专利名称：三七茎叶花提取物的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种植物原料药材的质量控制方法。
背景技术：
五加科植物三七的拉丁名为Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen。传统上三七的地上部分，茎、叶和花不是主要的药用部份，若不能有效利用，就会被大量丢弃。三七的地上部分，茎、叶和花的提取物现在已经是作为制药行业中的原料药使用，它是利用三七的地上部份经水、醇提取精制而得，具有清热，凉血，平肝，潜阳的功效，用于由血热引起的疮疖；由肝热引起的心悸、烦躁、眩晕、头痛、失眠等。自上市以来获得了广大患者的好评。但是，原产品的质量标准中没有一种专属性强的鉴别方法和对有效成份的定量控制的措施。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种专属性强的、能对有效成份进行定量控制的三七茎叶花提取物的质量控制方法。
本发明所述的质量控制方法是以人参皂苷Rb3为主要控制指标的三七地上部份——茎、叶、花的提取物的鉴定方法以及以人参皂苷Rb3为主要量化指标的三七地上部份——茎、叶、花的提取物的量化的产品质量控制方法。
本发明所述的三七茎叶花提取物的质量控制方法由以下步骤组成(一)、鉴别取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3任意一种或几种做为对照品，加溶剂制成每1ml各含0.1-5mg的溶液，制成对照品溶液；吸取供试品溶液和三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3对照溶液任意一种或几种各0.1-10μl，点于同一硅胶薄层板上，以展开液展开，取出，晾干，喷以显色剂，显色；在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点；(二)、含量测定色谱条件与系统适用性试验 使用反相硅胶为填充剂，乙腈和水的比例为15-60∶40-85；
精密称取人参皂甙Rb3对照品适量，加色谱甲醇制成每1ml含0.1-10mg的对照品溶液；制备供试品溶液；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述的三七茎叶花提取物为三七茎叶花的水提取或醇提物。
上述步骤(一)、(二)中供试品的制备方法为取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取0.2-25克，置具塞锥形瓶中；精密加溶剂1-200ml，密塞，称定重量，提取，再称重，用溶剂补足减失重量，滤过；精密吸取续滤液1-200ml，回收溶剂至干，残渣用定量的溶剂溶解后再进行萃取；回收萃取溶剂至干，用溶剂溶解并转移至容量瓶中，加溶剂稀释至刻度即得。
更具体的供试品的制备方法为取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取1-10克，置具塞锥形瓶中；精密加甲醇3-60ml，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称重，用甲醇补足减失重量，滤过；精密吸取续滤液1.5-30ml，回收溶剂至干，残渣用水1.5-30ml溶解后用1-20ml乙醚萃取1次，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇萃取1-4次，萃取体积为水液体的0.5至1倍，合并正丁醇溶液，用氨试液1-10ml洗涤，弃去氨试液，再用水洗涤两次，每次1-10ml；回收正丁醇溶剂至干，用甲醇溶解并转移至容量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得。
更具体地说，上述步骤(一)所述的鉴别是用下述方法完成取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3任意一种做为对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-3mg的溶液，制成对照品溶液；吸取供试品溶液和三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3对照溶液任意一种或几种各1-6μl，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水65∶35∶10下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100-110℃下烘约5分钟，置可见光下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点。
由于三七茎、叶、花皂苷中含量最高的是人参皂苷Rb3，所以最优选的对照品为人参皂苷Rb3。
在上述步骤(二)含量测定中，所述的反相硅胶为C18、C8、CN、辛烷基硅烷键合硅胶，并以辛烷基硅烷键合硅胶为最佳，乙腈和水的优选比例为32∶68；所述的对照品溶液的制备中加色谱甲醇制成每1ml含1mg的溶液为最佳。
更具体的说，本发明的目的通过下述技术方案予以实现一、[鉴别] 取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3任意一种做为对照品，加甲醇制成每1ml各含2.5mg的溶液，制成对照品溶液。由于三七茎叶花中皂苷最高的是人参皂苷Rb3，所以最优选的对照品为人参皂苷Rb3，也可以三七茎、叶、花皂苷作为对照品；照薄层色谱法试验，吸取“含量测定”项下供试品溶液以及所述对照溶液一种或任意几种各4μl，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃下烘约5分钟，置可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点。
