专利名称：牛支原体刺激模型及施用牛支原体的方法以及诱导肺炎损伤的方法
技术领域：
本发明涉及牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)刺激模型方法以及施用牛支原体、诱导并建立动物中牛支原体引起的疾病或失调的方法。本发明的牛支原体刺激模型可用来评价潜在的疫苗的效价。
背景技术：
牛支原体使一种在家养或集中养殖的肉牛和奶牛家畜的致病的重要全球性牛病原体。最常见的报道的症状是牛犊肺炎，常常伴随关节炎，也为肺炎-关节炎综合征。已经确证其病因学作用与母牛和公牛乳腺炎、耳炎和生殖性疾病或失调相关。牛支原体诱导的呼吸疾病引起重要的经济损失，已经知道由于牛的呼吸疾病(BRD)，牛支原体引起多达36％死亡率。由于目前没有完全许可的牛支原体疫苗可供使用，为了降低死亡率，常常使用抗生素治疗。预防牛支原体疾病也可降低动物患上其他呼吸疾病。对年轻牛犊有效并安全的牛支原体菌苗对家畜工业非常有价值。因此，需要研制诱导明显的肺损伤以及其他临床症状的可重复牛支原体刺激模型，以评价潜在的牛支原体疫苗的效价。
发明简述本发明提供了可重复的牛支原体刺激模型以及用来可靠地诱导病建立牛支原体感染引起的疾病或失调的方法，通过对动物施用有效量的牛支原体培养物。本发明刺激培养物的施用量足以诱导牛支原体特异的细胞或体液免疫反应。一方面，所述动物为牛犊。本发明的牛支原体刺激模型可用来评价潜在疫苗的效价。
本发明还提供了一种制备牛支原体刺激培养物的方法，该方法包括在适当的培养基中培养分离的牛支原体以达到足够的活菌计数，以及用于实验性地将培养物施用到动物以引起肺炎损伤以及疾病的临床症状的方法。
附图简述

