专利名称：一种无色孔雀石绿的检测方法
技术领域：
本发明涉及无色孔雀石绿的检测方法，特别是一种检测无色孔雀石绿的共振瑞利 散射法。
背景技术：
孔雀石绿(Malachite green，MG)，化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式 C23H25ClN2,属三苯甲烷类染料，易溶于水、乙醇、甲醇、乙腈，溶液呈蓝绿色，是一种生物染色 剂，也被用作水产动物的抗菌剂和保鲜剂。无色孔雀石绿(Leycomalachite green,LMG), 化学名为是N，N-二甲基苯胺，分子式C23H26N2，其是孔雀石绿在水产动物体内经还原的代谢 产物。经科研表明，孔雀石绿和无色孔雀石绿均具有高毒素、高残留、高致癌、高致畸和致突 变的危害，但由于无色孔雀石绿在体内的代谢周期更长，危害更严重。一些国家如美国、英 国、日本、中国已宣布禁止在经济鱼类(观赏鱼除外)的养殖过程中使用孔雀石绿。目前，国内外已建立的测定无色孔雀石绿的方法有高效液相色谱法、高效液相色 谱-串联质谱法、气相色谱-质谱联用法。近些年，又出现了一些检测方法，相关专利文献 有水体及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留的快速检测方法和该方法所用的检测盒 (专利申请号200810025045. 9)，该专利涉及的是一种半定量方法且检测灵敏度低，而其他 涉及无色孔雀石绿检测方法都是酶联免疫方法。所述这些检测方法中有些较复杂，仪器昂 贵，前处理要求高、耗时长；有些虽操作简便，但灵敏度低，测量有误差。

发明内容
本发明的目的是提供一种无色孔雀石绿的检测方法，它具有简便快速、灵敏度高 的特点。本发明是通过下述技术方案来实现①制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系，移取HAc-NaAc缓冲液于试管中，再在 试管中加入阴离子和已知各浓度的无色孔雀石绿，摇勻，再加入两性离子表面活性剂，用乙 腈定容，避光放置；②依照步骤①的方法制备未加入无色孔雀石绿的试剂空白体系；③用荧光光度计在激发波长等于发射波长下进行同步扫描，得到步骤①和②体系 的共振瑞利散射光谱，测定样品散射强度I和空白散射强度Itl,计算Δ I = I-I0的值；④根据△ I对应无色孔雀石绿的浓度关系做标准曲线；⑤依照步骤①的方法制备检测体系，其中加入的无色孔雀石绿为含有无色孔雀石 绿但浓度未知的被测物，求出被测物的△ I值；⑥依据④的标准曲线，计算出被测物相应△ I值对应所含的无色孔雀石绿浓度。在上述步骤①中，所述HAc-NaAc缓冲液的ρΗ值为3. 5 5. 0，体积为0. 5 2. OmL ；所述阴离子可以是I” CIO” BrO” 10” S2032—、PO43"中任意一种，均由相应的钠盐 或钾盐配制，浓度为1.0\10_3!1101/1，体积为0. 05 1.5mL;所述两性离子表面活性剂可以是椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油基二甲基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟磺 酸甜菜碱中任意一种，浓度为10mg/L，体积为0. 1 1. 5mL ；所述的无色孔雀石绿浓度为 100 μ g/L,体积为 0. 05 2. OmL ；在上述步骤③中，所述的激发波长或发射波长为400 600nm范围内。在上述步骤①中，制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系完毕后应在试管避光放 置 5 20min。在用荧光光度计进行同步扫描时，选择474nm、484nm、494nm中任一波长测定体系 的光散射强度。本发明的原理是共振瑞利散射(RRS)是瑞利散射位于散射分子吸收带时，由于电子吸收电磁波频 率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量发生的再次散射，其散射强度比单纯 的瑞利散射提高了几个数量级。利用共振瑞利散射原理，即在弱酸性介质中，无色孔雀石绿以阳离子形态存在，与 阴离子发生缔合形成离子缔合物，从而导致体系中电子产生共振，体系共振瑞利散射强度 显著增强，同时在两性表面活性剂的作用下形成稳定的胶束体系，检测灵敏度得到显著提 高。无色孔雀石绿在一定的浓度范围内分别与体系的共振瑞利散射强度呈线性相关。据此 建立了一种灵敏度高、简便快速测定无色孔雀石绿的方法。主要反应如下C23H26N2+H+— (C23H27N2)+ (1)Ii(C23H27N2)++n R~ St (C23H27N2R)n (2)其中，R--代表阴离子，S-代表两性表面活性剂。本发明的优点在于(1)反应在室温下就能进行，反应条件温和，反应时间短，适宜推广；(2)设备简单、操作简便；(3)试剂易得、价廉；(4)灵敏度高、结果准确、应用价值高。
具体实施例方式下面的实施例描述了在HAc-NaAc缓冲液中，有两性离子表面活性剂存在时，无色 孔雀石绿与阴离子结合形成(C23H25N2R)1^合纳米粒子，导致体系共振光增强。据此，建立测 定无色孔雀石绿的新方法。其主要反应如前所述。实施例1 (1)用微量取样器移取0. ImLpH值为3. 5的HAc-NaAc缓冲液于IOmL试管中，在试 管的溶液中依次加入1. 5mL浓度为1. OX 10_3mol/L的13_溶液和已知不同浓度的无色孔雀 石绿0. lmL，摇勻，再加入浓度为10mg/L的椰油酰胺丙基甜菜碱(CAB_35)0. lmL，用乙腈定 容至10mL，避光放置5min，得被测体系；(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，在激发波长等于发射波长，400 600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，在474nm波长处测定体系的光散射强度I和I。，计算ΔΙ = I-Itl的值;(4)根据Δ I对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I = 3. 7221C+23. 097R2 =0. 9992，其中C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μ g/L，线性范围是0. 5 20 μ g/L，R-相 关系数；(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未 知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的Δ I值为29. 211 ；(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1. 643 μ g/ L0实施例2 (1)用微量取样器移取1. OmLpH值为4. 0的HAc-NaAc缓冲液于IOmL试管中，在试 管的溶液中依次加入1. 5mL浓度为1. OX 10_3mol/L的C103_溶液和已知不同浓度的无色孔 雀石绿0. lmL，摇勻，再加入浓度为10mg/L的椰油基二甲基甜菜碱(BS_12)0. 5mL，用乙腈定 容至10mL，避光放置lOmin，得被测体系；(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，在激发波长等于发射波长，400 600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择484nm波长处测定体系的光散射强 度I和10，计算Δ I = I-Itl的值;(4)根据Δ I对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I = 3. 