种检测技术，都能够用来显示形成的抗 原_抗体复合物的存在。能够利用相同类型或几种类型的标记物首先检测传染性微生物抗 原，具体的是HCV或HIV抗原，其次检测针对该传染性微生物的抗体，具体的是抗HCV或抗 HIV抗体。检测生物样品中是否存在抗原或抗体能够根据本领域技术人员公知的标准技术 定量完成，例如通过测定标记物发出的信号(颜色、发光、放射性等)。试剂盒能够提供根据本发明的方法检测生物样品中微生物(如丙型肝炎病毒(HCV)或人 类免疫缺陷病毒(HIV))感染的试剂盒和试剂，以使本发明能够以适合多种生物样品的方 式容易地实施。因此本发明的一个主题是用于检测生物样品中微生物感染的一种试剂盒，其包含
-捕获或检测抗原，其含有(或者是)一种微生物蛋白质的抗原性片段，该片段含 有至少一个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的针对该微生物的抗体的 能力；-抗体，其针对该微生物的该蛋白质的这个完整表位。本发明的另一个具体主题是用于检测生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)感染的一 种试剂盒，其包含-捕获或检测抗体，其含有(或者是)HCV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一 个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HCV抗体的能力；_针对该HCV蛋白质的这个完整表位的抗体，它优选地是用于捕获生物样品中存 在的该HCV抗原的一种抗体。本发明的另一个具体主题是用于检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)感染 的一种试剂盒，其包含-捕获或检测抗体，其含有(或者是)HIV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一 个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力；_针对该HIV蛋白质的这个完整表位的抗体，它优选地是用于捕获生物样品中存 在的该HIV抗原的一种抗体。有利地，该试剂盒可以含有几种捕获抗原和几种捕获抗体。如上所述，捕获抗体和捕获抗原可以方便地是固定于固相(如微孔板)上的形式。一种优选的试剂盒含有a)捕获抗原，其含有(或者是)HCV的蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少两个 被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HCV抗体的能力；b)捕获抗体，其针对该HCV蛋白质的所述完整表位之一；该捕获抗原和该捕获抗体固定于固相上；C1)标记的检测抗体，其针对该HCV蛋白质的所述完整表位中的另外一个；和/或C2)任选地，标记的检测抗原，其含有(或者是)HCV蛋白质的抗原性片段，该片段 含有至少两个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HCV抗体的能力；同样优选地，根据本发明的一种试剂盒含有a)捕获抗原，其含有(或者是)HIV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一个被 破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力；b)捕获抗体，其针对该HIV蛋白质的所述完整表位之一；该捕获抗原和该捕获抗体固定于固相上；C1)标记的检测抗体，其针对该HIV蛋白质的所述完整表位中的另外一个；和/或C2)任选地，标记的检测抗原，其含有(或者是)HIV蛋白质的抗原性片段，该片段 含有至少一个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力；该试剂盒还可含有一种检测生物样品中存在的并与该捕获抗原形成复合物的该 抗体的工具，例如一种标记的抗免疫球蛋白或抗同种型抗体，或一种检测抗原。该检测抗原 优选地是例如HCV或HIV蛋白质的抗原性片段，其含有至少一个被破坏的表位，而同时保留 结合生物样品中可能存在的抗体(抗HCV或抗HIV抗体)的能力。
该试剂盒也可含有去污剂，更具体而言，非离子型去污剂，如NP40 (Sigma)，或本领 域技术人员公知的任何相当的非离子型去污剂。如上所述，该捕获抗原，如检测抗原，具体地可以是HCV衣壳蛋白的片段，其中至 少一个表位已经被破坏，于是选择捕获和/或检测抗体，以识别该衣壳蛋白的这种完整的 表位位点。具体而言，本发明的一个主题是包含或者由下列成分组成的一组试剂HCV的 衣壳肽，它在至少两个不同的表位位点处突变，如肽1-75 (G34-G44-G47)，和不能识别肽 1-75 (G34-G44-G47)的一对抗体，尽管它们可以识别相应的天然HCV序列。当检测的微生物是HIV时，该捕获抗原，类似检测抗原，具体地可以是HIV gag蛋 白的片段，其中至少一个表位位点已经被破坏，于是选择捕获和/或检测抗体，以gag蛋白 的这种完整的表位位点。 具体而言，本发明的一个主题是包含或者由下列成分组成的一组试剂P25蛋白 的肽，它在至少一个不同的表位位点处突变，如序列SEQ IDNo. 22的肽，和不能识别序列SEQ ID No. 22的肽的一对抗体，尽管它们可以识别HIV-I P25蛋白的天然序列。下列附图和实施例旨在说明本发明，而非限制其范围。图例MI是一张图示，说明如在本发明之前使用的类型的一种检测方法，它用与固相 结合的捕获抗体和未修饰的捕获抗原进行检测。该图示说明患者抗体与检测抗体在结合捕 获抗原方面的竞争。里2，通过比较，是说明本发明的一个实施方案的图示。由于捕获抗原突变，它不再 能够被检测抗体识别。因此抗体检测与抗原检测之间不再存在任何干扰。实施例丙型肝炎病毒感染的检测方案Ia和Ib使用的材料抗衣壳单克隆抗体-过氧化物酶(“mAb-POD”)偶联物用过氧化物酶标记的抗衣 壳单克隆抗体mAb 2(见表1)的偶联物按照专利申请EP 0752 102所述的方法制备。该过 氧化物酶标记的mAb2抗体偶联物用第一步(下文所述)的稀释剂稀释，以便能够在本领域 技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最终获得高光密度(例如，大于1.5单位)。也使用另外一种抗衣壳单克隆抗体mAb 1(见表1)，固定于固相上(见下文)。方案Ic使用的材料:抗衣壳单克隆抗体-过氧化物酶(“mAb-POD”)偶联物用过氧化物酶标记的抗 衣壳单克隆抗体mAb 1(见表1)的偶联物按照专利申请EP 0752 102所述的方法制备。该 过氧化物酶标记的mAb 1抗体偶联物用第一步(下文所述)的稀释剂稀释，以便能够在本 领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最终获得高光密度(例如，大于1. 5单 位)。也使用另外一种抗衣壳单克隆抗体，抗衣壳单克隆抗体mAb 3 (见表1)，固定于固 相上(见下文)。方案Id的材料1)抗衣壳单克隆抗体生物素偶联物用生物素标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 5 (见表1)的偶联物按照Greg T. Hermanson于1996所述的方案制备。该生物素标记的mAb5抗体用第一步(下文所述)的稀释剂稀释，以便能够在本领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最终获得高光密度(例如，大于1. 5单位)。也使用另外一种抗衣壳单克隆抗体，抗衣壳单克隆抗体mAb 1(见表1)，固定于固 相上(见下文)。2)过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白偶联物用过氧化物酶标记的链霉抗生 物素蛋白的偶联物按照Greg T. Hermanson于1996所述的方案制备。在使用方案Id时，这 种过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白偶联物用第二步(下文所述)的稀释剂稀释，以便 能够在本领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最终获得高光密度(例如， 大于1. 5单位)。方案la、lb、Ic和Id的通用材料1) 白勺|]|才目:Maxisorp microplate, Nunc ( )。2)根据本发明的方案的第一步和第二步的稀释剂第一步的稀释剂Tris NaCl缓冲液，0. 05M，pH 6. 7，补充0. 25% NP40 ((叔辛基苯 氧基聚(氧乙烯)乙醇-IGEPAL CA 630，Sigma)。第二步的稀释剂柠檬酸缓冲液(50mM，pH 6. 