图1为接受实验牛支原体刺激之前和之后的组平均体温曲线图。与未刺激的对照动物(处理组D)相比，牛支原体刺激牛犊(处理组A和C)在第1天～第20天具有较高的平均体温。与组D(未刺激对照动物)相比，组B刺激的牛犊在第3天～第5天，第7天～第14天以及第17天具有较高的平均体温。
图2为接受实验牛支原体刺激之前和之后的组平均体温曲线图。与未刺激对照动物(处理组B)相比，牛支原体刺激牛犊(处理组A)在第15、17和18天具有较高的平均体温。
图3为接受实验牛支原体刺激之前和之后的组平均体温曲线图。与未刺激的对照动物(处理组D)相比，牛支原体刺激的牛犊(处理组B和C)在第4天～第21天具有较高的平均体温。与组D(未刺激d对照动物)相比，组A刺激的牛犊在第7天～第21天具有较高的平均体温。
图4为接受实验牛支原体刺激第3天～第20天的组平均体温曲线图。与安慰剂刺激组(处理组D)相比，施用2剂牛支原体菌苗的牛犊(处理组A和C)以及组E中的动物(未刺激的对照动物)在第7天～第20天具有较低的平均体温。与安慰剂刺激组(处理组D)相比，处理组B中的接种牛犊在7天～第12天以及第14天～第20天具有较低的平均体温。
发明详述本发明包括刺激模型以及在动物中诱导由牛支原体感染引起的疾病或失调的方法，该方法包括对动物施用有效量的牛支原体培养物。本发明包括制备和施用牛支原体培养物的方法。牛支原体株实例为ATCC25025(由R.G.Wittler在1968年10月8日保藏)、25523(由R.G.Wittler在1969年10月22日保藏)和27368(由R.G.Wittler在1972年7月5日保藏)。在优选的实施方案中，刺激培养物的牛支原体分离物包括一或多种下列菌株2300(ATCCPTA-3558)、3625(ATCC PTA-3559)、16150(ATCC PTA-3560)、20518(ATCCPTA-3561)或5063。
本发明包括任何可用作有效的刺激培养物的牛支原体分离物。在优选的实施方案中，牛支原体分离物在Beg4培养基中生长直至达到足够的细胞密度，并且施用有效量后可以诱导动物出现肺炎损伤以及疾病的临床症状。牛支原体株2300(ATCC PTA-3558)、3625(ATCC PTA-3559)、16150(ATCCPTA-3560)、20518(ATCC PTA-3561)以及5063分离物的保藏符合theBudapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure，with the American TyPeCell Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209.
为了使公开更清楚，但不以被限制的方式，本发明的详细描述将分成下述几个小节，后者描述或举例说明本发明的特征、实施方案或应用。
定义及缩写种名之前的缩写M.，指支原体属。
这里使用的与牛支原体感染相关的术语“疾病或失调”指引起牛支原体细菌的复制、诱导牛支原体脱落或传播，或在其宿主中建立牛支原体感染，并引起出现牛支原体感染的症状。如果出现细菌滴度增加、肺部感染增加、肺损伤增加、临床症状增加，即结肠温度上升和/或体重下降和/或生长放缓，就认为刺激模型是有效的。本发明方法可有效用来，例如，在动物特别是在家畜中诱导肺炎、呼吸感染以及肺损伤、增加肺中牛支原体的水平、增加温度、减轻体重增加。本发明还包括对动物并优选家畜有效量的牛支原体刺激培养物的施用，将在所述动物中诱导失调包括肺炎、关节炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失调。
这里使用的术语″牛支原体刺激培养物″指可用于产生牛支原体感染引起的失调或疾病的培养物。牛支原体培养物可包括任何有效的能引起家畜感染牛支原体的培养物。可用于本发明的牛支原体培养物可包括，例如，新鲜的、冻存的或冰冻的牛支原体细胞制剂。
这里使用的术语″牛支原体刺激模型″指一种施用牛支原体培养物的方法，该培养物可用来产生牛支原体感染引起的失调或疾病。牛支原体刺激模型可包括任何施用方法，所述方法有效地引起家畜感染牛支原体。可用于本发明的施用方法可包括，例如，经口、鼻内、口鼻(oranasal)、局部、透皮、气溶胶以及肠胃外(例如静脉内、腹膜内、气管内、皮内、皮下或肌肉内)。
