专利名称：高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定蜂胶中氯霉素残留量的方法，尤其是涉及一种高效液相色谱 串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法，主要用于对蜂胶中氯霉素药物残留量进行检 查，同时也适用于对蜂王浆、蜂蜜中氯霉素药物残留量进行检查。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol)是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，为广谱抑菌剂。 由于其对血液系统的毒性较大，被欧盟、日本、美国等国禁止用于动物源性食品。氯霉素检测方法主要有LC/MS/MS法、GC/MS法、GC法、ELISA法、HPLC法和CHARM II法等，如SN/T 2063-2008中的进出口蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法和农业部781 号公告-2-2006中的动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱均属于LC/MS/MS 法，如农业部781号公告-10-2006中的蜂蜜中氯霉素残留量的测定气相色谱法和GB/ T 22338-2008中的动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定均属于GC/MS法，如农业部 1025号公告-21-2008中的动物源食品中氯霉素残留检测气相色谱法属于GC法，如SN/T 2058-2008中的进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法属于ELISA法，如由吴华、黄鸿和欧 剑峰等发表在四川化工2009年第12卷第3期第40-42页上的高效液相色谱法测定蜂蜜 中氯霉素残留量的研究和由潘莹宇、许茜和康学军等发表在色谱2005年第23卷第6期第 577-580页上的高效液相色谱_荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量均属于HPLC法，如 SN/T1966-2007上的水产品中氯霉素残留检测方法属于CHARM II法。由上可知，液相色谱-串联质谱方法作为确证方法已经广泛被国内外政府监督检 验机构运用，其在灵敏度、准确度、检测效率上所具有的独特优势，已成为目前最优越性的 残留检测仪器设备，用于检测动物源性食品中氯霉素残留量时，其检测限可以达到0. 1 μ g/ kg，相关文献报道已经很多。但是，由于不同种类的样品成分不一样，样品净化程度也不同， 在使用液相色谱-串联质谱方法时，并非所有的样品都能够达到0. 1 μ g/kg这个检出限， 例如使用已有的可以测定氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱方法测定蜂胶中氯霉素残 留量时，其检测限远达不到0. 1 μ g/kg，这是因为蜂胶中的成分有近千种，国内还没有理想 的方法作为蜂胶中氯霉素残留量检测标准，国内也未见蜂胶中氯霉素残留量检测的相关文 献。综上所述，目前还没有一种方法简单、准确，检测成本低，检测效率高，检测限能达 0. 1 μ g/kg的用于测定蜂胶中氯霉素残留限量的方法，在蜂胶检测中难以满足国外对蜂胶 中氯霉素残留限量的要求。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种方法简单，检测 成本低，检测效率高，检测限能达0. 1 μ g/kg的高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素 残留量的方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是该高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中 氯霉素残留量的方法的特点在于该方法所用到的原料包括纯度大于99.0%的氯霉素标 准品，浓度为100mg/l的D5-氯霉素标准品，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氢氧化钠，为 优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈，蜂胶样品；该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温 度为600°C，辅助加热气为55. OOpsi，干燥气为65. OOpsi，气帘气为25. OOpsi，碰撞气 为5. OOpsi,电喷雾电压为-4100. 