7，含有20%甘油，并且含有一定稀 释度的过氧化物酶标记的抗人IgG(Fc)小鼠多克隆抗体偶联物(Jackson Immunoresearch Laboratories, USA)，以便能够在本领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最 终获得高光密度(例如，大于1. 5单位)。3)显色溶液显色溶液由下列成分组成3a)底物缓冲液柠檬酸(0. 075M)和乙酸钠(0. 1M)的溶液，ρΗ4· 0，含有0. 015% H2O2 和 4%二甲亚砜(DMSO) (PR0LAB0)，禾口3b)显色试剂在底物缓冲液中终浓度为0. 7mM的四甲基联苯胺(TMB，Sigma)。4)终止溶液IN H2SO4。方案Ia 同时检测样品(血清或血浆)中丙型肝炎病毒的衣壳抗原和抗体(抗衣 壳和抗NS3、NS4抗体)的方案该测定的原理基于检测抗原的夹心型和检测抗体的间接型免疫酶法。它基于下列步骤首先用下列成分制备一种包被溶液· HCV抗原的混合物含有序列SEQ ID No. 4的突变的肽 C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47)(衣壳)和大肠杆菌由选择自非结构区NS3 (克隆NS3. 1 =AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1 =AA 1694-1735)的克隆产生的两种重组蛋白，和 抗衣壳单克隆抗体(mAb 1)，在0. 5M Tris缓冲液，pH 7. 4中。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔(cupule)，比例为每个 凹孔110μ 1。微量滴定板在室温(18_24°C )下温育过夜。除去包被溶液后，用含有0. 1 % Tween 20的磷酸缓冲液(0. 01M, pH7. 4)洗板，然 后加入含有5%蔗糖、25%脱脂牛奶(Candia ，法国，或其它任何相当的可以作为商品获得 的脱脂牛奶)和IOmM EDTA的磷酸缓冲液(0. 01M, pH 7)饱和。
将100 u 1第一步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 2， 随后将50 yl样品(血清或血浆)，连续分配到每个凹孔中。反应培养基在37°C下温育1. 5小时。可能含有的HCV衣壳抗原与固相上的单克隆 抗体mAb 1结合，并且与过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 2结合，从而与这两种抗 体形成夹心复合物。类似地，如果存在抗HCV抗体，它们也可结合与固相附着的抗原。然后用洗涤溶液(Tris NaCl缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充0. 1% Tween 20)洗板 (3 次)。将100 iU第二步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，分配于每个 凹孔中。反应培养基在室温(18-24°C)下温育30分钟。标记的抗人IgG抗体随后与保留 在固相上的特异性抗体连接。然后用洗涤溶液(Tris NaCl缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充0. 1% Tween 20)洗板 (5次)。从而除去未结合的抗人IgG偶联物。向每个凹孔中添加100 ill显色溶液。使反应体系在室温(18_24°C )下在暗处显 色30分钟。然后将100 U 1终止溶液分配到每个凹孔中。在终止反应后，用分光光度计读取450/620nm的光密度。阈倌的定义利用 ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线(Berck 禾口 Schultz， (1986))统计学分析特异性和灵敏度数据，然后确定阈值。特异性研究涉及1000份来自健康个体的样品，灵敏度研究涉及200份来自商品组 (panel)的HCV阳性样品(具体来自血清转化开始时):BBI (Boston Biomedica Company, USA)，Impath(USA)，Serologicals(USA)，Nabi(USA)，ProMedDx(USA)。由阳性对照获得的信号，除以该试验特异的常系统数X，计算每块板的阈值。在所 述的实施例中约为0. 2800D(光密度)单位。该方案指出，与现有的一些技术不同，在本发明中，衣壳抗原和抗衣壳抗体的捕获 在衣壳的单一、相同的蛋白质区上发生捕获抗衣壳抗体的抗原区(AA 1-75)显然包括抗 原特异性区(AA 44-47)，固定的抗衣壳抗体(mab 1)通过该区捕获衣壳抗原。因此，根据本 发明，一定数量抗衣壳抗体的漏检被减少到最低，因此灵敏度提高。方案lb 同时检测样品(血清或血浆)中丙型肝炎病毒的衣壳抗原和抗体(抗NS3 和NS4抗体)的方案该测定的原理基于检测抗原的夹心型和检测抗体的间接型免疫酶法。它基于下列步骤首先用下列成分制备一种包被溶液 HCV抗原的一种混合物大肠杆菌由选择自非结构区NS3(克隆NS3. 1 :AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1 :AA 1694-1735)的克隆产生的两种重组蛋白，和 抗衣壳单克隆抗体(mAb 1)，在0. 5M Tris缓冲液，pH 7. 4中。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。以后的步骤与方案la相同。
方案lc 同时检测样品(血清或血浆)中丙型肝炎病毒的衣壳抗原和抗体(抗衣 壳和抗NS3，NS4抗体)的方案该测定的原理基于检测抗原的夹心型和检测抗体的间接型免疫酶方法。它基于下列步骤首先用下列成分制备一种包被溶液 HCV 抗原的一种混合物一种突变的肽 C-G-G-Cap 1-75 (G31-G44-G47)(衣 壳)，其含有序列SEQ ID No. 5，或突变的肽C-G-G-Capl-53 (G31-G44-G47)，其含有序列SEQ ID No. 11，或突变的肽C-G-G-Cap6-68(G31-G44-G47)，其含有序列SEQ ID No. 8和大肠杆菌 由选择非结构区 NS3(克隆 NS3. 1 :AA 1192-1492)和 NS4(克隆 5_1_1 :AA1694_1735)的克 隆产生的两种重组蛋白，和 抗衣壳单克隆抗体(mAb 3)，在0. 5M Tris缓冲液，pH 7. 4中。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。微量滴定板在室温(18_24°C )下温育过夜。除去包被溶液后，用含有0. 1 % Tween 20的磷酸缓冲液(0. 01M, pH7. 4)洗板，然 后加入含有5%蔗糖、25%脱脂牛奶(Candia ，法国，或其它任何相当的可以作为商品获得 的脱脂牛奶)和10mM EDTA的磷酸缓冲液(0. 01M, pH 7)饱和。将100 ill第一步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 1， 然后将50 u 1样品(血清或血浆)，连续分配到每个凹孔中。反应培养基在37°C下温育1. 5小时。可能含有的HCV衣壳抗原与固相上的单克隆抗体mAb 3结合，并且与过氧化物酶 标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 1结合，从而与这两种抗体形成夹心复合物。类似地，如果存 在抗HCV抗体，它们则结合与固相附着的抗原。以后的步骤与方案la相同。在此类似地注意到，在本发明中，衣壳抗原和抗衣壳抗体的捕获在衣壳的单一、 相同的蛋白质区上发生捕获抗衣壳抗体的抗原区(AA 1-75)显然包括抗原特异性区(AA 29-34)，固定的抗衣壳抗体(mab 3)通过该区捕获衣壳抗原。因此，根据本发明，一定数量 抗衣壳抗体的漏检被减少到最低，因此灵敏度提高。方案Id 同时检测样品(血清或血浆)中丙型肝炎病毒的衣壳抗原和抗体(抗衣 壳和抗NS3，NS4抗体)的方案该测定的原理基于检测抗原的夹心型和检测抗体的间接型免疫酶法。它基于下列步骤首先用下列成分制备一种包被溶液 HCV 抗原的一种混合物一种突变的肽 C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47)(衣 壳)，其含有序列SEQ ID No. 4，或一种突变的肽C-G-G-Cap 1-75 (G34-G46-G46，)，其含 有序列SEQ ID No. 15，或一种突变的肽C-G-G-Cap 1-75 (G34-0 A45)，其含有序列SEQ ID No. 14，和大肠杆菌由选择非结构区NS3(克隆NS3. 1 :AA 1192-1492)和NS4(克隆5-1-1 AA 1694-1735)的克隆产生的两种重组蛋白，和 抗衣壳单克隆抗体(mAb 1)，在0. 5M Tris缓冲液，pH 7. 4中。