这里使用的术语″动物″指所有的非人动物，包括哺乳动物。
这里使用的术语″家畜″指牛类动物，包括但不限于食用牛、公牛、母牛和牛犊。优选地，本发明方法用于非人哺乳动物的动物，更优选地，牛犊。
术语″有效量″指牛支原体培养物的量足以在施用的对象中诱导或建立疾病。牛支原体刺激培养物的有效量指，例如，刺激培养物引起支原体肺炎。
术语″牛支原体疫苗″这里使用的指可用于预防或治疗牛支原体感染引起的失调或疾病的疫苗。牛支原体疫苗可包括有效治疗或预防家畜感染烈性牛支原体的任何疫苗。可用于本发明的牛支原体疫苗可包括，例如，全或部分的牛支原体细胞制剂、灭活的或修饰的活疫苗、具有一或多种牛支原体衍生多肽或蛋白的亚基疫苗、或所述蛋白或多肽的免疫源性片段，或编码一或多种牛支原体衍生多肽或蛋白的一或多种牛支原体基因或核酸，或其免疫源性片段，并且该基因或核酸能在家畜体内表达。牛支原体多肽、蛋白、所述多肽和蛋白的免疫片段，或牛支原体基因或核酸可用本技术领域公知的技术进行合成或重组的方法进行制备。
这里使用的术语″佐剂″，为免疫反应的增效剂。适当的佐剂科包括，但不限于矿物凝胶，如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卯磷脂；糖苷，如，皂甙衍生物如Quil A或GPI-0100；阳离子表面活性剂如DDA、聚醚多羟基化合物；聚阴离子；非离子性嵌段共聚物，如聚醚F-127(B.A.S.F.，USA)；肽；矿物油，如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，France)，carbopol，Amphigen(Hydronics Omaha，NE.USA)，Alhydrogel(Superfos Biosector，Frederikssund，Denmark)油乳剂如矿物油的乳剂如Bayol F/Arlacel A和水，或植物油、水以及乳化剂如卵磷脂的乳剂；明矾、胆固醇、细胞因子以及佐剂的组合。免疫源可掺入到脂肪体中或偶联到多糖和/或其他聚合物上以用于疫苗配制。
刺激培养物本发明提供了牛支原体刺激模型以及制备和施用牛支原体刺激培养物的方法，包括在适当的培养基中培养牛支原体分离物以达到足够的细胞密度；以及实验性地将培养物施用给动物以诱导肺损伤以及疾病的临床症状的方法。在一个实施方案中，牛支原体从肺组织分离得到。在另一个实施方案中，牛支原体从淋巴节组织分离得到。已知本领域有许多培养基并包括Friis、Beg4、Hayflick′s以及MHP。在优选的实施方案中，刺激培养物的牛支原体分离物包括一或多种下列菌株2300、3625、16150、20518或5063。
牛支原体分离物的生长条件可依据培养基成分以及生长的特定分离物而定。但是，分离物通常按下列方式进行培养。将分离物的冻存小瓶快速解冻或将冻干的小瓶再悬浮在1～10ml的Beg4培养基中。用0.1％～30％的牛支原体接种液接种无菌Beg4培养基。然后将培养物在30℃～40℃培养12～约72小时，从培养时间～富集时间计量。在优选的实施方案中，牛支原体培养物在37℃生长24～48小时。对每一刺激天，配制单独的刺激接种体。在刺激的每天，活菌计数，刺激培养物的菌落形成单位(CFU)按照下列方式测定，在Beg4培养基中进行连续稀释并将各连续稀释在Heart InfusionAgar(HIA)琼脂板上进行铺板。然后将HIA板在37℃培养48～168小时，优选地120小时，并测定菌落数进行活菌计数。
可将得到的牛支原体刺激培养物浓缩。本领域多种已知技术可用来浓缩所述的有机体。例如，有机体可通过下列方式进行浓缩，如离心、超速离心，或通过过滤如超滤。然后用本领域已知的方法回收浓缩的牛支原体培养物。刺激培养物液可以用前述方法的改进方法进行制备，这对本领域的普通技术人员是很易知道的。
可用于本发明的牛支原体培养物可包括，例如，新鲜、冻存、冻干的牛支原体细胞制剂。
牛支原体分离物也可从感染的家畜肺损伤处利用已知的技术直接得到。也可利用已知的技术从感染家畜的下列组织处直接牛支原体分离物鼻腔、气管、肺灌洗流体、淋巴节、肝、脾、肾、心脏、血液以及关节。