二、[含量测定]照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈和水的比例为32∶68。
对照品溶液的制备 精密称取人参皂甙Rb3对照品适量，加色谱甲醇制成每1ml含1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取8克，置具塞锥形瓶中。精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称重，用甲醇补足减失重量，滤过。精密吸取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣用水25ml溶解后用10ml乙醚萃取1次，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇萃取4次(10，10，5，5ml)，合并正丁醇溶液，用氨试液5ml洗涤，弃去氨试液，再用水洗涤两次，每次5ml。回收正丁醇溶剂至干，用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
每克所含人参皂甙Rb3不得少于0.80g；或折算成每日服用量不低于24mg。
本发明所述提取物具有清热、凉血、消炎、平肝的作用，常饮可以预防、减轻和治疗由血热引起的痤疮、肝热所致高血压眩晕、头痛、心悸、失眠、恶心等症。
本发明是基于这样一种发现提出的三七地上部份——茎、叶、花的提取物主要有效成份为原人参萜二醇类化合物，例如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3，其中人参皂苷Rb3的含量最高，其次是人参皂苷Rb1，此类化合物具有中枢镇静作用，而原人参萜三醇类化合物，如人参皂苷Rg1，含量极少，此类化合物具有中枢兴奋作用。三七的根以及人参的根、茎、叶与三七地上部份-茎、叶、花的的皂苷成份刚好相反，富含原人参萜三醇类化合物，如人参皂苷Rg1，而原人参萜二醇类化合物含量低。利用这种差别可以实现三七地上部份——茎、叶、花的提取物的鉴别与定量质量控制。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1、变废为宝，云南是三七产区，每年丢弃的三七地上部份数以吨计，难以利用；2、有利于药材鉴别，区分三七地上部份-茎、叶、花与三七根和人参的茎、叶；3、人参皂苷Rb3本身即是三七地上部份-茎、叶、花提取物的主要活性成份，因此以它做为含量测定的标准非常必要；4、目前三七花和茎、叶药材标准中均未规定人参皂苷Rb3的限量标准。通过定量测定含量最高的人参皂苷Rb3的含量，完善了质量标准，有利于保证不同产地、批次的原料生产出疗效一致的药品。
具体实施例方式
实施例1、鉴别色谱条件氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)下层液和正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)上层液两个系统均可使用。
取三七叶和三七花药材，按供试品溶液制备方法操作，制成三七茎叶和三七花药材溶液，同时还使用人参茎叶皂苷和三七总皂苷对照品与成药薄层色谱进行了比较。图谱结果为三七花与三七茎叶药材色谱相差不大，但三七总皂苷与人参茎叶皂苷中的人参皂苷Rb3含量较低，薄层色谱差异明显。表明该方法准确可靠，专属性强。
2、含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈和水的比例为32∶68。
对照品溶液的制备 精密称取人参皂甙Rb3对照品适量，加色谱甲醇制成每1ml含1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取8克，置具塞锥形瓶中。精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称重，用甲醇补足减失重量，滤过。精密吸取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣用水25ml溶解后用10ml乙醚萃取1次，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇萃取4次(10，10，5，5ml)，合并正丁醇溶液，用氨试液5ml洗涤，弃去氨试液，再用水洗涤两次，每次5ml。回收正丁醇溶剂至干，用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.1提取方法的选择比较了水溶解后直接萃取与醇如甲醇超声30分钟、45分钟、60分钟等不同提取方法，结果均无明显差别，但水溶解直接萃取的样品杂质较多，故选择甲醇超声提取30分钟为样品提取条件。
2.2萃取溶剂及其样品处理在实验中采用乙醚除去脂溶性成分，再采用正丁醇萃取后氨试液洗涤除去杂质。在除杂质效果上我们也曾尝试了氧化铝纯化等方法，最后发现氨试液洗涤效果较好，同时操作也较为简便。
2.3色谱测定条件在实验时对色谱柱种类进行了考察。C18柱分离的人参皂苷Rb3色谱峰对称性较差。使用C8柱可明显提高色谱峰的对称性，保证样品的分离度。
2.4系统适用性试验理论板数和分离度根据样品的HPLC图谱，以人参皂苷Rb3色谱峰计算理论板数大于6000，人参皂苷Rb3色谱峰与其相邻的成份峰的分离度均大于2。
2.5线性关系考察精密称取人参皂苷Rb3对照品5.32mg，置5ml置瓶中，加色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(1.064mg/ml)。分别精密吸取对照品溶液2，5，10，15，25ul，注入液相色谱仪，测定人参皂苷Rb3峰面积值。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标作图得一直线。
回归方程y＝193354.72x+27860.25 相关系数r＝0.9998结果表明人参皂苷Rb3的进样量在2.13-26.6ug范围内线性关系良好。数据见表1。
表1 人参皂苷Rb3线性关系考察结果