然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。微量滴定板在室温(18_24°C )下温育过夜。除去包被溶液后，用含有0. 1 % Tween 20的磷酸缓冲液(0. 01M, pH7. 4)洗板，然 后加入含有5%蔗糖、25%脱脂牛奶(Candia ，法国，或其它任何相当的可以作为商品获得 的脱脂牛奶)和10mM EDTA的磷酸缓冲液(0. 01M, pH 7)饱和。将100 yl第一步的稀释剂，其含有生物素标记的抗衣壳单克隆抗体mAb 5，然后 将50 yl样品(血清或血浆)，连续分配到每个凹孔中。反应培养基在37°C下温育1. 5小时。可能含有的HCV衣壳抗原与固相上的单克隆抗体mAb 1结合，并且与生物素标记 的抗衣壳单克隆抗体mAb 5结合，从而与这两种抗体形成夹心复合物。类似地，如果存在抗HCV抗体，则它们结合与固相附着的抗原。然后用洗涤溶液(Tris, NaCl缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充0. 1% Tween 20)洗板 (3 次)。将100 U 1第二步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的抗人IgG抗体和过氧化物酶 标记的链霉抗生物素蛋白，分配到每个凹孔中。反应培养基在室温(18-24°C)下温育30分 钟。标记的抗人IgG抗体随后与保留在固相上的特异性抗体连接，过氧化物酶标记的链霉 抗生物素蛋白与保留在相同固相上的生物素化抗体mAb 5连接。以后的步骤与方案la相同。同样可以注意到，在本发明中，衣壳抗原和抗衣壳抗体的捕获在衣壳的单一、相 同的蛋白质区上发生捕获抗衣壳抗体的抗原区(AA 1-75)显然包括抗原特异性区(AA 44-47)，固定的抗衣壳抗体(mab 1)通过该区捕获衣壳抗原。因此，根据本发明，一定数量 抗衣壳抗体的漏检减少到最低，因此灵敏度提高。实施例1 血清学窗口期样品(血清或血浆)中HCV衣壳抗原的检测采自HCV感染患者，并且归类为可以作为商品获得的组(Impath，USA)，根据抗体 检测为阴性，根据核酸检测(PCR)为阳性的血清或血浆样品，按照方案la所述的方法检测。表2显示的结果与PCR获得的结果进行比较。表2 * 稀释应当指出，利用根据本发明的方法获得的结果与PCR获得的结果直接相关。因此 本发明清楚地表明，尽管没有抗体，即在血清学窗口期采集的样品中，但仍然能够检测衣壳 抗原。实施例2 :HCV抗原阴性样品(血清或血浆)中抗衣壳抗体的检测采自HCV感染患者，并且归类为内部和可以作为商品获得的组，抗体(衣壳)阳 性，抗原(衣壳)阴性的血清或血浆样品，按照方案la和lb所述的方法检测。在固相上没有肽1-75 (G34-G44-G47)(含有SEQ ID No. 4)时(方案lb)，待测样品 (衣壳特异的)未检测，而通过方案la和常规抗体检测发现为阳性(见表3)。 因此，本发明能够检测HCV感染患者的抗衣壳抗体阳性、衣壳抗原阴性的样品。实施例3 样品(血清或血浆)中衣壳抗原和抗HCV抗体的同时检测BBI (Boston Biomedica Company，USA)所售的两组血清转化样品，PHV 907和PHV 917(即两个系列的血 清或血浆，采自HCV感染后或血清转化期间的两名患者)，按照方案la检测(见表4和表 5)。
在表4和表5中，使用根据本发明的方案la观察到抗原阳性信号，它与病毒RNA 的存在(PCR检测)相关；同样，抗体和/或抗原阳性的血清转化样品获得阳性反应。这清 楚地表明，这两种检测(衣壳抗原和抗衣壳抗体)能够在同一个测定中不相干扰地同时进 行。另外，从PCR诊断的观点出发，所述的本发明尤其具有价值，因为它能够检测PCR 结果阴性和抗体阳性的样品。实施例4 多种突变肽在抗衣壳抗体检测方面的性能比较
采自HCV感染患者，并且归类为内部和可以作为商品获得的组，抗体(衣壳)阳 性、抗原(衣壳)阴性的血清或血浆样品，按照方案lc和Id所述的方法检测(见表6和表 7)。表6:方案 lc * 稀释表7:方案 Id * 稀释表6中比较的突变肽对待测样品显示极其类似的性能。另一方面，表7中肽之间的反应差别更显著。肽SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 14 不能检测某些稀释的抗衣壳样品，当检测为纯净时，相同的样品可被检测。实施例5 衣壳抗原和抗HCV抗体的同时检测对诊断的影响和血清学窗口期缩短8个可以作为商品获得的血清转化组(BBI，Boston Biomedica, US) (Impath, US)，用根据本发明的方案(被称为Combo测定)，按照方案la(使用肽 C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47)，其含有 SEQ ID No. 4)、lc(使用使用肽 C-G-G-Cap 1-75 (G31-G44-G47)，其含有 SEQ ID No. 5)和 Id (使用肽 C-G-G-Cap 1-75 (G34-G44-G47)， 其含有SEQ ID No. 4)检测。表8列出了对这些不同的血清转化检测抗原(Elisa测定)或RNA(PCR)以及检测 抗体和进行Combo(形式la、lc和Id)获得的结果。对于8个血清转化中的4个，方案la、 lc和Id能够检测第一个阳性样品，同时通过PCR检测到病毒RNA的出现。对于两种方案 la.lc和ld，对应于血清学窗口期缩短的抗原检测与抗体检测之间的平均天数为33天。表8
26 平均值=33天NT =未检测实施例6 不同技术对血清转化血清的性能和分类的比较21个可以作为商品获得的血清转化组(BBI，Boston BiomedicaCompany, USA ； Impath, USA)显示不同的特异性，用根据本发明的试验，按照方案la和lc检测，并用一系 列可以作为商品获得的试验检测，根据2002年2月美国MDA(医疗装备局Medical Devices Agency)的分类法，实际上属于最佳。这种比较考虑了该检测相对于RNA检测(PCR检测) 的延迟天数。因此，展示最小总平均值的试剂盒在早期检测方面最有效(表9)。表9 _最后一份样品未检测=任意增加3天用根据本发明的方案la、lc和Id获得的结果允许在抗体出现之前早期检测HCV 感染(对于方案la，相对于PCR平均只延迟8天，对于方案lc延迟7. 7天，对于方案Id延 迟7. 4天)。因此，在这种分类中首先进行根据本发明所述的检测，这采用三种方案(la、lc和 Id)，使用不同的抗体和突变肽对。总之，用根据本发明的方案la、lc和Id获得的结果清楚地表明，后者能够极早期 地有效检测HCV感染，其灵敏度与PCR非常接近，而同时能够在血清转化后追踪患者的血清
学进化。实施例7 三种Combo方案la、lc和Id的特异性研究对供血者的血清(来源于Etablissement Francaisdu Sang，Rungis，法国)进行 特异性研究。不同方案la、lc和Id获得的结果分别在表10、11、12中列出。表10 方案 1 表11 方案 lc 表12 方案 Id 无论是使用方案la、lc还是ld，在特异性方面都注意到有良好的表现。在本说明书中可以注意到，根据本发明的HCV Combo检测通过在衣壳的单一、相同 的蛋白质区上捕获衣壳抗原和抗衣壳抗体，令人惊讶地能够产生与PCR接近而好于现有的 一些技术的灵敏度。这个结果是令人惊讶的，因为在修饰靶衣壳肽时，本发明人考虑了漏检很大一部 分抗体的危险。实施例8 人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的检测本发明描述的方法也用来检测任何种类的传染性微生物(例如病毒，如引起不同 类型的肝炎的病毒，逆转录病毒，特别是引起人类(HIV-1、HIV-1之0组、HIV-2)或猴AIDS的逆转录病毒，巨细胞病毒(CMV)、黄病毒，包括登革病毒，以及细菌、微生物寄生虫等)引 起的感染，希望同时检测其抗原和抗体。实施例8显示本发明同时检测人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的P25 (gag)病毒抗原 和抗P25抗体的用途。方案a、b、c的通用材料1) 白勺|]|才目:Maxisorp microplate, Nunc ( )。2)第一步的稀释剂:Tris,NaCl 缓冲液，0. 05M, pH 6. 7，补充 0. 25% NP40 (IGEPAL CA 630, Sigma)。3)第二步的稀释剂:Tris, NaCl 缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充 0. 1% Tween 20。4)显色溶液显色溶液含有4a) 一种底物缓冲液柠檬酸(0. 075M)和乙酸钠(0. 1M)溶液，pH4. 0，含有 0. 015% H202 和 4%二甲亚砜(DMSO) (PR0LAB0)，禾口4b)显色试剂在底物缓冲液中终浓度为0. 7mM的四甲基联苯胺(TMB，Sigma)。