专利名称：基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及试剂盒，尤其涉及一种基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫 吸附试剂盒。
背景技术：
氯霉素(ChloramphenicoLCAP)，化学名D-苏式_(-)-Ν-[α-(羟基甲基)-β-羟 基-对硝基苯乙基]-2，2-二氯乙酰胺。其属于广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、阴性菌均有 良好的抑制作用，因而广泛应用于畜牧、水产养殖业。但在动物性食品内残留的CAP对人体 的健康具有潜在的危害。为此，世界上许多国家均制定了氯霉素的最高残留标准，严格限制 其使用。为了适应加入WTO后的国际竞争与挑战，必须建立起一种具有自主知识产权的快 速检测方法。因此开发出一种简单快速，适用于氯霉素残留现场监控的痕量分析具有十分 重要的现实意义。目前对氯霉素残留检测的主要方法有色谱法、微生物法等。其中HPLC法、气相色 谱以及液相色谱-串联质谱等方法虽然具有灵敏、准确等特点，但该类方法前处理较复杂， 所需仪器昂贵，而且需要有熟练的技术人员，难以在基层工作中普及推广。微生物检测方法 操作简单，费用低，但耗时长，敏感性和专一性低，易漏检，也会出现假阳性，引起误判，一般 用于定性检测简便。而免疫分析法具有一定的灵敏度和特异性，而且不需要昂贵的仪器设 备，为氯霉素提供了一个简单实用的分析检测途径。适用于大量样本的快速检测，ELISA检 测方法势必成为检测氯霉素残留的发展趋势。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识 别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛 选融合细胞成为可能。本试剂盒应用杂交瘤技术及重组抗体技术得到氯霉素兔单克隆抗 体，开发出基于兔单克隆抗体的氯霉素间接酶联免疫试剂盒，国内外均未见有报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有高特异性、高灵敏度的基于 兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒。基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒包括盒体和设在盒体 内的96孔酶标板以及试剂，96孔酶标板内包被有氯霉素包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓缩液；(2)稀释浓缩液；(3)氯霉素标准溶液；(4)氯霉素抗体； (5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物；
(8)底物显色液；(9)反应终止液。所述的氯霉素包被抗原为氯霉素与卵清蛋白的偶联产物，氯霉素包被抗原能与抗 氯霉素抗体特异性结合。所述的洗涤浓缩液的组成为氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二钠 3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g、吐温200. 5 Iml和去离子水。所述的稀释浓缩液的组成为 氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g和去离子 水。所述的氯霉素抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤技术以及重组抗 体技术最终得到的。所述的底物显色液为3，3，5，5-四甲基联苯胺配制液。所述的底物稀 释液为PH5. 0柠檬酸缓冲液，pH5. 0柠檬酸缓冲液的组成为3 6g柠檬酸、6 9g磷酸氢 二钠和去离子水。所述的氯霉素标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/ mL、0.625ng/mL或0.3125ng/mL。所述的底物为过氧化氢或过氧化脲。所述的反应终止液 为2M硫酸或盐酸。本发明在氯霉素检测中，IC5tl值为1.06ng/mL，抑制率曲线线性拟合方程y = 39. 705x+48. 946，检测范围在0. 19-6. 05ng/mL之间，最低检测限是0. 10ng/mL。试剂盒中抗 氯霉素抗体具有较高的特异性，除了和琥珀氯霉素酸钠，甲砜霉素，氟甲砜霉素交叉反应率 分别为2. 09%, 18. 10%,12. 45%外，和其他喹诺酮类以及磺胺类药物均无交叉反应。本发明适用于牛奶、蜂蜜等样品中氯霉素残留的检测。该试剂盒能同时检测大批 量样本，方便又快速，对现场监控痕量分析具有十分重要的现实意义；同时使检测成本大大 降低，具有潜在的经济价值。


