专利名称：一种半定量快速检测大麻植物中△⁹-THC含量的方法
技术领域：
本发明属于植物成分检测技术领域，具体涉及一种半定量快速检测大麻植物中 A9-THC含量的方法。
背景技术：
大mCannabis sativa L.)中含有一种致幻物质四氢大麻酚(THC， tetrahydrocannabinol)，易被不法分子用来提炼毒品，造成社会危害。由于非法毒品的蔓延，许多国家采取了限制种植大麻的措施。按照国际禁毒公约的规定，大麻干物质中THC含量> 0. 3%作为判定毒品大麻的依据。而THC含量低于0. 3%的工业大麻的纤维、籽、杆甚至全株皆具有较高的经济开发利用价值，它的利用可涉及造纸、纺织、建材、工业用油、功能保健食品、化妆品、医药等工业行业。由于在我国，工业大麻推广种植利用力度加大和与四氢大麻酚相关的刑事案件逐年上升之间的矛盾日趋显著，迫切需要研发一种快速测定新采集的大麻植物中THC含量是否低于0. 3%，可供实验室快速筛查及基层单位容易掌握并配置的检测分析方法，为大麻的禁(限)种执法管理和大麻育种研究服务。由于大麻中近百种大麻酚类衍生物之间的化学性质相近，给Δ 9-THC的分离和进一步定量分析造成了困难。现有国内外文献中，有基于化学显色原理的大麻定性分析方法，但只能对大麻酚类化合物进行显色，从而定性判定是否为大麻或大麻毒品；有基于气相色谱法、液相色谱的仪器方法，可以进行Δ 9-THC的准确定量分析，但缺点是检验速度慢，分析操作繁琐，购买仪器价格昂贵，需要专门培训，且检验成本高(一个样品需400元人民币以上)，难以在基层单位推广；还有基于免疫测定技术的大麻定性方法，该方法主要用于如唾液、血液、尿液等流体生物样品中A9-THC的定性检测(CN200910004736. 5)。这些方法都无法对大麻植物中的 Δ 9-THC含量是否超过或低于0. 3%进行快速、准确地测定。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、简易、准确地检测大麻植物中A9-THC含量的方法。本发明的目的通过以下技术方案实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。一种半定量快速检测大麻植物中Δ 9-THC含量的方法，包括以下步骤
1、样品前处理将大麻植株置于9(Tl80°C环境下烘烤广lOmin，粉碎至过0. 425mm筛； 烘烤温度优选14(T160°C，加热时间优选2 5 min02、超声波提取将粉碎好的大麻样品与有机溶剂按固液比1: 20 50 (g: ml)混合后，超声波提取广8 min，过滤后得供试品溶液；另取A9-THC含量为0.3%的标准溶液作为对照品溶液；
所述的有机溶剂为石油醚、正己烷、氯仿、甲醇或乙醇中的任一种，或是以下两种有机溶剂的混合物，包括石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-氯仿、石油醚-氯仿、氯仿-乙酸乙酯，正己烷-二氯甲烷、正己烷-甲醇；两种有机溶剂的混合体积比为 1:1 15:1。两种有机溶剂的混合体积比优选5:广10:1。超声波提取时间优选3、min。3、样品展开在1(T30°C环境下，取供试品溶液和对照品溶液各1在同一块薄层层析材料上点样，再用展开剂展开，展开高度为rScm ；
展开时环境温度优选为15 25°C。所述的薄层层析材料为聚酰胺、硅胶GF254、硅胶HF254或硅胶H。所述的展开剂为石油醚-乙醚、正己烷-乙醚、石油醚-甲醇、石油醚-乙醇、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮、氯仿或二氯甲烷；当展开剂为两种有机溶剂的混合物时，两种有机溶剂的混合体积比为1 :5 20 :1ο当选择聚酰胺作为薄层层析材料时，展开剂优选氯仿、二氯甲烷、正己烷-甲醇 (乙醇)、石油醚-甲醇(乙醇)或正己烷-乙酸乙酯；当展开剂为两种有机溶剂的混合物时， 两种有机溶剂的混合体积比为ι :5 15 :1。当选择硅胶作为薄层层析材料时，展开剂优选正己烷-乙醚、石油醚-乙酸乙酯或正己烷-丙酮，两种有机溶剂的混合体积比为1 :5 10 :1。展开高度优选为5 7cm。4、显色采用浓度1 5 mg/ml的快蓝B盐或快蓝BB盐的有机溶剂同时对展开后的供试品和对照品进行显色，有机溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷；