00V,离子化法为负离子模式；所述高效液相色谱仪为 Agilent 1200series，色谱柱为 Hypersil 0DS2，色谱柱的规格为 4. 6mmX 150mm，5 μ m，柱温 为30°C，进样量为20μ 1 ；该方法包括标准溶液制备工序、标准曲线制作工序、蜂胶样液制备工序和氯霉素 残留量检测工序；所述标准溶液制备工序如下a、氯霉素贮备标准溶液配制步骤称取氯 霉素标准品IOmg用乙腈定容至IOml配成浓度为1000mg/L的氯霉素贮备标准溶液，将该氯 霉素贮备标准溶液置于-18°C以下保存待用；b、氯霉素中间标准液配制步骤取a中的氯霉 素贮备标准溶液100 μ 1用乙腈定容至IOml配成浓度为10mg/L的氯霉素中间标准液；C、氯 霉素氘代内标中间液配制步骤采用D5-氯霉素标准品代替氯霉素标准品，重复上述a步骤 和b步骤，制得浓度为10mg/L的氯霉素氘代内标中间液；d、临时标准使用液配制步骤取 氯霉素中间标准液用体积浓度为30 %的乙腈水溶液配至5 μ g/kg和50 μ g/kg，取氯霉素氘 代内标中间液用体积浓度为30%的乙腈水溶液配至200μ g/kg ；所述标准曲线制作工序中，取标准溶液制备工序中制得的氯霉素贮备标准溶液、 氯霉素中间标准液、氯霉素氘代内标中间液和临时标准使用液，通过高效液相色谱仪和三 重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；所述蜂胶样液制备工序中，取蜂胶样品2g和浓度为200μ g/kg的D5-氯霉素标准 品内标50ul置于一号50ml离心塑料瓶中并充分混合，然后静置5min以上，再向一号50ml 离心塑料瓶中加入5ml浓度为lmol/L的NaOH溶液并不断振荡提取5min，使蜂胶样品充分 溶解，然后向一号50ml离心塑料瓶中加入5ml水并摇勻，再向一号50ml离心塑料瓶中加入 IOml浓度为5%的HClO4进行酸化并充分摇勻而制得蜂胶液；该蜂胶液先在常温下超声提 取5min，再在转速为3000rpm下离心5min而得到上层离心液，然后对上层离心液进行过滤 而制得滤液；取滤液IOml置于二号50ml离心塑料瓶中，用浓度为lmol/L的NaOH溶液将 滤液的PH值调节到10. 5，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入IOml乙酸乙酯并充分混合 3min,在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层，然后将乙酸乙酯层置于15ml塑料 离心管中，该乙酸乙酯层在35°C下进行氮气吹干，再向15ml塑料离心管中加入体积浓度为 30%的乙腈水溶液Iml并进行超声溶解，然后向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并充分 混合而制得离心液，将该离心液在转速为SOOrpm下离心2min而得到下层样液，最后将下层 样液过0. 22 μ m的滤膜而制得蜂胶样液；所述氯霉素残留量检测工序中，取蜂胶样液制备工序中制得的蜂胶样液，通过高 效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测 得蜂胶中氯霉素的残留量；该方法的检测限为0. 1 μ g/kg，定量限为0. 3 μ g/kg。本发明该方法所使用的水为双重蒸馏水。
本发明所述蜂胶样液制备工序中，向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为lmol/L 的NaOH溶液溶解蜂胶样品，然后用水稀释以释出蜂胶样品中的氯霉素残留物，再用HClO4 进行酸化以沉淀蜂胶样品中的蜂胶成分。本发明所述蜂胶样液制备工序中，蜂胶样液用浓度为lmol/L的NaOH溶液将滤液 的PH值调节到10. 5，乙酸乙酯层在35°C下采用氮吹仪进行氮气吹干，再向15ml塑料离心 管中加入体积浓度为30%的乙腈水溶液Iml并采用超声波仪进行超声溶解。本发明与现 有技术相比，具有以下优点和效果本发明用于测定蜂胶中氯霉素药 物的残留量，与固相萃取方法相比不增加溶剂用量，不采用固相萃取小柱，净化后的样品无 色透明，在质谱图上无干扰，连续进样70次后，三重四极杆串联质谱仪中的离子源气帘板 仍保持干净。本发明的检测限为0. 1 μ g/kg，定量限为0. 3 μ g/kg，线性相关系数为0. 9999， 回收率在82. 0-108. 2 %，相对标准偏差在5. 35-14. 2 %，精密度良好，完全能够满足进口国 对蜂胶中氯霉素药物残留限量的要求。本发明充分发挥了质谱的优势，利用简单、快捷的样品净化方法，通过优化液相、 质谱条件，减少样品基质干扰，使方法达到了足够的灵敏度。本方法同时适用于蜂王浆、蜂 蜜中氯霉素药物残留量的检测，由于样品预处理的成本低廉，特别适合企业基层对收购、生 产全过程进行质量控制，有利于提高蜂王浆、蜂蜜的质量。