5)终止溶液1N H2S04。方案a的材料抗-HIV1 P25抗体的检测突变的合成肽，其对应于下列序列SEQ ID No. 22293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350与HIV-1M的P25蛋白的共有序列相比，含有突变(G295-G298-G310-G312-F316)， 即SEQ ID No. 23293FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350过氧化物酶标记的抗人IgG(H+L)绵羊多克隆抗体偶联物(Bio-Rad)。该偶联物在 使用前用第二步的稀释剂(如上所述)稀释，以便能够在本领域技术人员公知的条件下，用 得到证明的阳性样品最终获得高光密度。方案b的材料HIV_1 P25抗原的检测抗P25单克隆抗体Pm25，它可识别HIV-1 M P25蛋白的下列序列3(I8QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID No. 24)用过氧化物酶标记的上述单克隆抗体Pm25的偶联物。该偶联物在使用前用第二 步的稀释剂(如上所述)稀释，以便能够在本领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳 性样品最终获得高光密度。方案c的材料抗P25抗体和HIV-1 P25抗原的同时(“Combo”)检测突变的合成肽，其对应于下列序列SEQ ID No. 22293FRGYVGRFYKTLRAEQAGQGVKNFMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTAC350单克隆抗体Pm25，它可识别HIV-1 M P25蛋白的下列序列
3(i8QASQEVKNWMTETLL322 (SEQ ID No. 24)过氧化物酶标记的抗人IgG(H+L)绵羊多克隆抗体偶联物(Bio-Rad)。用过氧化物酶标记的上述单克隆抗体Pm25的偶联物。上述两种免疫过氧化物酶偶联物在使用前用第二步的稀释剂(如上所述)一起稀 释，以便能够在本领域技术人员公知的条件下，用得到证明的阳性样品最终获得高光密度。方法方案a 抗-HIV-1 P25抗体的检测该测定的原理基于检测抗HIV-1 P25抗体的间接型免疫酶法。它基于下列步骤首先用含有序列SEQ ID No. 22的突变肽SEQ ID No. 22 (G295-G298-G310-G312-F316)在pH 9. 6的碳酸缓冲液中制备包被溶液。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。微量滴定板在室温(18_24°C )下温育过夜。除去包被溶液后，用含有0. 1 % Tween 20的磷酸缓冲液(0. 01M，pH7. 4)洗板，然 后加入含有5%蔗糖和25%脱脂牛奶(Candia ，法国，或其它任何相当的可以作为商品获 得的脱脂牛奶)的磷酸缓冲液(0.01M，pH 7)饱和。将80iU第一步的稀释剂，然后将20 iU样品(血清或血浆)，连续分配到每个凹 孔中。反应培养基在37°C下温育1小时。如果存在抗HIV-1 P25抗体，则它们结合与固 相附着的肽。然后用洗涤溶液(Tris, NaCl缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充0. 1% Tween 20)洗板 (3 次)。将lOOiU第二步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的抗人IgG(H+L)抗体，分配到 每个凹孔中。反应培养基在室温(18-24°C)下温育30分钟。标记的抗人IgG(H+L)抗体随 后与保留在固相上的特异性抗体连接。然后用洗涤溶液(Tris NaCl缓冲液，0. 01M, pH 7. 4，补充0. 1% Tween 20)洗板 (5次)。从而除去未结合的抗人IgG偶联物。向每个凹孔中添加100 ill显色溶液。使反应体系在室温(18_24°C )下在暗处显 色30分钟。然后将100 U 1终止溶液分配到每个凹孔中。在终止反应后，用分光光度计读取450/620nm的光密度。方案b :HIV-1 P25抗原的检测该测定的原理基于检测HIV-1 P25抗原的夹心型免疫酶法。它基于下列步骤首先用抗HIV-1 P25单克隆抗体(Pm25)在pH 9. 6的碳酸缓冲液中制备一种包被 溶液。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。以后的步骤与方案a相同，直到第二步。
对于第二步，分配100 iU第二步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的单克隆抗体 Pm25。反应培养基在室温(18-24°C)下温育30分钟。标记的单克隆抗体Pm25然后与保留 在固相上的P25抗原(如果存在的话)连接。最后的步骤与方案a相同。方案c 样品(血清或血浆)中HIV-1 P25抗原和抗HIV-1 P25抗体的同时 ("Combo")检测该测定的原理基于检测抗原的夹心型和检测抗体的间接型免疫酶法。它基于下列步骤首先用下列成分制备一种包被溶液 突变的肽 SEQ ID No. 22 (G295-G298-G310-G312-F316)，禾口 抗P25单克隆抗体(Pm25)，在碳酸缓冲液，pH 9. 6中。然后用上述溶液包被微量滴定板(Nunc，Maxisorp)的凹孔，比例为每个凹孔 110 u 1。微量滴定板在室温(18_24°C )下温育过夜。除去包被溶液后，用含有0. 1 % Tween 20的磷酸缓冲液(0. 01M，pH7. 4)洗板，然 后加入含有5%蔗糖和25%脱脂牛奶(Candia ，法国，或其它任何相当的可以作为商品获 得的脱脂牛奶)的磷酸缓冲液(0.01M，pH 7)饱和。将80iU第一步的稀释剂，然后将20 iU样品(血清或血浆)，连续分配到每个凹 孔中。反应培养基在37°C下温育1. 5小时。可能存在的P25抗原与固相上的单克隆抗体 结合。类似地，如果存在抗P25抗体，则它们结合与固相附着的抗原肽。以后的步骤与方案la相同，直到第二步。对于第二步，分配100 iU第二步的稀释剂，其含有过氧化物酶标记的单克隆抗体 Pm25和过氧化物酶标记的抗人IgG(H+L)抗体。反应培养基在室温(18_24°C )下温育30 分钟。标记的单克隆抗体Pm25然后与保留在固相上的P25抗原连接。类似地，标记的抗人 IgG(H+L)抗体随后与保留在固相上的特异性抗体连接。最后的步骤与方案a相同。结果 在此同样也可以注意到，在本发明中，HIV-1 P25抗原和抗HIV-1P25抗体的捕获 在衣壳的单一、相同的蛋白质区上发生捕获抗P25抗体的抗原区(AA293-350)显然包括抗 原特异性区(AA308-322)，固定的抗P25抗体(Pm25)通过该区捕获P25抗原。本领域技术人员例如以实施例8为基础，当然也可以容易地进行免疫检测，以同 时检测HIV-1 P25(g ag)抗原、抗HIV-1 P25抗体和针对HIV-1的gp41糖蛋白(包膜)的 抗体。为了检测抗HIV-1 gp41抗体，一个并非唯一的例子是，可以使用其本身已知的整个 天然或重组的gp41，或者含有gp41的优势免疫表位的一种肽，如JW. Gnann等人(1987)的 公开文本所述。同时检测HIV-2 P26 (ga g)抗原、抗HIV-2P26抗体和针对HIV-2的gp36糖蛋白 (包膜)的抗体的免疫测定也是本发明的一部分。为了检测P26抗原，本领域技术人员可以 使用本身已知的抗P26抗体，为了检测抗P26抗体，可以使用P26的抗原肽，例如，它能够来 源于Guyader等人(1987)发表的HIV-2序列。为了检测抗gp36抗体，一个并非唯一的例 子是，本领域技术人员可以使用其本身已知的整个天然或重组的gp36，或者含有gp36的优 势免疫表位的一种肽，如JW.Gnarm等人(1987)的公开文本所述。他们也能够容易地同时进行“HIV-l+HIV-2 Combo”免疫测定，联合检测HIV-1 P25 抗原、HIV-2P26抗原、抗HIV-1P25抗体、抗HIV-2P26抗体、抗HIV-1 gp41抗体和抗HIV-2 gp36抗体，这也是本发明的一部分。参考文献-Alcon 等人，J. of Clin. Microbiol.，2002，vol. 40 (2)，pp. 376-381-Atherton 等人(1989)固相肽合成实用手册“solid phase peptide synthesis, apractical approach，，，IRL Press, Oxford University Press, pp. 25-34-Benoit 等人(1982) PNAS USA，79，pp. 917-921-Berck et Schultz, (1986)，Arch. Pathol. Lab. Med.，10，pp.13—20-Bukh, Semin. Liver Dis. (1995) 15 :41_63-Cerino 等人(1991)，J. Immunology, Vol. 147 (8)，pp. 2692-2696-Clayes 等人(1995)，J of Medical Virology, 45, pp. 273-281-Garson 等人，(1990) Lancet, 336，PP. 878-879-Gnann, JW.，等人(1987) Science, 237 :pp. 1346-1349-Guyader 等人(I987)Nature 326, pp. 662-669-Hajime Tokita 等人(2000) J. Clin. Microbiol, Vol. 38，pp. 3450-3452-Harlow 等人(l988)ed.，抗体实验室手册"Antibodies :a Laboratory manua”-Hermanson Greg T. , (1996)Bioconjugate techniques, Academic Press, NewYork,pp.373-380 et pp.580-583