5、判定在与对照品Δ 9-THC的&值相同的位置若样品出现玫红色斑点，则该斑点可定性为Δ 9_THC，然后按照该斑点的颜色深浅进行半定量判定若斑点颜色明显比对照品 A9-THC深，则样品中A9-THC的含量明显高于0. 3% ；若颜色明显比对照品Δ 9_THC浅，则样品中Δ 9-THC的含量明显低于0. 3% ；若颜色与对照品Δ 9-THC近似，则视为样品中Δ 9-THC 的含量近似于0. 3%。本发明人经过长期和深入的研究，寻找到新的应用于大麻植物中A9-THC半定量检测的薄层层析材料和对应的展开剂体系，继而摸索出快速加热大麻植物的前处理条件， 通过与对照品目视比色，达到快速检测判定的目的。前处理加热温度选择
由文献和实际检测实验(如

图1)可知，在新采集的大麻植物中，THC含量较THCA的含量低，在高温情况下，存在THC的转化和THCA脱羧基转化为THC的竞争，采用不同的温度处理，以期得到最佳的处理温度。前处理加热温度研究选择9(T180°C采用不同处理时间对少量大麻植物样品进行高温快速处理，优选出加热温度为14(T160°C，加热时间最佳为2飞分钟。选用高毒和低毒大麻植物样品进行快速半定量检测方法与标准《工业大麻品种类型》(DB53/ T 295. 1-2009)中使用的HPLC仪器定量分析方法比较，THC含量的相对误差高毒品种为 1. 3 9. 8%，低毒品种为1. 6% 12· 8%ο提取溶剂和超声时间的选择提取溶剂的研究，通过对常用提取溶剂的筛选，可知用甲醇、甲醇-氯仿(二氯甲烷) 等溶剂对大麻植物样品进行提取，提取液杂质较多，对随后的薄层层析显色判定造成假阳性干扰，而用石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、正己烷、石油醚提取的干扰较小，且提取率为949Γ98%。当使用两种有机溶剂混合时，低极性与较高极性有机溶剂的体积比为 1:广15:1，优选为5:广10:1;超声提取时间选择广8 min0进行上述HPLC仪器定量分析可知，超声提取3、min分钟后的THC的溶出达到最大值。薄层层析材料及层析条件选择
选择硅胶(含硅胶GF254、硅胶HF254或硅胶H等)作为薄层层析材料，优选出正己烷-乙醚、石油醚-乙酸乙酯、正己烷-丙酮为展开剂体系，低极性溶剂与高极性溶剂的体积比为 1 :5 20 :1，更优选1 :5 10 :1。采用其中的最佳展开剂体系展开，CBD、CBN和^(的&值分别可为0. 36,0. 32、0· 27 (如图2所示)。选择聚酰胺作为薄层层析材料，优选出氯仿、二氯甲烷、正己烷-甲醇(乙醇)、石油醚-甲醇(乙醇)、正己烷-乙酸乙酯为展开剂体系，当使用有机溶剂混合溶液时，低极性溶剂与高极性溶剂的体积比为1 :5 20 :1，更优选1 :5 15 :1。采用其中的最佳展开剂体系展开，CBD、CBN和THC的&值分别可为0. 31,0. 37,0. 67(如图2所示)。与使用硅胶薄层层析材料的对应展开体系结果比较，THC与其他两个干扰成分相距较远，且处于较前位置， 易于辨识，更便于目视定量。显色条件选择
显色条件研究，选择快蓝B盐或快蓝BB盐的有机溶液，如三氯甲烷、二氯甲烷。该显色剂对THC等大麻酚类化合物有特征显色，其他酚类对其干扰较少。THC、CBD、CBN三种化合物颜色分别显示为玫红色、橘黄色、紫色。有机溶液显色后易挥干，显色2 5min内为最佳判定时间。快蓝B盐或快蓝BB盐的有机溶液浓度可选择广5mg/ml，现配现用，若密封并避光低温(_20°C)放置，有效时间会延长至12小时。采用硅胶薄层层析，在上述显色剂浓度下，检测下限为10μ g/ml ；采用聚酰胺薄膜层析，检测下限为20. 0 μ g/ml。检测方法有效性验证
硅胶薄层层析板半定量检测分析
取不同THC浓度的大麻植物样品36份，采用本发明所述的Δ 9-THC快速半定量检测方法操作并做出判定，与HPLC仪器定量分析结果比较，判定结果正确率为91. 7% (如表1)。表1小同大麻大庥 SlffiSi THC含呈半判定结果
权利要求