图1是本发明实施例中蜂胶阴性样品添加1. 0 μ g/kg标准浓度时，用LC/MS/MS测 定蜂王浆中硝基咪唑类药物残留的总离子流图；图2是本发明实施例中蜂胶阴性样品添加1. 0 μ g/kg标准浓度时，用LC/MS/MS测 定蜂王浆中硝基咪唑类药物残留的提取离子流图。
具体实施例方式下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发 明的解释而本发明并不局限于以下实施例。实施例参见图1和图2，本实施例中高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的 方法包括标准溶液制备工序、标准曲线制作工序、蜂胶样液制备工序和氯霉素残留量检测 工序。本实施例所用到的原料包括水，纯度大于99. 0%的氯霉素标准品，浓度为IOOmg/ 1均来自德国Dr. Ehrenstorfer公司的D5-氯霉素标准品，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯 的氢氧化钠、甲醇、氯化钠和无水硫酸钠，为优级纯的正己烷和甲酸，为液相色谱纯的乙腈 和乙酸铵，待检测的蜂胶样品。其中所用的水为双重蒸馏水。本实施例所用到的设备包括API3200三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线 脱气机、自动进样器、Analyst数据处理软件的高效液相色谱仪，Sartorius BS224S分析天 平，PHS-3C雷磁精密pH计，无锡市瑞江分析仪器有限公司RJ-TDL-40B低速台式大容量离 心机，Organomation N-EVAP 111氮吹仪，超声波仪。其中三重四极杆串联质谱仪中的离子 源温度为600°C，辅助加热气为55. OOpsi，干燥气为65. OOpsi，气帘气为25. OOpsi，碰撞气 表2三重四极杆串联质谱仪的氯霉素残留测定参考质谱条件表 注表中带下划线黑体字为定量离子。本实施例的蜂胶样液制备工序中，先称取蜂胶样品2g置于一号50ml离心塑料瓶 中，再取浓度为200y g/kg的氯霉素氘代内标临时标准使用液50ul置于一号50ml离心塑 料瓶中，将200y g/kg的氯霉素氘代内标临时标准使用液和蜂胶样品充分混合，静置5min 以上，然后向一号50ml离心塑料瓶中加入5ml浓度为lmol/L的NaOH溶液并不断振荡提取 5min，使蜂胶样品充分溶解，再向一号50ml离心塑料瓶中加入5ml水并摇勻，然后向一号
为5. OOpsi,电喷雾电压为-4100. 00V,罔子化法为负罔子模式；所用的高效液相色谱仪为 Agilent 1200series，色谱柱为 Hypersil 0DS2，色谱柱的规格为 4. 6mmX 150mm，5 ii m，柱温 为30°C，进样量为20iU。本实施例中的标准溶液制备工序包括如下步骤a、氯霉素贮备标准溶液配制步 骤称取氯霉素标准品10mg置于10ml容量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成浓度为lOOOrng/ L的氯霉素贮备标准溶液，然后将该氯霉素贮备标准溶液置于_18°C以下保存待用；b、氯霉 素中间标准液配制步骤取a中的氯霉素贮备标准溶液100 yl置于10ml容量瓶中，用乙 腈定容至10ml而配成浓度为10mg/L的氯霉素中间标准液；c、氯霉素氘代内标中间液配制 步骤称取D5-氯霉素标准品10mg置于10ml容量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成浓度为 1000mg/L的D5-氯霉素贮备标准溶液，然后取D5-氯霉素贮备标准溶液100 yl置于10ml容 量瓶中，用乙腈定容至10ml而配成浓度为10mg/L的氯霉素氘代内标中间液；d、临时标准使 用液配制步骤取氯霉素中间标准液用体积浓度为30%的乙腈水溶液配制成浓度为5 y g/ kg的氯霉素临时标准使用液和浓度为50P g/kg的氯霉素临时标准使用液，取氯霉素氘代 内标中间液用体积浓度为30%的乙腈水溶液配制成浓度为200y g/kg的氯霉素氘代内标 临时标准使用液。