-Hosein 等人(1991) PNAS Vol. 88，May, pp. 3647-3651-Icardi 等人(2001) J. Clin. Microbiol. ,39, pp. 3110-3114-Ishida, (1993)，J. Clin. Microbiol.，Vol. 31，No. 4，pp. 936-940- Kohler et Milstein, (1975) Nature, 256, pp. 495-497-Leahy等人(1991)第三届丙型肝炎国际讨论会，Strasbourg, poster B35-Maiolini 等人，(1978) Journal of Immunological Methods，20，pp. 25—34-Marks 等人(1991) J. Mol. Biol，222，pp. 581-597-Merrifield(1963)J. Amer. Chem. Soc，85，pp. 2149-2154-Nasoff 等人(1991) PNAS Vol. 88，No. 12，pp. 5462-5466-Okamoto 等人(1990a) JapanJ. Exp. Med.，vol. 60 (3)，pp. 167-177-Okamoto 等人(1990b) JapanJ. Exp. Med.，vol. 60 (4)，pp. 223-233-Peterson 等人(2000) Vox sanguinis, Vol. 78，pp. 80-85-Ratner 等人(1985) Nature, 313，pp. 277-284- Sa丨lberg等人(1992) J. Clin. Microbiology, Vol. 30 (8)，pp. 1989-1994-Sanchez-Pescador 等人(1985) Science, 227，pp. 484-492本发明的优选实施方案如下1. 一种体外检测生物样品中微生物感染的方法，包括同时检测生物样品中存在的 该微生物的至少一种抗原和针对该微生物的一种抗体，该方法包括a)使生物样品接触针对该微生物的捕获抗体，和来源于该微生物的捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)显示形成的抗原-抗体复合物，任选地使用一种标记的检测抗体，和/或任选地 一种标记的检测抗原，该检测抗体能够结合已经被捕获的该微生物的抗原，该检测抗原能 够结合于已经被捕获的针对该微生物的抗体；其中该微生物的捕获抗原和/或标记的检测抗原包含该微生物的抗原性片段，其 中至少一个表位已经被破坏；该捕获和/或检测抗体可识别已经被捕获的抗原的该完整表位。2.如实施方案1所述的方法，其中所述微生物选自病毒、细菌和微生物寄生虫。3.如实施方案2所述的方法，其中所述微生物是丙型肝炎病毒(HCV)。4.如实施方案3所述的方法，其中所述捕获抗原含有HCV衣壳蛋白的抗原性片段， 其中至少一个表位位点已经被破坏。5.如实施方案3或4所述的方法，其中所述捕获抗原含有HCV非结构蛋白NS 3或 NS4的抗原性片段。6.如实施方案2所述的方法，其中所述微生物是人类免疫缺陷病毒(HIV)。7.如实施方案6所述的方法，其中所述HIV是HIV-1和/或HIV-2。8.如实施方案6或7所述的方法，其中所述捕获抗原含有HIV gag蛋白的抗原性 片段，其中至少一个表位位点已经被破坏。9.如实施方案7或8所述的方法，其中所述捕获抗原含有HIV的包膜蛋白的抗原 性片段。10.如实施方案3-9中任一项所述的方法，其中所述捕获抗原含有至少两个已经被破坏的不同的表位位点。11.如实施方案3-10中任一项所述的方法，其中所述捕获抗原含有被至少一个氨 基酸的置换、缺失或插入所破坏的表位位点。12.如实施方案3-11中任一项所述的方法，其中所述捕获抗体和捕获抗原固定于 固相上。13.如实施方案3-14中任一项所述的方法，其中在抗原-抗体复合物形成之后向 混合物中添加检测抗体。14.如实施方案3-15中任一项所述的方法，其中检测抗体和/或检测抗原与捕获 抗体和捕获抗原同时接触生物样品。15.如实施方案3所述的方法，其包括a)使生物样品接触与固相结合的HCV捕获抗体和HCV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)分离固相与液相；d)使固相首先接触一种标记的检测抗体，该检测抗体能够结合已经被捕获的HCV 抗原，然后使固相接触一种标记的抗免疫球蛋白或抗同种型抗体或标记的检测抗原，其能 够结合已经被捕获的抗HCV抗体，用于捕获的抗原和用于检测抗HCV抗体的抗原包含HCV衣壳蛋白的抗原性片段， 其中有两个表位已经被破坏，该捕获和检测抗体各个可识别已经被捕获的衣壳抗原的这些完整表位之一。16.如实施方案15所述的方法，其中捕获抗体和检测抗体各个可识别具有选自下 列序列的表位44LGVR47 (SEQ ID No. 19)、30IVGGVYL36 (SEQ ID No. 20)和 29QIVGGV34 (SEQ ID No. 21)。17.如实施方案6或7所述的检测方法，其包括a)使该样品接触与固相结合的HIV捕获抗体和HIV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)分离固相与液相；d)使固相接触一种标记的检测抗体和一种或多种标记的抗免疫球蛋白或抗同种 型抗体，前一种抗体能够结合已经被捕获的HIV抗原，后一种抗体能够结合已经被捕获的 抗HIV抗体；用于捕获抗HIV抗体的抗原包含HIV gag蛋白的抗原性片段，其中至少一个表位 已经被破坏，该捕获和检测抗体各个可以识别已经被捕获的衣壳抗原的这些完整表位之一。18.如实施方案19所述的方法，其中捕获抗体和检测抗体各个可识别序列 QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID No. 24)的表位。19.如实施方案15-18中任一项所述的方法，其中在至少一种非离子型去污剂的 存在下，生物样品接触与固相结合的所述捕获抗体和所述捕获抗原。20.如实施方案19所述的方法，其中所述非离子型去污剂是NP40。21. 一种用于检测生物样品中微生物感染的试剂盒，其含有-一种捕获或检测抗原，其含有一种微生物的蛋白质之抗原性片段，该片段含有
35至少一个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的针对该微生物的抗体的能 力；-一种抗体，其针对该微生物的该蛋白质的这个完整表位。22.如实施方案21所述的试剂盒，所述微生物是丙型肝炎病毒(HCV)。23.如实施方案22所述的试剂盒，其中所述抗体是一种用于捕获生物样品中存在 的HCV抗原的抗体。24.如实施方案22和23之一所述的试剂盒，其中所述抗体可识别具有选自下列序 列的表位44LGVR47(SEQ ID No. 19)、3CIIVGGVYL36 (SEQID No. 20)、29QIVGGV34 (SEQ ID No. 21)。25.如实施方案21所述的试剂盒，其中所述微生物是人类免疫缺陷病毒(HIV)。26.如实施方案25所述的试剂盒，其中所述HIV是HIV-1和/或HIV-2。27.如实施方案25和26之一所述的试剂盒，其中所述抗体是一种用于捕获生物样 品中存在的HIV抗原的抗体。28.如实施方案25-27中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体可识别序列 QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID No. 24)的表位。29.如实施方案22-24中任一项所述的试剂盒，除了捕获抗原之外，它还含有用于 检测生物样品中存在的并与该捕获抗原形成复合物的抗HCV抗体的工具。30.如实施方案25-28中任一项所述的试剂盒，除了捕获抗原之外，它还含有用于 检测生物样品中存在的并与该捕获抗原形成复合物的抗HIV抗体的工具。