给药、施用方式以及处理根据本发明，对动物并优选地约3～28周龄的牛犊施用至少一剂有效量的牛支原体培养物以引起牛支原体感染。优选地，牛支原体培养物连续施用3天。每刺激剂的有效量牛支原体刺激培养物含约1×106～约5×1011菌落形成单位(CFU)。优选地，提供充分疾病的牛支原体刺激培养物含约1×108～约1×1011CFU/剂，并更优选地，约1×1010～约5×1011CFU/剂。根据本发明，牛支原体感染可被可重复性地诱导，并且在约1～49天在家畜中形成临床疾病。优选地，牛支原体临床疾病在约1～21天可重复性地形成并更优选地在约1～14天形成。
根据本发明，施用的牛支原体刺激培养物的有效量为约0.5～约30.0ml，优选地约5ml～约20ml，并更优选地，约10～12ml。
根据本发明，施用可用已知的途径实现，包括经口、鼻内、口鼻、局部、透皮、气溶胶以及胃肠外(如静脉内、腹膜内、气管内、皮内、皮下或肌肉内)。优选的给药途径是鼻内给药。
本发明可包括单剂刺激方法，该方法消去了对牛犊施用另外刺激剂的必要性，施用另外剂的目的在于产生牛支原体诱导疾病。
根据本发明，对约3～28周龄的牛犊施用有效量的牛支原体刺激，提供了有效的呼吸感染，包括肺炎、肺中牛支原体水平增加、体温上升以及体重增加下降。刺激培养物中牛支原体的量，即约1×106～约5×1011，被首次证实在约1～49天可在家畜中可靠地并可重复地诱导感染并形成临床疾病。
本发明提供了一种在牛犊中进行牛支原体感染的方法，包括对牛犊施用至少一剂，并优选地3个刺激剂的培养物以引起牛犊的牛支原体感染。在优选的实施方案中，刺激培养物经鼻内施用。并且，优选地刺激剂包括约10～12ml的培养物，每ml包含约1.0×109牛支原体菌落形成单位。合适地用刺激培养物对牛犊连续施用3天。
本发明还包括对动物并优选地家畜施用有效量的牛支原体刺激培养物以在该动物中引起失调包括但不限于肺炎、关节炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失调。
实施例本发明将通过下列实施例进行进一步的举例说明。
实施例1材料和方法动物健康杂种奶牛或肉牛牛犊用于各个实验刺激。各实验开始之前，使牛犊适应环境至少7天。所有的牛犊每天接受浓缩的未加药食物，不包含任何已知的污染物或杀虫剂并自由饮水。
刺激方法每头牛犊经鼻内途径连续三天接受10～20ml的新鲜牛支原体培养物[约1×108～1×1010菌落形成单位(CFU/ml)]。每次实验刺激结束后，立即测定刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)。刺激培养物的活菌计数按下列方式测定在Beg4培养基中进行连续稀释并将各连续稀释样品在HIA琼脂板上进行铺板。然后将HIA板在37℃培养120小时并测定菌落数以进行活菌计数。
实验过程用独特的耳标记数确定每头牛犊。动物根据年龄随机分组成圈养组和处理组。
在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及刺激后的约第3周称重所有动物。
刺激前1天、刚要刺激前以及刺激后连续20天的每天清晨测量结肠温度。
从每头牛犊的颈静脉采集血样。牛犊在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天采血，并检验尸体(刺激后约3周)。从各血样分离的血清在-20℃冻存直至用牛支原体ELISA kit(Chekit M bovis Sero)进行评价，该试剂盒由Bommeli AG(Hoechst Roussel Vet Diagnostics，Liebefeld-Bern，Switzerland)制备。ELISA板利用Multiscan reader在405nm进行读数。光密度(OD)值转换成相对于阳性对照血清OD的百分比，利用下式计算百分比＝(样品OD-阴性血清OD)/(阳性血清OD-阴性血清OD)×100。低于60％的值认为为阴性。百分比在60～80％的血清认作可疑样品，OD显示大于80％的血清认作阳性。
所有的动物在实验牛支原体刺激后约3周接受尸体检查。将牛犊实施无痛处死并对所有的主要器官，但不包括中枢神经系统进行检查。
取出肺并评价牛支原体感染的特征性损伤。损伤依照标准肺图标进行判分。利用下列各肺叶对总肺重的比率，称重各肺叶百分涉及部分。