本实施例的标准曲线制作工序中，取标准溶液制备工序中制得的氯霉素贮备标准 溶液、氯霉素中间标准液、氯霉素氘代内标中间液和临时标准使用液，通过高效液相色谱仪 和三重四极杆串联质谱仪测出相关参数，进而得到标准曲线。高效液相色谱仪采用液相梯 度程序，表1为高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表，三重四极杆串联质谱仪的氯霉素 残留测定参考质谱条件见表2，表1和表2的内容如下表1高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表50ml离心塑料瓶中加入10ml浓度为5%的HC104进行酸化并充分摇勻而制得蜂胶液。该蜂 胶液先在常温下通过超声波仪进行超声提取5min，再通过离心机以转速为3000rpm的条件 下离心5min，蜂胶液出现分层而得到上层离心液，然后对上层离心液进行过滤而制得滤液。 取滤液10ml置于二号50ml离心塑料瓶中，用浓度为lmol/L的NaOH溶液将滤液的pH值调 节到10. 5，通过对滤液pH的调节而达到净化滤液的目的，而且滤液净化的整个过程都无需 使用固相萃取小柱，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min，通 过离心机在转速为3000rpm的条件下离心2min而得到乙酸乙酯层，然后将乙酸乙酯层置于 15ml塑料离心管中，并在35°C下采用氮吹仪对乙酸乙酯层进行氮气吹干，再向15ml塑料离 心管中加入体积浓度为30%的乙腈水溶液1ml并通过超声波仪进行超声溶解，然后向15ml 塑料离心管中加入2ml正己烷并充分混合去脂而制得离心液，再通过离心机将该离心液在 转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，最后将下层样液过0. 22 y m的滤膜而制得蜂 胶样液。本实施例氯霉素残留量检测工序中，取蜂胶样液制备工序中制得的蜂胶样液，使 用高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线 而测得蜂胶中氯霉素的残留量。本实施例对蜂胶样品的净化方法进行了优化，由于氯霉素在中性水溶液中不溶， 溶于有机溶剂，此为液液萃取净化蜂胶样品提供了理论支持，使得蜂胶中氯霉素残留量的 测定方法可以不用固相萃取技术，降低了检测成本，而溶剂的消耗量并没有增加，本发明根 据这一特点，在药物呈电中性时用有机溶剂进行液液萃取，从而达到对蜂胶样品进行净化 的目的。蜂胶样品不溶于水，溶于质量浓度为2%的NaOH、甲醇、乙醇等，要提取、净化与富 集蜂胶中的氯霉素，必须先将蜂胶样品溶化方可用溶剂进行提取，由于绝大多数文献资料 都采用乙酸乙酯来提取蜂胶样品中的氯霉素，而乙酸乙酯与甲醇、乙醇是互溶的，与水是不 互溶的，氯霉素在碱性条件下又比较稳定，故本发明优先选用先将蜂胶样品溶于NaOH溶液 中，再用乙酸乙酯来提取。经过试验，用NaOH溶解蜂胶样品后直接用乙酸乙酯来提取蜂胶样品中的氯霉素 时，提取的氯霉素中的杂质多，这是因为蜂胶样品中的碱溶部分同时也溶于乙酸乙酯，故考 虑将碱溶解的蜂胶样品进行酸化，去除蜂胶样品中的大部分碱溶组分，此时蜂胶样品中的 氯霉素仍溶解在水相中，过滤后样液的PH值分别调节到4、6、8和10. 5，再使用乙酸乙酯对 蜂胶样品中的氯霉素进行提取，发现样液的PH值为10. 5时，净化的样液无色，表明净化效 果良好。在进行定量分析时，若将蜂胶样品进行酸化后采用水来定容就容易产生气泡，若 此时采用甲醇、乙醇来消泡，则会导致杂质增多，故不易采用，不过可以考虑采用其它硅酮 类消泡剂。本发明采用内标方法进行定量，定量加入试剂，因为蜂胶样品不溶于酸，所以可 以忽略蜂胶样品带来的体积影响，试剂的加入体积，即为样液体积。为了进一步净化蜂胶样 品，本发明对进样前的样液进行脱脂处理，采用了烃类中的正己烷作为脱脂溶剂。本实施例对高效液相色谱仪的液相色谱条件进行了优化，为了保证不同性质的多 残留在色谱柱上的分离效率，本方法研究了 Hypersil、Akasil、Venusil MP,Shim-pack VP、 Intersil等型号的色谱柱，发现Hypersil 0DS2色谱柱的分离度好、灵敏度高、峰形窄而对