31.如实施方案28或29所述的试剂盒，其中所述检测工具是标记的抗免疫球蛋白 或抗同种型抗体。32.如实施方案23、24、29和31之一所述的试剂盒，其中捕获抗体和捕获抗原以固 定于固相上的形式存在。33.如实施方案32所述的试剂盒，其含有a)捕获抗原，其含有HCV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少两个被破坏的表 位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HCV抗体的能力；b)捕获抗体，其针对该HCV蛋白质的所述完整表位之一；该捕获抗原和该捕获抗 体固定于固相上；和Cl)标记的检测抗体，其针对该HCV蛋白质的所述完整表位中的另外一个；和/或c2)任选的标记的检测抗原，它是HCV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一个 被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HCV抗体的能力。34.如实施方案33所述的试剂盒，其中标记的检测抗原是HCV衣壳蛋白的片段，该 片段的至少一个表位位点已经被破坏。35.如实施方案22_24、29和31_33之一所述的试剂盒，其中所述捕获抗原含有 HCV衣壳蛋白的一个片段，该片段的至少一个表位位点已经被破坏，所述抗体可识别衣壳蛋 白的这个完整的表位位点。36.如实施方案31所述的试剂盒，其含有a)捕获抗原，其含有HIV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一个被破坏的表 位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力；b)捕获抗体，其针对该HIV蛋白质的所述完整表位之一；
该捕获抗原和该捕获抗体被固定于固相上；Cl)标记的检测抗体，其针对该HIV蛋白质的所述完整表位中的另外一个；和/或c2)任选的标记的检测抗原，它是HIV蛋白质的抗原性片段，该片段含有至少一个 被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力。37.如实施方案36所述的试剂盒，其中所述捕获抗原含有HIV gag蛋白的抗原性 片段，其中至少一个表位位点已经被破坏。38.如实施方案25-28、30-32和36之一所述的试剂盒，其中所述捕获抗原含有HIV gag蛋白的一个片段，该片段的至少一个表位位点已经被破坏，该抗体可识别gag蛋白的这 个完整的表位位点。39.如实施方案23-38之一所述的试剂盒，它还含有至少一种非离子型去污剂。40.如实施方案39所述的试剂盒，其中所述非离子型去污剂是NP40。41. 一种来源于HCV衣壳蛋白的肽或多肽，其携带至少一个完整的表位位点和至 少一个被破坏的表位位点，这个被破坏的表位位点因此不能被抗衣壳抗体识别。42.如实施方案41所述的肽或多肽，其含有序列SEQ ID No. 4至SEQ ID No. 18中 的任意一个。43. 一种来源于HIV gag蛋白的肽或多肽，其携带至少一个完整的表位位点和至 少一个被破坏的表位位点，这个被破坏的表位位点因此不能被抗gag蛋白抗体识别。44.如实施方案43所述的肽或多肽，其含有序列SEQ ID No. 22。序列表<110>BI0RAD PASTEUR<120>同时检测传染性微生物的抗原及抗体的方法<130>BET 03P0457<150>FR 0205808<151>2002-05-10<160>33<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>1Met Ser Thr Asn Pro15Arg Arg Pro Gin Asp20Gly Val Tyr Leu Leu35Thr Arg Lys Thr Ser50
Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
1015
Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly
2530
Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
4045
Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro 5560lie Pro Lys Ala Arg 65 <210>2 <211>63 <212>PRT
<213>丙型肝炎病毒 <400>2
Arg Pro 70
Glu Gly Arg
Ser 75LysProGinArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGinAsp
151015
ValLysPheProGlyGlyGlyGinlieValGlyGlyValTyrLeuLeu
202530
ProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSer
354045
GluArgSerGinProArgGlyArgArgGinProlieProLysAla
50
<210>3
<211>53
<212>PRT
<213>丙型肝炎病; <400>3
Met Ser Thr Asn 1
Arg Arg Pro
55
60
Gly Val
Gin 20 Leu
Pro 5
Asp
Tyr 35
Lys Thr Ser
Lys Pro Val Lys Leu Pro Arg
Gin Arg Phe
Arg 40
Pro
25
Gly
Thr Gly Pro Arg
Lys 10 Gly
Lys Gly Leu
Arg
Gin
Gly 45
Asn Thr 15 Val
lie
30
Val
Asn Gly Arg Ala
Thr Arg 50
<210>4
<211>75
<212>PRT
<213>丙型肝炎病
<400>4MetSerThrAsnProLysProGinArgLysThrLysArgAsnThrAsn
151015
ArgArgProGinAspValLysPheProGlyGlyGlyGinlieValGly
202530
GlyGlyTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgGlyGlyValGlyAla
35
40
45
Lys Pro GinArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGinAsp0677]1510150678]Val Lys PheProGlyGlyGlyGinlieValGlyGlyGlyTyrLeuLeu0679]2025300680]Pro Arg ArgGlyProArgGlyGlyValGlyAlaThrArgLysThrSer0681]3540450682]Glu Arg SerGinProArgGlyArgArgGinProlieProLysAla0683]5055600684]<210>80685]<211>630686]<212>PRT0687]<213>丙型肝炎病毒0688]<400>80689]Lys Pro GinArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGinAsp0690]1510150691]Val Lys PheProGlyGlyGlyGinlieGlyGlyGlyValTyrLeuLeu0692]2025300693]Pro Arg ArgGlyProArgGlyGlyValGlyAlaThrArgLysThrSer0694]3540450695]Glu Arg SerGinProArgGlyArgArgGinProlieProLysAla0696]5055600697]<210>90698]<211>700699]<212>PRT0700]<213>丙型肝炎病毒0701]<400>90702]Lys Pro GinArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGinAsp0703]1510150704]Val Lys PheProGlyGlyGlyGinlieValGlyGlyValTyrGlyLeu0705]2025300706]Pro Arg ArgGlyProArgGlyGlyValGlyAlaThrArgLysThrSer0707]3540450708]Glu Arg SerGinProArgGlyArgArgGinProlieProLysAlaArg0709]5055600710]Arg Pro GluGlyArgSer0711]65700712]<210>100713]<211>530714]<212>PRT
40