总计称重的肺叶值以测定总肺与总损伤的百分比(Pointon等，1992)。此外，下式可用来计算百分百分肺损伤(损伤)下降。

此外，各肺用50ml的PBS灌洗。进行了从支气管灌洗液中分离并测定活菌牛支原体计数的尝试。牛支原体活菌计数(CFU/ml)按下列方式测定配制合适的支气管灌洗液连续稀释液并将样品铺板到合适的琼脂培养基上。
实施例2在该实施例中，在年轻牛犊中评价了不同牛支原体的刺激方法。得到24头健康的杂种的奶牛牛犊(Holstein/Friesian cross)，约7周龄，对牛支原体无母源性抗体，并根据年龄随机分组，如表1中显示。开始研究之前，使所有牛犊适应周围环境。
表1.
实验处理组

牛犊在约10周龄时按照上述描述接受刺激。每头牛犊连续2或3天接受10ml(每鼻孔5ml)的牛支原体株5063的新鲜培养物。通过面罩用肉汤培养物气溶胶刺激组A和B中的动物。利用简单的喷雾装置(Genesis Industries，Elmwood，WI)刺激组C牛犊，组D动物作为未刺激的对照牛犊。
在每次牛支原体实验刺激结束后1小时内测定刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)。结果显示在表2中。
表2.
牛支原体刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)

在刺激之前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及接受实验用牛支原体刺激后第20天，对动物称重。结果总结在表3中。与未刺激的对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激(处理组A、B和C)的牛犊的体重下降。
表3.
实验牛支原体刺激后体重总结平均体重(kg)±标准差

在刺激之前第3天、第2天及第1天、刚要刺激之前、接受实验牛支原体刺激后连续19天的每天清晨，测量结肠温度，结果总结在图1中。当与未刺激的对照动物(处理组D)相比，牛支原体刺激的牛犊(处理组A和C)显示出临床症状，即在第1天～第20天具有较高的平均体温。当与组D(未刺激的对照动物)相比，组B刺激的牛犊在第3天～第5天、第7天～第14天以及第17天具有较高的平均体温。
牛支原体特异的血清抗体反应(IgG)总结在表4中。血清样品与阳性对照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的样品认为牛支原体阳性。实验刺激之前，所有的牛犊为牛支原体阴性。接受实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A、B和C)在接受牛支原体刺激后第20天为血清阳性。处理组D动物(未刺激对照动物)在该研究中基本上为阴性。
表4.
牛支原体血清抗体(IgG)的总结光密度值对阳性对照血清的百分比平均值±标准差

所有动物在实验牛支原体刺激后第20天进行尸体检查。取出肺并总体评价牛支原体感染的特征性损伤。百分肺损伤判分总结在表5中。当与未刺激的对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A、B和C)具有较高的百分肺损伤判分。这些结果证实实验牛支原体刺激能诱导牛支原体感染的特征性肺损伤。
表5.百分肺损伤评分总结平均权重百分比±标准差

每只肺用50ml的PBS灌洗。实验牛支原体刺激后第20天从支气管灌洗样品分离的牛支原体结果总结在表6中。当与未刺激对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激牛犊(处理组A、B和C)的肺灌洗样品中具有增加的活菌牛支原体发生率。
表6.肺灌洗液中分离出的牛支原体的总结

总之，当与未刺激对照动物(处理组D)相比，接受实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A、B和C)显示出肺损伤、具有增加的结肠温度、体重增加下降、从肺灌洗样品分离的活菌牛支原体发生率上升。结果表明在进行实验刺激后，牛支原体培养物能诱导血清学反应并能诱导牛支原体感染的特征性肺损伤。
实施例3在该实施例中，在5～7月龄牛犊中评价牛支原体刺激模型。使用22头健康的杂种奶牛或肉牛牛犊，约4周龄，对牛支原体无母源性抗体，并根据年龄随机分组，如表7中所示。在开始研究之前使所有牛犊适应环境。
表7.
实验处理组

牛犊在约在5～7月龄接受按照上述描述方法进行的刺激。组A中牛犊接受20ml(每鼻孔10ml)的牛支原体株5063新鲜培养物，连续3天，并利用简单的喷雾装置(Genesis Industries，Elmwood，WI)进行刺激。动物组B作为未刺激的对照牛犊。
每次牛支原体实验刺激之后1小时内测定刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)。结果显示在表8中。
表8.
牛支原体刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)