2.6仪器精密度试验取供试品溶液(20031105批)，依法测定人参皂苷Rb3峰面积，重复进样5次，计算RSD％。结果见表2。
表2 精密度试验结果

2.7稳定性试验取供试品溶液(20031105批)，分别于0，1，3，5，12h时各依法测定一次，测定峰面积值，结果表明供试品溶液在12小时内稳定。结果见表3。
表3 三七茎、叶和花含量测定稳定件试验结果

2.8重复性试验取同一批号样品(20031105批)，照正文[含量测定]项下方法重复测定5次，结果见表4。
表4 三七茎、叶和花含量测定重复性试验结果(n＝5)

2.9加样回收试验分别精密称取已测知含量的样品(20031105批)4g，置具塞锥形瓶中。精密加甲醇50ml，密塞，稳定重量，超扔提取30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，滤过。精密吸取续滤液25ml，精密加入人参皂苷Rb3对照品溶液(1.5mg/ml)1.5ml，回收甲醇至干，以下按供试品溶液制备方法从“回收溶剂至干，残渣用水25ml溶解后用10ml乙醚萃取1次，……”起，同方法担任。试验重复5次，并计算回收率。结果见表5。
表5 三七茎、叶和花含量测定加样回收试验结果

2.10样品测定照正文[含量测定]项下方法实测3批三七茎、叶和花的人参皂苷Rb3含量，结果见表6。
表6 三七茎、叶和花10批样品含量测定数据

2.11含量限度因目前三七花和茎、叶药材标准中均未规定人参皂苷Rb3的限量标准，药材在采收过程中的不确定性，以10批样品的平均含量的80％为下限，即本品每克含三七花和三七茎、叶以人参皂苷Rb3(C53H90O22)计，暂定不得少于0.4mg。换算成每日服用量不得少于24mg。
质量控制标准采用含量最高的二醇型人参皂苷，可以保证不同批次之间的产品质量相对稳定。由于三七茎、叶和花中人参皂苷Rb3的含量最高，又是主要的有效成份所以用高效液相法测定其中人参皂苷Rb3的含量。
3、三七茎、叶和花提取物中人参皂苷Rb3的应用详细可参见中国专利200510010934.4。
权利要求
1.一种三七茎叶花提取物的质量控制方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、鉴别取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3任意一种或几种做为对照品，加溶剂制成每1ml各含0.1-5mg的溶液，制成对照品溶液；吸取供试品溶液和三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3对照溶液任意一种或几种各0.1-10μl，点于同一硅胶薄层板上，以展开液展开，取出，晾干，喷以显色剂，显色；在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点；(二)、含量测定色谱条件使用反相硅胶为填充剂，乙腈和水的比例为15-60∶40-85；精密称取人参皂甙Rb3对照品适量，加色谱甲醇制成每1ml含0.1-10mg的对照品溶液；制备供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.如权利要求1所述的三七茎叶花提取物的质量控制方法，其特征在于步骤(一)、(二)中供试品的制备方法为取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取0.2-25克，置具塞锥形瓶中；精密加溶剂1-200ml，密塞，称定重量，提取，再称重，用溶剂补足减失重量，滤过；精密吸取续滤液1-200ml，回收溶剂至干，残渣用定量的溶剂溶解后再进行萃取；回收萃取溶剂至干，用溶剂溶解并转移至容量瓶中，加溶剂稀释至刻度即得。
3.如权利要求2所述的三七茎叶花提取物的质量控制方法，其特征在于所述的供试品的制备方法为取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取1-10克，置具塞锥形瓶中；精密加甲醇3-60ml，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称重，用甲醇补足减失重量，滤过；精密吸取续滤液1.5-30ml，回收溶剂至干，残渣用水1.5-30ml溶解后用1-20ml乙醚萃取1次，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇萃取1-4次，萃取体积为水液体的0.5至1倍，合并正丁醇溶液，用氨试液1-10ml洗涤，弃去氨试液，再用水洗涤两次，每次1-10ml；回收正丁醇溶剂至干，用甲醇溶解并转移至容量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得。
4.如权利要求1所述的三七茎叶花提取物的质量控制方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、鉴别 取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb3任意一种做为对照品，加甲醇制成每1ml各含2.5mg的溶液，制成对照品溶液；由于三七茎叶花中皂苷最高的是人参皂苷Rb3，所以最优选的对照品为人参皂苷Rb3；也可以三七茎、叶、花皂苷作为对照品；照薄层色谱法试验，吸取“含量测定”项下供试品溶液以及所述对照溶液一种或任意几种各4μl，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水65∶35∶10下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃下烘约5分钟，置可见光下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上应显相同颜色的斑点；(二)、含量测定 照高效液相色谱法色谱条件与系统适用性试验 用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈和水的比例为32∶68；对照品溶液的制备 精密称取人参皂甙Rb3对照品适量，加色谱甲醇制成每1ml含1mg的溶液，即得；供试品溶液的制备 取三七地上部份——茎、叶、花的提取物，研细，精密称取8克，置具塞锥形瓶中；精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称重，用甲醇补足减失重量，滤过。精密吸取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣用水25ml溶解后用10ml乙醚萃取1次，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇萃取4次(10，10，5，5ml)，合并正丁醇溶液，用氨试液5ml洗涤，弃去氨试液，再用水洗涤两次，每次5ml；回收正丁醇溶剂至干，用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；每克所含人参皂甙Rb3不得少于0.80g。
全文摘要
本发明涉及一种植物原料药材的质量控制方法。本发明所述质量控制方法由以下步骤组成(一)鉴别取三七茎、叶、花皂苷、人参皂苷Rb
文档编号G01N33/15GK1768771SQ20051001107
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者唐书明, 杨云, 高崇昆, 傅悦 申请人:云南白药集团股份有限公司