<213>丙型肝炎病毒<400>10Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser50<210>11<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>11Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Gly Gly202530Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser50<210>12<211>53<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>12Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Val Tyr Gly Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala3540 45Thr Arg Lys Thr Ser50<210>13<211>73<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒<400>13 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Arg Ala Thr Arg354045Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro lie Pro505560Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser6570<210>14<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220><221>M0D_RES<222>(45). . (45)<223>bAla<400>14Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Ala Val Arg Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro505560lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser657075<210>15<211>76<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>15Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly
202530Gly Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Gly Gly Arg354045Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln505560Pro lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser657075<210>16<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220><221>M0D_RES<222>(29). . (29)<223>Nle<400>16Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Leu Gly Val Gly202530Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro505560lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser657075<210>17<211>75<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>17Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Gly Phe Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro5055 60
lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser657075<210>18<211>75
<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220><221>MISC_FEATURE<222>(35). . (35)<223>高丝氨酸<400>18Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn151015Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln lie Val Gly202530Gly Gly Ser Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Gly Gly Val Gly Ala354045Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro505560lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ser657075<210>19<211 >4<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>19Leu Gly Val Arg1<210>20<211>7<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>20lie Val Gly Gly Val Tyr Leu15<210>21<211>6<212>PRT<213>丙型肝炎病毒
<400>21Gln lie Val Gly Gly Val15<210>22<211>58<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>22 Phe Arg Gly Tyr Val Gly Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln151015Ala Gly Gln Gly Val Lys Asn Phe Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln202530Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr lie Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala354045Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys5055<210>23<211>58<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>23Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln151015Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln202530Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr lie Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala354045Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys5055<210>24<211>15<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>24Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu151015<210>25<211>15<212>PRT