在刺激前1天以及接受实验牛支原体刺激后第21天，对所有动物称重。结果总结在表9中。当与未刺激对照动物(处理组B)相比，施用实验牛支原体刺激牛犊(处理组A)具有类似的体重增加。
表9.实验牛支原体刺激后体重的总结平均体重(kg)±标准差

刺激前1天、刚要刺激前以及接受实验牛支原体刺激后连续21天的每天清晨测量结肠温度。结果总结在图2中。当与未刺激的对照动物(处理组B)相比，牛支原体刺激的牛犊(处理组A)在第15、17和18天显示出临床症状，即较高的平均体温。
牛支原体特异的血清抗体反应(IgG)总结在表10中。血清样品与阳性对照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的样品认为牛支原体阳性。实验刺激之前，所有的牛犊为牛支原体阴性。接受实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A)在接受牛支原体刺激后第21天为血清阳性。处理组B动物(未刺激对照动物)在第21天为阴性。
表10.
牛支原体血清抗体(IgG)总结光密度值与阳性对照血清的平均百分比±标准差

所有动物在实验牛支原体刺激后第21天进行尸体检查。取出肺并总体评价牛支原体感染的特征性损伤。百分肺损伤判分总结在表11中。当与未刺激的对照动物(处理组B)相比，施用实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A)具有较高的百分肺损伤判分。这些结果证实实验牛支原体刺激能诱导牛支原体感染的特征性肺损伤。
表11.
百分肺损伤判分总结平均权重百分比±标准差

每只肺用50ml的PBS灌洗。实验牛支原体刺激后第20天从支气管灌洗样品分离的牛支原体结果总结在表12中。当与未刺激对照动物(处理组B)相比，施用实验牛支原体刺激牛犊(处理组A)的肺灌洗样品中具有增加的活菌牛支原体发生率。
表12.
从肺灌洗液分离的牛支原体总结

总之，当与未刺激对照动物(处理组B)相比，接受实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A)显示出肺损伤、在刺激后第15、17和18天具有增加的结肠温度、体重增加下降、从肺灌洗样品分离的活菌牛支原体发生率上升。结果表明在进行实验刺激后，牛支原体培养物能诱导血清学反应并能诱导牛支原体感染的特征性肺损伤。
实施例4在该实施例中，在年轻牛犊中评价牛支原体刺激模型。使用24头健康的杂种奶牛牛犊(Holstein/Friesian cross)，约6周龄，对牛支原体无母源性抗体，并根据年龄随机分组，如表13中所示。在开始研究之前使所有牛犊适应环境。
表13.
实验处理组

牛犊在约9月龄接受按照上述描述方法进行的刺激。组A、B、C中的每只牛犊接受12ml(每鼻孔6ml)的牛支原体株的新鲜培养物，连续3天，并利用简单的喷雾装置(Genesis Industries，Elmwood，WI)进行刺激。动物组D作为未刺激的对照牛犊。
每次牛支原体实验刺激之后1小时内测定刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)。结果显示在表14中。
表14.
牛支原体刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)

在刺激前1天以及接受实验牛支原体刺激后第21天，对所有动物称重。结果总结在表15中。当与未刺激对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激牛犊(处理组A、B和C)体重下降。
表15.
实验牛支原体刺激后体重总结平均体重(kg)±标准差

刺激前1天、刚要刺激前以及接受实验牛支原体刺激后连续21天的每天清晨测量结肠温度。结果总结在图3中。与未刺激的对照动物(处理组D)相比，牛支原体刺激的牛犊(处理组B和C)在第4天～第21天显示出临床症状，即较高的平均体温。与未刺激的对照动物(处理组D)相比，牛支原体刺激的牛犊(处理组A)在第7天～第21天显示出较高的平均体温。
牛支原体特异的血清抗体反应(IgG)总结在表16中。血清样品与阳性对照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的样品认为牛支原体阳性。实验刺激之前，所有的牛犊为牛支原体阴性。接受牛支原体菌株5063、3625或16150刺激培养物的牛犊(处理组A、B和C)在接受牛支原体刺激后第20天具有血清反应。处理组D动物(未刺激对照动物)在第20天为阴性。
表16.
牛支原体血清抗体(IgG)的总结光密度值相对对照血清的平均百分比±标准差