图1是以PBS缓冲液为基质的氯霉素单抗间接竞争ELISA标准曲线；图2是以牛奶为基质的氯霉素单抗间接竞争ELISA标准曲线。具体的实施方式本发明基于兔单克隆抗体开发氯霉素残留分析的间接酶联免疫吸附试剂盒，该试 剂盒基于免疫反应和酶促反应，能够检测牛奶及蜂蜜等样本中的氯霉素的残留。基于兔单 克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以 及试剂。96孔酶标板内包被有氯霉素包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓缩液；(2)稀 释浓缩液；(3)氯霉素标准溶液；(4)氯霉素抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6) 底物稀释液；(7)底物；(8)底物显色液；(9)反应终止液。所述的氯霉素包被抗原为氯霉素与卵清蛋白的偶联产物，氯霉素包被抗原能与抗 氯霉素抗体特异性结合；所述的洗涤浓缩液的组成为氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g、吐温200. 5 Iml和去离子水。所述的稀释 浓缩液的组成为氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g和去离子水。所述的氯霉素抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤 技术以及重组抗体技术最终得到的。所述的底物显色液为3，3，5，5-四甲基联苯胺配制液。 所述的底物稀释液为PH5. O柠檬酸缓冲液，pH5. O柠檬酸缓冲液的组成为3 6g柠檬酸、 6 9g磷酸氢二钠和去离子水。所述的氯霉素标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL或0. 3125ng/mL。所述的底物为过氧化氢或过氧化脲。所述的 反应终止液为2M硫酸或盐酸。盒内的试剂设置(1)洗涤浓缩液1瓶，25 35mL/瓶，内含有氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g、吐温200. 5 1ml，为正常使用浓度的30 40倍；(2)稀释浓缩液1瓶，25 35mL/瓶，内含有氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、 磷酸氢二钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g，为正常使用浓度的30 40倍；(3)氯霉素标准溶 液(10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. lng/mL、0. 05ng/mL)各 1 瓶，ImL/瓶；(4)氯霉素 抗体1管，25 50 μ 1/管，使用时2000 3000倍稀释；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体 (酶标二抗)1管，50-100 μ 1/管，使用时1000 2000倍稀释；(6)底物稀释液1瓶，25 35mL/瓶，内含3 6g柠檬酸，6 9g磷酸氢二钠，为正常使用量的30-40倍；(7)底物1 瓶，1 5mL/瓶，其为过氧化氢或过氧化脲；(8)底物显色液为四甲基联苯胺配制液1瓶， 2 5mL/瓶，配制方法为IOmgTMB溶于2mLDMS0中；(9)反应终止液1瓶，15 20mL/瓶， 其为2mol/L硫酸或盐酸。实施例1 氯霉素免疫抗原及包被抗原的合成具体操作步骤如下取CAP小分子80mg，溶于1. 5mL无水乙醇中，加入12mL Imo 1/ L盐酸。加入锌粉65mg，70°C水浴加热50min。冷却后，在4°C，pH 1_2条件下逐滴加入 0. 5mol/L NaNO2数滴，避光搅拌，直至淀粉碘化钾试纸呈灰蓝色(溶液I)；称取BSA 150mg, 溶于12mL磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)中，冷却。(溶液II)。然后将I液边搅拌边缓慢加入 II液中，同时加入0. 2mol/L的NaOH溶液，使pH始终保持在7_8左右。4°C搅拌12h，反应 产物用PBS透析5d。包被抗原OVA-CPFX同法制备，用于包被酶标板。氯霉素与载体蛋白的偶联原理如下 实施例2 氯霉素兔单克隆抗体的产生1、兔子的免疫初免将500μ g的免疫抗原与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下 5点注射白兔(ImL/只)；三周后用200yg的免疫抗原与弗氏不完全佐剂混合后同法进 行第二次免疫；以后每两周免疫一次，共免疫3 7次后，血清效价达到64000以上时，用 500 yg的免疫抗原耳缘静脉注射，4天后颈动脉采全血，无菌取脾脏，准备细胞融合。
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2、兔单克隆抗体的制备将兔子脾淋巴细胞与处于对数生长期的240E细胞进行融合，融合剂为50%的 PEG。融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的2X20块96孔细胞 培养板中，置37°0、5%0)2培养箱内培养。2周后预检，发现背景高，换液。一周后，用间接 ELISA法筛选出阳性克隆72个，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中。一周 后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的 杂交瘤细胞9-3。