8称。本发明的流动相采用了常用的酸性水相和有机相并作梯度洗脱，以提高分离度和 灵敏度，常用酸主要有甲酸、乙酸，我们根据掌握的信息和实际情况，研究流动相中不同浓 度的甲酸或乙酸对分离效果的影响，分别用体积浓度(V/V)为0. 1%、0.2%、0.4%、1.0% 的甲酸或乙酸，并选择合适的挥发性盐类，提高离子化效率，以获得分离良好，峰形对称、信 号强度大、灵敏度高的色谱图，结果体积浓度为0. 的乙酸作为流动相的信号最强，加入 5mmol/L的乙酸铵后色谱信号得到增强，提高了灵敏度。本发明采用不同的梯度条件，分析色谱柱对多残留的色谱行为，优选出最佳的梯 度条件，同时优化流动相的流速、柱温，以取得最优的色谱图，优化结果参见表1。本实施例对三重四极杆串联质谱仪的质谱条件进行了优化，配制浓度为lmg/L的 各种残留标准溶液，用针泵以L/mL的流速进入质谱仪，以正离子模式进行QlMS(Ql)全 扫描，确定分子离子峰，调节离子源电压、DP、FP参数，再以分子离子峰作为母离子，进行子 离子扫描，调节CE参数，使母离子的强度占子离子强度的1/3 1/4为最佳，从质谱图中选 择2-4个信号较强的子离子作为定性离子，离子丰度最强的子离子为定量离子，采用针泵 流动注射标准溶液，手动运行RAMP进行参数优化。质谱参数确定后，连接液相色谱进样，由于各种残留的离子源温度、辅助加热气、 干燥气、气帘气、电喷雾电压等参数在单纯质谱条件下是不一样的，因此选择适中的一组参 数在液相条件下再进行优化，在本实施例的液相条件下进样2 u g/kg的混标，再逐个进行 优化与微调，使各种物质的灵敏度、峰形达到最佳。下面来对本发明的线性范围、检出限、回收率和精密度进行分析，用体积浓度为 30 %的乙腈水溶液配制成氯霉素浓度为0. 3 u g/kg、0. 5 u g/kg、1 u g/kg,5 u g/kg、10 u g/ kg系列的标准溶液，含内标5 u g/kg,按照本发明设定的色谱条件进样测定。以y表示峰 面积(A)，以x表示浓度C (u g/kg)，用EXCEL软件求得回归方程和线性相关系数，得到线性 范围，氯霉素的线性范围为0. 3 u g/kg-10 u g/kg,线性相关系数为0. 9999，以信噪比S/N = 3对应浓度确定氯霉素残留的检出限为0. 1 u g/kg,以信噪比S/N = 10对应浓度确定氯霉 素残留的定量限为0. g/kg，此处所说的信噪比S/N为现有技术，采用信噪比S/N结合对 应浓度确定氯霉素残留的检出限和定量限对本领域技术人员来说为公知常识，此处不再详 述。在蜂王浆阴性样品中，分别添加0. 3 u g/kgUu g/kg,5 u g/kg这3个浓度的氯霉 素残留标准品，按本方法进行样品的处理与测定，确定本方法的回收率和相对标准偏差，具 体结果参见表3。表3氯霉素在蜂胶样品中添加不同浓度的回收率表(n = 3) 本发明对蜂胶样品预处理的成本低廉，操作简单、快捷，连续进样70次后，三重四 极杆串联质谱仪中的离子源气帘板仍保持干净，特别适合企业基层对收购、生产全过程进 行质量控制。本发明的检测限为0. 1 u g/kg，定量限为0. 3 u g/kg，线性相关系数为0. 9999， 回收率在82. 0-108. 2%，相对标准偏差在5. 35-14. 2%，精密度良好，完全能够满足进口国 对蜂胶中氯霉素药物残留限量的要求。虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟 悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本 发明的保护范围。
权利要求
一种高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法，其特征在于该方法所用到的原料包括纯度大于99.0％的氯霉素标准品，浓度为100mg/l的D5-氯霉素标准品，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氢氧化钠，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈，蜂胶样品；该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为600℃，辅助加热气为55.00psi，干燥气为65.00psi，气帘气为25.00psi，碰撞气为5.00psi，电喷雾电压为-4100.00V，离子化法为负离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Hypersil