所有动物在实验牛支原体刺激后第21天进行尸体检查。取出肺并总体评价牛支原体感染的特征性损伤。百分肺损伤判分总结在表17中。当与未刺激的对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激的牛犊(处理组A、B和C)具有较高的百分肺损伤判分。这些结果证实实验牛支原体刺激能诱导牛支原体感染的特征性肺损伤。
表17.
百分肺损伤判分总结平均权重百分比±标准差

实施例5在该实施例中，在牛支原体刺激模型中评价多种牛支原体菌苗的效价。使用66头健康的杂种奶牛牛犊(Holstein/Friesian cross)，约14周龄，对牛支原体无母源性抗体，并根据年龄随机分组所示。在开始研究之前使所有牛犊适应环境1周。
包含BEI灭活的全细胞牛支原体细菌的菌苗每剂包含合适的浓度。此外，各菌苗制剂包含磷酸盐缓冲液(PBS)以及合适的佐剂(参见表18.)。安慰剂含PBS。
动物用2ml的合适菌苗或安慰剂经皮下途径在第0天(左侧颈部)和第21天(右侧颈部)进行接种。实验处理组以及使用的菌苗显示在表19中。
表18.
实验处理组

牛犊在约9月龄时，2次接种后3周接受按照上述描述方法进行的刺激(第42天)。用简单的喷雾装置(Genesis Industries，Elmwood，WI)，使用肉汤培养物刺激组A、B、C和D中的动物。每头牛犊接受12ml(每鼻孔6ml)的牛支原体株5063的新鲜培养物，连续3天。动物组E作为未刺激的对照牛犊。
每次牛支原体实验刺激之后1小时内测定刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)。结果显示在表19中。
表19.
牛支原体刺激接种体的活菌计数(CFU/ml)

在刺激前1天、刺激后第7天、刺激后第14天以及接受实验牛支原体刺激后第20天，对所有动物称重。结果总结在表20中。与刺激对照组(处理组D)相比，施用实验牛支原体刺激牛犊(处理组A、B和C)以及组E中的动物的体重增加。
表20.
实验牛支原体刺激后体重总结平均体重(kg)±标准差


请确认处理组D的体重增加数据。在实验牛支原体刺激后的第3天～第20天的每天清晨，测量结肠温度。结果总结在图4中。与刺激对照组(处理组D)相比，施用2剂牛支原体疫苗(处理组A和C)的牛犊以及组E中的动物(未刺激对照动物)在第7天～第20天显示出临床症状，即下降的平均体温。与刺激照组(处理组D)相比，处理组B中的接种牛犊在第7天～第12天以及第14天～第20天具有下降的平均体温。
牛支原体特异的血清抗体反应(IgG)总结在表21中。血清样品与阳性对照血清的百分光密度(OD)值＞0.80的样品认为牛支原体阳性。接种前，所有的牛犊为牛支原体阴性。接受实验用牛支原体菌苗的牛犊(处理组A、B和C)在第二次接种之前使牛支原体血清阳性的，并在该研究中保持血清阳性。处理组E动物(未刺激对照动物)在整个研究中为血清阴性。
表21.
牛支原体血清抗体(IgG)的总结光密度值对阳性对照血清的平均百分比±标准差