将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于细胞裂解，提取mRNA，构建 质粒，生产抗体。从9-3杂交瘤细胞中分离mRNA，分别克隆其重链和轻链基因。基因经酶切 后与质粒连接，涂板挑取克隆。大肠杆菌过夜培养提取质粒，重链轻链质粒配对转染至293T 细胞进行表达。无菌收集细胞，离心后取上清。小转后获得了 6株CAP单抗质粒。通过间 接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定CAP 9-3H1/L2质粒进入大转生产。采用Protein A 纯化方法纯化并收集CAP单克隆抗体，共得IOmL CAP单抗，IgG浓度为1. 23mg/mL。实施例3 酶标板的包被氯霉素包被抗原用pH9. 6,0. 05mol/L碳酸盐缓冲液(含2. 93g碳酸氢钠和1. 59g 碳酸钠，溶于双蒸水或超纯水1L)稀释成0. 2 μ g/mL，在酶标板的每孔加50 μ L，4°C包被12h 或37°C包被2h，倾去包被液体，用PBST洗涤3 5次，拍干，然后在每孔中加入250 μ L 3% 脱脂乳，37°C封闭1小时，取出后洗涤3 5次，干燥封膜后保存。实施例4 试剂盒的测定原理首先将氯霉素与大分子载体蛋白偶联制成复合物作为包被抗原，并使包被抗原结 合到某种固相载体表面。然后加入氯霉素标准溶液或待测的样本(含待测的稀释样本)及 氯霉素兔单克隆抗体，氯霉素标准溶液或待测样本与氯霉素的包被抗原竞争性结合氯霉素 抗体，与包被抗原结合的抗体在加入酶标二抗后可以显现出颜色，与游离的氯霉素小分子 结合的抗体在洗涤时被除去。最后加入底物显色，氯霉素标液或样本中氯霉素含量越多，与 固相抗原结合的抗体就越少，最后的发色反应减弱，抵制率就越高；反之，则发色反应增强， 抑制率减低，因而先根据已知量氯霉素的标准溶液获得抑制率与氯霉素含量之间的半对数 关系作图即得到标准曲线，再根据样本的抑制率来推出待测样本的浓度。实施例5 待测样本的前处理A、牛奶检测样品的前处理新鲜牛奶，于4°C下5000r/min离心20min，弃去上层脂肪，取下层清液，加入 0. 3yL 17%的铁氰化钾溶液，摇勻后再加入0.3μ L 52%的硫酸锌溶液，迅速摇勻。5000r/ min离心15min，取上清液用PBS做一定稀释待用。B、猪尿样品的前处理猪尿高速离心lOmin，取上层清夜，5倍稀释，待用。实施例6 检测氯霉素试剂盒的使用(1)试剂配制A、稀释浓缩液试剂盒中稀释浓缩液用超纯水或蒸馏水稀释30 40倍后使用。B、洗涤浓缩液试剂盒中洗涤浓缩液用超纯水或蒸馏水稀释30 40倍后使用。C、底物稀释液试剂盒中底物稀释液用超纯水或蒸馏水稀释30 40倍后使用。(2)试剂盒操作过程如下
A、试剂盒使用前需要室温稳定半小时以上。B、取出酶标板，加入50 μ L标样或待处理样本加入到各自孔中，标样和样本同时 做2-4个重复，然后加入50 μ L稀释好的氯霉素抗体，37°C孵育1小时。C、倒出孔中的液体，将微孔板倒置于吸水纸上拍打，以保证完全除去孔内的液体， 用300 μ L洗涤液洗涤3 5次，拍干。D、加入稀释好的酶标二抗100 μ 1，反应50分钟。Ε、取底物显色液200 μ L加于底物缓冲液IOmL中，再加入0. 02%底物过氧化氢，振 荡均勻后，每孔加入100 μ L以上配制好的显色溶液，轻微振板，37°C暗处孵育15min。F、加入50 μ L终止液，测定OD45tl值判定结果。G、根据不同浓度标样的OD值计算抑制率，绘制ELISA标准曲线。H、根据样本测定的OD45tl值和稀释倍数，通过标准曲线计算样本中氯霉素的测定 含量ng/mL(即ppb，以ImL液体为Ig计算)。样本中氯霉素含量=分析浓度X稀释倍数
(ppb) ο实施例7 =ELISA试剂盒测定结果1、ELISA标准曲线及灵敏度以标准品浓度对数值为横坐标，相对的BZiBciX 100%值为纵坐标绘制线性标准曲 线(Btl 标准品浓度为Ong/mL所对应的吸光值；B 其它各浓度所对应的吸光值)。曲线上测 得达到50%抑制率时所对应的氯霉素小分子的浓度值即为灵敏度。从图1氯霉素ELISA平 均测定的标准曲线中可知该曲线在0.3125 lOng/mL之间有良好的线性，达到10%抑制率 氯霉素的浓度值为0. lOng/mL，有较理想的灵敏度，IC5tl值为1. 06ng/mL。2、ELISA 的特异性采用间接竞争ELISA法，将与氯霉素结构相似的药物，如氯霉素琥珀酸钠、甲砜霉 素、氟甲砜霉素以及一些常见的喹诺酮类药物和磺胺类药物与氯霉素兔单克隆抗体同时加 入到96孔酶标板中，以抑制率为纵坐标，各样品浓度对数为横坐标绘制标准曲线，分别计 算各自的IC5tl值。再根据氯霉素兔单克隆抗体相对氯霉素小分子的IC5tl值与氯霉素兔单克 隆抗体相对各种竞争物的IC5tl值的比值即得到交叉反应率(CR% )。对其它药物的交叉率 结果见表1 表3。CR% = IC50氯霉素/IC5tl其他竞争小分子X 100%表1与结构相似药物的交叉反应性 表2与部分喹诺酮类药物的交叉反应性