1.一种半定量快速检测大麻植物中A9-THC含量的方法，包括以下步骤(1)样品前处理将大麻植株置于9(Tl80°C环境下烘烤广lOmin，粉碎至过0.425mm筛；(2)超声波提取将粉碎好的大麻样品与有机溶剂按固液比1:20 50混合后，超声波提取广8 min，过滤后得供试品溶液；另取A9-THC含量为0. 3%的标准溶液作为对照品溶液；(3)样品展开在1(T30°C环境下，取供试品溶液和对照品溶液在同一块薄层层析材料上点样，再用展开剂展开，展开高度为rScm ；(4)显色采用浓度1 5mg/ml的快蓝B盐或快蓝BB盐的有机溶剂同时对展开后的供试品和对照品进行显色，有机溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷；(5)判定在与对照品Δ9-THC的&值相同的位置若样品出现玫红色斑点，则该斑点可定性为Δ 9_THC，然后按照该斑点的颜色深浅进行半定量判定若斑点颜色明显比对照品 A9-THC深，则样品中A9-THC的含量明显高于0. 3% ；若颜色明显比对照品Δ9_THC浅，则样品中Δ 9-THC的含量明显低于0. 3% ；若颜色与对照品Δ 9-THC近似，则视为样品中Δ 9-THC 的含量近似于0. 3%。
2.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(1)中，烘烤温度为14(T160°C，加热时间为2、min。
3.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的有机溶剂为石油醚、正己烷、氯仿、甲醇或乙醇中的任一种，或是以下两种有机溶剂的混合物，包括石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-氯仿、石油醚-氯仿、氯仿-乙酸乙酯，正己烷-二氯甲烷、正己烷-甲醇；两种有机溶剂的混合体积比为1:1 15:1。
4.根据权利要求3所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于两种有机溶剂的混合体积比为5:广10:1。
5.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的超声波提取时间为3、min。
6.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(3)中，展开时的环境温度为15 25°C。
7.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的薄层层析材料为聚酰胺、硅胶GF254、硅胶HF254或硅胶H。
8.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的展开剂为石油醚-乙醚、正己烷-乙醚、石油醚-甲醇、石油醚-乙醇、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮、氯仿或二氯甲烷；当展开剂为两种有机溶剂的混合物时，两种有机溶剂的混合体积比为1 5 20 :1ο
9.根据权利要求8所述的半定量快速检测大麻植物中Δ9-THC含量的方法，其特征在于当选择聚酰胺作为薄层层析材料时，展开剂为氯仿、二氯甲烷、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、石油醚-甲醇、石油醚-乙醇或正己烷-乙酸乙酯；展开剂为两种有机溶剂的混合物时，两种有机溶剂的混合体积比为1 :5 15 1 ；当选择硅胶作为薄层层析材料时，展开剂为正己烷-乙醚、石油醚-乙酸乙酯或正己烷-丙酮，两种有机溶剂的混合体积比为1 : 5 10 :1。
10.根据权利要求1所述的半定量快速检测大麻植物中A9-THC含量的方法，其特征在于步骤(3)中，展开剂的展开高度为5 7cm。
全文摘要
本发明公开了一种半定量快速检测大麻植物中△9-THC含量的方法。将大麻植株烘烤、粉碎至细粉，经有机溶剂超声波提取得供试品溶液，另取Δ9-THC含量为0.3%的标准溶液作为对照品溶液，再经点样、展开、显色后，通过观察供试品与对照品颜色的差异，即可判定供试品中△9-THC的含量。通过高温加热，大麻植物中的水分被迅速挥去，△9-THC快速从其羧酸类前体经过脱羧基而转化形成，解决了新采集大麻植物样品中难以检测到△9-THC的问题。该方法具有快速、简便、易操作、检测成本低的特点，能够对大麻植物进行快速半定量检测，可供实验室快速筛查，基层单位容易掌握并配置，具有良好的应用前景。
文档编号G01N30/90GK102175813SQ20111003281
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月30日 优先权日2011年1月30日
发明者张庆滢, 杨明, 许艳萍, 郭孟璧, 郭鸿彦, 陈璇 申请人:云南省农业科学院经济作物研究所