8742C+18. 043 R2 =0. 9992，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μ g/L,线性范围是0. 5 20 μ g/L, R-相关系 数；(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未 知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的Δ I值为24. 389 ；(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1. 638 μ g/ L0实施例3 (1)用微量取样器移取1. 5mLpH值为4. 5的HAc-NaAc缓冲液于IOmL试管中，在试 管的溶液中依次加入0. 5mL浓度为1. OX 10_3mol/L的P043_溶液和已知不同浓度的无色孔 雀石绿0. lmL，摇勻，再加入浓度为10mg/L的月桂酰胺丙基甜菜碱(LAB-30) 1. OmL，用乙腈 定容至10mL，避光放置15min，得被测体系；(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，以激发波长等于发射波长，400 600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择494nm波长处测定体系的光散射强 度I和10，计算Δ I = I-Itl的值;(4)根据Δ I对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I = 3. 5772C+17. 39R2 = 0. 9996，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μ g/L,线性范围是0. 5 20 μ g/L, R-相关系数；(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未 知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的Δ I值为23. 307 ；(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1. 654 μ g/ L0
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具体实施例4 (1)用微量取样器移取2. OmLpH值为5. 0的HAc-NaAc缓冲液于IOmL试管中，在试 管的溶液中依次加入1. OmL浓度为1. OX 10_3mol/L的S2 032_溶液和已知不同浓度的无色孔 雀石绿0. lmL，摇勻，再加入浓度为10mg/L的月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱(LHSB) 1. 5mL，用 乙腈定容至10mL，避光放置20min，得被测体系；(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，以激发波长等于发射波长，400 600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择474nm波长处测定体系的光散射强 度I和10，计算Δ I = I-Itl的值;(4)根据Δ I对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I = 3. 9955C+18. 718R2 = 0. 9990，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μ g/L，线性范围是0. 5 20 μ g/L，R-相关系数；(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未 知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的Δ I值为24. 666 ；(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1. 489 μ g/ L0
权利要求
一种无色孔雀石绿的检测方法，其特征是包括如下步骤①制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系，移取HAc NaAc缓冲液于试管中，再在试管中加入阴离子和已知各浓度的无色孔雀石绿，摇匀，再加入两性离子表面活性剂，用乙腈定容，避光放置；②依照步骤①的方法制备未加入无色孔雀石绿的试剂空白体系；③用荧光光度计在激发波长等于发射波长下进行同步扫描，得到步骤①和②体系的共振瑞利散射光谱，测定样品散射强度I和空白散射强度I0，计算ΔI＝I I0的值；④根据ΔI对应无色孔雀石绿的浓度关系做标准曲线；⑤依照步骤①的方法制备检测体系，其中加入的无色孔雀石绿为含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，求出被测物的ΔI值；⑥依据④的标准曲线，计算出被测物相应ΔI值对应所含的无色孔雀石绿浓度。
2.根据权利要求1所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是在步骤①中，所述HAc-NaAc缓冲液的pH值为3. 5 5. 0，体积为0. 5 2. OmL ；所述阴 离子可以是13_、C103_、Br03_、103_、S2032_、P043_中任意一种，均由相应的钠盐或钾盐配制，浓 度为1.0\10_3!1101/1，体积为0. 05 1.5mL;所述两性离子表面活性剂可以是椰油酰胺丙 基甜菜碱、椰油基二甲基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱中任意 一种，浓度为10mg/L，体积为0. 1 1. 5mL ；所述的无色孔雀石绿浓度为100μ g/L，体积为 0. 05 2. OmL ；在步骤③中，所述的激发波长或发射波长为400 600nm范围内。
3.根据权利要求2所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是制备已知无色孔雀石 绿浓度的测试体系完毕后应在试管避光放置5 20min。
4.根据权利要求2所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是在用荧光光度计进行 同步扫描时，选择474nm、484nm、494nm中任一波长测定体系的光散射强度。
全文摘要
本发明公开了一种检测水产品中无色孔雀石绿的方法，它是在弱酸性的HAc-NaAc缓冲液中加入阴离子、无色孔雀石绿，摇匀，再加入两性表面活性剂，定容，避光放置一段时间，得已知浓度的被测体系，然后用荧光光度计在激发波长等于发射波长，400-600nm范围内进行同步扫描，测得体系的光散射强度I和试剂空白I0，计算ΔI＝I-I0的值，求出被测物的ΔI，再根据工作曲线计算出某未知被测物的无色孔雀石绿。这种方法试剂廉价、易得，反应条件温和，操作简单，设备简单，灵敏度高，易于推广应用。
文档编号G01N21/64GK101949846SQ201010250779
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者李冉, 杨亚玲, 邹艳 申请人:昆明理工大学