专利名称：单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及酶标抗体的制备方法，特别是单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法。
周围神经断伤后，感觉束与运动束难以快速、准确鉴别，从而限制了缝合的准确性，也一定程度上困扰着神经外科的进步，术后优良率无法明显提高。目前，采用的物理和化学方法进行术中鉴别，但这些方法不够理想、实用。因此，有必要提供一种鉴别单纯感觉(或运动)神经纤维的定性方法。
本发明目的是提供一种可以定性鉴别单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法;利用酶标抗体鉴别单纯感觉(或运动)神经纤维的方法，该方法操作简单，易于观察，显色迅速，实用性强，特异性强。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案它包括以下步骤(1)制备人感觉(或运动)神经抗原乳剂在15倍手术显微镜下抽取人体的单纯感觉(或运动)神经纤维，以Hank′S液体洗掉血细胞，将神经纤维研磨成浆状物，其浓度为25mg/ml-50mg/ml，神经纤维浆状物与弗氏佐剂按1∶3(体积比)加压混合成油包水乳剂，液氮储存备用;(2)将抗原乳剂免疫动物制备抗体分三次注射，其时间间隔及用量分别为第一次，4-8ml，滴后第二次注射用量3-5ml，一周后第三次注射，用量为3-5ml，第三次注射后二周，抽血检测IgG含量;(3)用SephadexG200层析，提纯抗体;(4)按改良戊二醛二步法将上述动物血清与辣根过氧化物酶(HRP)交联。
以下结合实施例对本发明作进一步说明实施例1在15倍手术显微镜下分段抽出神经纤维，用Hank′S液体洗掉血细胞，将神经纤维研磨成浆状物，其浓度为25mg/ml，浆状物与弗氏佐剂以1∶3(体积比)加压混合，制成油包水的人感觉神经及运动神经抗原乳剂，液氮储存备用;将抗原乳剂注入羊腹腔内，第一次注射6ml，3周后第二次注射4ml，1周后第三次注射4ml，抽血检测IgG，其含量为2.94g/l;将羊血清与辣根过氧化物酶交联，其步骤包括(a)，将60mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1mlPH6.8/0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)中，逐滴加入2.5%GA(戊二醛)溶液1ml，置室温18小时后，装入透析袋在生理盐水中透析，除去GA;(b)，透析袋内液体置称量瓶中，加入PH9.5/1M碳酸盐缓冲液1ml，4℃搅拌24小时，(c)，加入0.2M赖氨酸1ml，封闭被GA激活的酶的残基，室温2小时后，装透析袋内，在PH7.2/0.15MPBS中4℃透析过夜(d)，透析袋内液体在电磁搅拌下滴加饱和硫酸铵，于4℃冰箱中静置1小时后，以4000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗涤二次，溶于PH7.2/0.15MPBS中以同样的PBS4℃透析2-3天，至无MH4+为止，(e)，取出透析袋内液体以4000rpm离心30分钟，取上清液，测定效价、分装、冰冻保存备用。
上述制备方法得到的酶标抗体，用于鉴别感觉神经或运动神经的方法如下将待染组织片段置入试管中，加入上述酶标抗体血清1ml，在37-38°温箱中温育，时间为25分钟，温育时间也可以长一些，例如55分钟，115分钟，取出待染组织，用PH7.2/0.15M的磷酸缓冲液冲洗掉未反应的酶，加入底物1%邻联甲苯胺(OT)(其中含1%双氧水，临用前现配)，作用后5分钟后，，加入2MH2SO4终止反应。手术显微镜下观察结果，这种酶标抗体特异性强，感觉神经迂羊抗人感觉神经酶标抗体与底物显兰色，与运动神经不显色，运动神经迂羊抗人运动神经酶标抗体与底物显色，与感觉神经不显色。
本发明优点本发明提供的酶标抗体分装后，可较长时间保存，使用方便，采用本酶标抗体鉴别感觉神经或运动神经的方法，优于现有的其他方法，现有的胆碱酶组织化学染色法，操作复杂，时间较长，准确性差，临床应用受到限制，本鉴别方法操作简单，易于观察(肉眼或显微镜下观察)，敏感性高，特异性强，手术医师术中可亲自观察。
权利要求
1.单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法，其特征在于它包括(1)制备人感觉(或运动)神经抗原乳剂在15倍手术显微镜下抽取人体的单纯感觉(或运动)神经纤维，以Hank/s液体洗掉血细胞，将神经纤维研磨成浆状物，其浓度为25mg/ml-50mg/ml，神经纤维浆状物与弗氏佐剂以1∶3(体积比)加压混合，制成油包水的人感觉神经及运动神经抗原乳剂，液氮储存备用；(2)将抗原乳剂免疫动物制备抗体分三次注射，其时间间隔及用量分别为第一次4-8ml，三周后第二次注射，用量3-5ml，一周后第三次注射，用量为3-5ml，第三次注射后二周，抽血检测IgG含量；(3)层析、提纯抗体；(4)按改良戊二醛二步法将上述动物血清与辣根过氧化物酶(HRP)交联，其步骤是(a)，将60mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1mlPH6.8/0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)中，逐滴加入2.5%GA(戊二醛)溶液1ml，置室温18小时后，装入透析袋在生理盐水中透析，除去GA；(b)，透析袋内液体置称量瓶中，加入PH9.5/1M碳酸盐缓冲液1ml，4℃搅拌24小时，(c)，加入0.2M赖氨酸1ml，封闭被GA激活的酶的残基，室温2小时后，装透析袋内，在PH7.2/0.15MPBS中4℃透析过夜；(d)，透析袋内液体在电磁搅拌下滴加饱和硫酸铵，于4℃冰箱中静置1小时后，以4000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗涤二次，溶于PH7.2/0.15MPBS中以同样的PBS4℃透析2-3天，至无MH4+为止；(e)，取出透析袋内液体以4000rpm离心30分钟，取上清液，测定效价、分装、冰冻保存备用。
2.一种按权利要求1所述制备方法获得的酶标抗体对感觉(或运动)神经的鉴别方法，其特征在于它包括将待染组织片段置入试管中，加入酶标抗体血清1ml，在37-38°温箱中温育，时间为25分钟，取出待染组织，用PH7.2/0.15M的磷酸缓冲液冲洗掉未反应的酶，加入底物1%邻联甲苯胺(OT)(其中含1%双氧水，临用前现配)，作用5分钟后，加入2MH2SO4终止反应，以肉眼或显微镜下观察结果。
全文摘要
一种单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法，它包括制备人感觉(或运动)神经抗原乳剂，将抗原乳剂免疫动物制取抗体，按改良戊二醛二步法将上述动物血清与辣根过氧化物酶交联。本方法制得的酶标抗体分装，可放置较长时间，使用方便。使用时，将神经抗原、抗体反应，温育，温育后取出待染组织，经缓冲液冲洗掉未反应的酶，加入底物使之反应、显色，即可鉴别出感觉(或运动)神经，敏感性高，特异性强，操作简单，易于观察(用肉眼或显微镜下观察)。
文档编号G01N33/68GK1080399SQ9310486
公开日1994年1月5日 申请日期1993年4月29日 优先权日1993年4月29日
发明者于昌玉, 胡玉弘 申请人:丰宁满族自治县医院