表3与部分磺胺类药物交叉反应性 3、ELISA的精确度与准确度测定添加氯霉素到牛奶中使其浓度为lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL每个浓度设 四个重复进行测定；在猪尿中添加氯霉素使其浓度为2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL，每个浓度设 四个重复分别进行测定。由于用PBS缓冲体系建立的标准曲线在检测牛奶时回收率不理想，因此本实验 建立了以牛奶为基质，添加氯霉素标准液的标准曲线。从图2中可以看出，小分子浓度在 0. 5ng/mL-20ng/mL间曲线线性拟合良好，R2 = 0. 9883。用外标法对对间接ELISA法测定牛 奶样品的准确度进行了检测。结果(表4)表明，回收率在75.40%-117.00之间，变异系数 介于5. 57% -16. 39%，满足检测需要。 表4牛奶ELISA准确性试验结果 应用外标法，以PBS缓冲液建立的标准曲线为依据，对间接ELISA法测定猪尿样品 的准确度进行了试验。结果(表5)表明，将猪尿稀释5倍并添加氯霉素标准液使其浓度达到8ng/mL，4ng/mL，2ng/mL的平均回收率分别为79. 38%,89. 50%和114. 50%，变异系数分 别为9. 76%，6. 98%，1. 75%。回收率和变异系数均满足ELISA检测要求。表5猪尿中ELISA准确性试验结果 846.35±0.6279.389.76 443.58士0.2589.506.98 242.29±0.0权利要求
一种基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以及试剂，96孔酶标板内包被有氯霉素包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓缩液；(2)稀释浓缩液；(3)氯霉素标准溶液；(4)氯霉素抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物；(8)底物显色液；(9)反应终止液。
2.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的氯霉素包被抗原为氯霉素与卵清蛋白的偶联产物，氯霉素包被抗原能与 抗氯霉素抗体特异性结合。
3.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的洗涤浓缩液的组成为氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二 钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g、吐温20 0. 5 Iml和去离子水。
4.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的稀释浓缩液的组成为氯化钠7 9g、磷酸二氢钾0. 1 0. 3g、磷酸氢二 钠3 5g、氯化钾0. 1 0. 3g和去离子水。
5.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的氯霉素抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤技术以 及重组抗体技术最终得到的。
6.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的底物显色液为3，3，5，5-四甲基联苯胺配制液。
7.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的底物稀释液为PH5. 0柠檬酸缓冲液，pH5. 0柠檬酸缓冲液的组成为3 6g柠檬酸、6 9g磷酸氢二钠和去离子水。
8.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂 盒，其特征在于所述的氯霉素标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、 0. 625ng/mL 或 0. 3125ng/mL。
9.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒， 其特征在于所述的底物为过氧化氢或过氧化脲。
10.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂 盒，其特征在于所述的反应终止液为2M硫酸或盐酸。
全文摘要
本发明公开了一种基于兔单克隆抗体的氯霉素残留分析酶联免疫吸附试剂盒。它包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以及试剂，96孔酶标板内包被有氯霉素包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓缩液；(2)稀释浓缩液；(3)氯霉素标准溶液；(4)氯霉素抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物；(8)底物显色液；(9)反应终止液。本发明适用于牛奶、猪尿等样本中氯霉素残留的检测。该试剂盒能同时检测大批量样本，方便又快速，对现场监控痕量分析具有十分重要的现实意义；同时使检测成本大大降低，具有潜在的经济价值。
文档编号G01N33/577GK101915840SQ20101023170
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者倪庚, 刘娜, 郑晓冬, 陆蕾 申请人:浙江大学