<213>II型人免疫缺陷病毒<400>25Gln Thr Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu151015<210>26<211>12<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>26Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys1510<210>27<211>12<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>27Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys1510<210>28<211>12<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>29Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys His lie Cys1510<210>29<211>12<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>29Leu Gly Met Trp Gly Cys Ser Gly Lys His lie Cys1510<210>30<211>26<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>30Arg lie Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly151015
lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys2025<210>31<211>34<212>PRT<213>I型人免疫缺陷病毒<400>31Arg lie Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly151015lie Trp Gly Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn202530Ala Ser<210>32<211>12<212>PRT<213>II型人免疫缺陷病毒<400>32Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys1510<210>33<211>36<212>PRT<213>II型人免疫缺陷病毒<400>33Arg Val Thr Ala lie Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn151015Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp202530Val Asn Asp Ser3权利要求
一种体外检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，包括同时检测生物样品中存在的所述HIV的至少一种抗原和针对所述HIV的至少一种抗体，该方法包括a)使生物样品接触针对所述HIV的捕获抗体，和来源于所述HIV的捕获抗原；b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育该混合物；c)显示形成的抗原-抗体复合物，任选地通过使用经标记的检测抗体，和/或任选地还通过使用经标记的检测抗原，所述经标记的检测抗体能够结合已被捕获的所述HIV的抗原，所述经标记的检测抗原能够结合已被捕获的抗HIV抗体，其中所述HIV的捕获抗原和/或经标记的检测抗原包含所述HIV的抗原性片段，在该抗原性片段中至少一个表位已经被破坏；并且其中捕获抗体和/或检测抗体识别已被捕获的抗原的完整的所述至少一种表位；d)捕获抗体/抗原复合物的存在和抗体/捕获抗原复合物的存在表明具有HIV感染。
2.权利要求1的方法，其中HIV为HIV-1和/或HIV-2。
3.权利要求1或2的方法，其中捕获抗原包含HIV的gag蛋白的抗原性片段，在该抗原 性片段中至少一个表位位点已经被破坏。
4.权利要求1或2的方法，其中捕获抗原包含HIV的包膜蛋白的抗原性片段。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中捕获抗原包含至少两个不同的已经被破坏的 表位位点。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中捕获抗原包含通过至少一个氨基酸的置换、缺 失或插入而被破坏的表位位点。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述捕获抗体和所述捕获抗原固定于固相上。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中在抗原-抗体复合物形成之后向混合物中添 加检测抗体。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中检测抗体和/或检测抗原与捕获抗体和捕获 抗原同时接触生物样品。
10.权利要求1至9中任一项的检测方法，所述方法包括a)使该样品接触与固相结合的HIV捕获抗体和HIV捕获抗原；b)在允许形成抗原_抗体复合物的条件下温育该混合物；c)分离固相与液相；d)使固相接触经标记的检测抗体和一种或多种经标记的抗免疫球蛋白或抗同种型抗 体，所述经标记的检测抗体能够结合已被捕获的HIV抗原，所述经标记的抗免疫球蛋白或 抗同种型抗体能够结合已被捕获的抗HIV抗体，用于捕获抗HIV抗体的抗原包含HIV gag蛋白的抗原性片段，在该抗原性片段中至少 一个表位已经被破坏，并且捕获抗体和检测抗体各个识别已被捕获的衣壳抗原的完整的所述至少一种表位。
11.权利要求10的方法，其中捕获抗体和检测抗体各个识别序列 QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID NO 24)的表位。
12.权利要求10或11的方法，其中在至少一种非离子型去污剂的存在下，使生物样品 接触与固相结合的所述捕获抗体和所述捕获抗原。
13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述非离子型去污剂是NP40。
14.用于检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的试剂盒，其包含-捕获抗原或检测抗原，其包含HIV蛋白质的抗原性片段，所述片段含有至少一个被破 坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力； _捕获抗体或检测抗体，其针对所述HIV蛋白质的完整的所述表位。
15.权利要求14的试剂盒，其中HIV为HIV-1和/或HIV-2。
16.权利要求14或15的试剂盒，其中所述抗体为用于捕获生物样品中存在的HIV抗原 的抗体。
17.权利要求14至16中任一项的试剂盒，其中所述抗体识别序列 QASQEVKNWMTETLL (SEQ ID NO 24)的表位。
18.权利要求14至17中任一项的试剂盒，除了捕获抗原之外，所述试剂盒还包含用于 检测生物样品中存在的并与所述捕获抗原形成复合物的所述抗HIV抗体的工具。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述检测工具是经标记的抗免疫球蛋白或抗同种型抗体。
20.权利要求14至19中任一项的试剂盒，其中捕获抗体和捕获抗原以固定于固相上的 形式存在。
21.权利要求14至20中任一项的试剂盒，其包含a)捕获抗原，其包含HIV蛋白质的抗原性片段，所述片段含有至少一个被破坏的表位， 而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力；b)捕获抗体，其针对所述HIV蛋白质的完整的所述表位之一； 所述捕获抗原和所述捕获抗体固定于固相上；cl)经标记的检测抗体，其针对所述HIV蛋白质的完整的所述表位中的另外一个； c2)和/或任选地，经标记的检测抗原，其是HIV蛋白质的抗原性片段，所述片段含有至 少一个被破坏的表位，而同时保留结合生物样品中可能存在的抗HIV抗体的能力。
22.权利要求21的试剂盒，其中捕获抗原包含HIVgag蛋白的抗原性片段，在该抗原性 片段中至少一个表位位点已经被破坏。
23.权利要求14至22中任一项的试剂盒，其中捕获抗原包含HIVgag蛋白的片段，所述 片段的至少一个表位位点已经被破坏；并且所述抗体识别该gag蛋白的完整的所述表位位 点o
24.权利要求14至23中任一项的试剂盒，其还包含至少一种非离子型去污剂。
25.权利要求14至24中任一项的试剂盒，其中所述非离子型去污剂是NP40。
26.来源于HIVgag蛋白的肽或多肽，其携带至少一个完整的表位位点和至少一个被 破坏的表位位点，所述被破坏的表位位点因此变得不能被抗gag蛋白抗体识别。
27.权利要求26的肽或多肽，其包含序列SEQID NO :22。
全文摘要
本发明涉及一种体外检测方法，其通过同时检测微生物(如丙型肝炎病毒)的抗原和针对这同一种抗原的抗体，体外检测生物样品中该微生物的感染，还涉及实施该方法的试剂和试剂盒。
文档编号G01N33/569GK101858911SQ20101010415
公开日2010年10月13日 申请日期2003年5月9日 优先权日2002年5月10日
发明者F·里厄尼耶, M·费萨盖, N·朗贝尔, S·昂利奥 申请人:比奥-拉德 巴斯德公司