所有动物在实验牛支原体刺激后第20天进行尸体检查。取出肺并总体评价牛支原体感染的特征性损伤。百分肺损伤判分以及肺损伤百分下降总结在表22中。与刺激的对照动物(处理组D)相比，施用实验牛支原体疫苗的牛犊(处理组A、B，和C)以及组E中的动物(未刺激对照动物)具有下降的百分肺损伤判分。这些结果证实2剂的实验牛支原体菌苗能在接受实验刺激的牛犊中诱导作用。
表22.
百分肺损伤判分的总结平均权重百分比±标准差

每只肺用50ml的PBS灌洗。实验牛支原体刺激后第20天从支气管灌洗样品分离的牛支原体结果总结在表23中。与刺激的对照牛犊(处理组D)相比，施用实验牛支原体疫苗的牛犊(处理组A、B和C)以及组E中的动物(未刺激的对照动物)的肺灌洗样品中具有下降的活菌牛支原体发生率。
表23.
肺灌洗液分离的牛支原体的总结

请确认处理组B的cfu/ml数据。总之，与刺激的对照动物(处理组D)相比，接受实验牛支原体菌苗的牛犊(处理组A、B和C)以及组E中的动物(未刺激的对照动物)显示较轻的肺损伤、具有下降的结肠温度、增加的体重增加以及从肺灌洗样品中分离出的活菌牛支原体水平下降。结果表明在实验刺激模型体系中，2剂的牛支原体菌苗能诱导血清反应并对牛支原体的感染具有保护作用。
权利要求
1.一种在动物中诱导疾病或失调的方法，包括施用有效量的牛支原体培养物，并判断所述疾病的临床症状。
2.权利要求1的方法，其中所述疾病或失调选自肺炎、呼吸感染、肺损伤、关节炎、乳腺炎、耳炎以及生殖性失调。
3.权利要求1的方法，其中所述动物选自食用牛、公牛、母牛以及牛犊。
4.权利要求3的方法，其中所述动物为母牛。
5.权利要求3的方法，其中所述动物为牛犊。
6.权利要求1的方法，其中所述有效量的牛支原体培养物包括约1×106～约5×1011菌落形成单位(CFU)每刺激剂。
7.权利要求6的方法，其中所述有效量的牛支原体培养物包括约1×108～约1×1011CFU/剂。
8.权利要求7的方法，其中所述有效量的牛支原体培养物包括约1×1010～约5×1011CFU/剂。
9.权利要求1的方法，其中所述疾病临床症状包括肺中牛支原体水平增加、温度升高或体重下降。
10.权利要求9的方法，其中所述温度升高为结肠温度。
11.一种评价对抗牛支原体疫苗的方法，包括a.对第一头动物施用牛支原体疫苗；b.用有效量的牛支原体刺激培养物刺激该动物；c.用有效量的牛支原体刺激培养物刺激第二头动物；d.判断所述牛支原体引起的疾病的临床症状；以及e.将所述第一头动物中疾病的临床症状与第二头动物中疾病的临床症状进行比较。
12.权利要求11的方法，其中所述的刺激培养物包括约1×106～约5×1011菌落形成单位(CFU)每刺激剂。
13.权利要求12的方法，其中所述的刺激培养物包括约1×108～约1×1011CFU/剂。
14.权利要求13的方法，其中所述的刺激培养物包括约1×1010～约5×1010CFU/剂。
15.权利要求11的方法，其中所述疾病的临床症状包括肺中牛支原体水平增加、温度升高或体重下降。
全文摘要
本发明提供了可重复的牛支原体刺激模型和方法，以可靠地诱导并建立牛支原体感染引起的疾病或失调，通过向动物施用有效量的牛支原体培养物。本发明刺激培养物的施用量足以引起牛支原体特异的细胞或体液免疫反应。本发明的牛支原体刺激模型可用来评价潜在的疫苗的效价。
文档编号G01N33/68GK1571633SQ02820385
公开日2005年1月26日 申请日期2002年7月25日 优先权日2001年8月28日
发明者罗宾·L·凯奇, 拉兹洛·P·斯蒂普科维茨 申请人:辉瑞产品公司