ODS2，色谱柱的规格为4.6mm×150mm，5μm，柱温为30℃，进样量为20μl；该方法包括标准溶液制备工序、标准曲线制作工序、蜂胶样液制备工序和氯霉素残留量检测工序；所述标准溶液制备工序如下a、氯霉素贮备标准溶液配制步骤称取氯霉素标准品10mg用乙腈定容至10ml配成浓度为1000mg/L的氯霉素贮备标准溶液，将该氯霉素贮备标准溶液置于-18℃以下保存待用；b、氯霉素中间标准液配制步骤取a中的氯霉素贮备标准溶液100μl用乙腈定容至10ml配成浓度为10mg/L的氯霉素中间标准液；c、氯霉素氘代内标中间液配制步骤采用D5-氯霉素标准品代替氯霉素标准品，重复上述a步骤和b步骤，制得浓度为10mg/L的氯霉素氘代内标中间液；d、临时标准使用液配制步骤取氯霉素中间标准液用体积浓度为30％的乙腈水溶液配至5μg/kg和50μg/kg，取氯霉素氘代内标中间液用体积浓度为30％的乙腈水溶液配至200μg/kg；所述标准曲线制作工序中，取标准溶液制备工序中制得的氯霉素贮备标准溶液、氯霉素中间标准液、氯霉素氘代内标中间液和临时标准使用液，通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；所述蜂胶样液制备工序中，取蜂胶样品2g和浓度为200μg/kg的D5-氯霉素标准品内标50ul置于一号50ml离心塑料瓶中并充分混合，然后静置5min以上，再向一号50ml离心塑料瓶中加入5ml浓度为1mol/L的NaOH溶液并不断振荡提取5min，使蜂胶样品充分溶解，然后向一号50ml离心塑料瓶中加入5ml水并摇匀，再向一号50ml离心塑料瓶中加入10ml浓度为5％的HClO4进行酸化并充分摇匀而制得蜂胶液；该蜂胶液先在常温下超声提取5min，再在转速为3000rpm下离心5min而得到上层离心液，然后对上层离心液进行过滤而制得滤液；取滤液10ml置于二号50ml离心塑料瓶中，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将滤液的pH值调节到10.5，然后向二号50ml离心塑料瓶中加入10ml乙酸乙酯并充分混合3min，在转速为3000rpm下离心2min而得到乙酸乙酯层，然后将乙酸乙酯层置于15ml塑料离心管中，该乙酸乙酯层在35℃下进行氮气吹干，再向15ml塑料离心管中加入体积浓度为30％的乙腈水溶液1ml并进行超声溶解，然后向15ml塑料离心管中加入2ml正己烷并充分混合而制得离心液，将该离心液在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，最后将下层样液过0.22μm的滤膜而制得蜂胶样液；所述氯霉素残留量检测工序中，取蜂胶样液制备工序中制得的蜂胶样液，通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线制作工序中得到的标准曲线而测得蜂胶中氯霉素的残留量；该方法的检测限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法，其特征在于该方法所使用的水为双重蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法， 其特征在于所述蜂胶样液制备工序中，向一号50ml离心塑料瓶中加入浓度为lmol/L的 NaOH溶液溶解蜂胶样品，然后用水稀释以释出蜂胶样品中的氯霉素残留物，再用HC104进行 酸化以沉淀蜂胶样品中的蜂胶成分。
4.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方 法，其特征在于所述蜂胶样液制备工序中，蜂胶样液用浓度为lmol/L的NaOH溶液将滤液 的PH值调节到10. 5，乙酸乙酯层在35°C下采用氮吹仪进行氮气吹干，再向15ml塑料离心 管中加入体积浓度为30%的乙腈水溶液1ml并采用超声波仪进行超声溶解。
全文摘要
本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中氯霉素残留量的方法，目前还没有检测成本低，检测限达0.1μg/kg的测定方法。本发明包括标准溶液制备、标准曲线制作、蜂胶样液制备和氯霉素残留量检测工序；蜂胶样液制备工序中加入1mol/L的NaOH溶液溶解蜂胶样品，用水稀释以释出蜂胶样品中的目标物，再用HClO4进行酸化以沉淀蜂胶样品中的蜂胶成分，蜂胶样液用1mol/L的NaOH溶液将滤液的pH值调节到10.5；最后将蜂胶样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪测得氯霉素的残留量。本发明检测成本低，检测效率高，检测限能达0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg，线性相关系数为0.9999。
文档编号G01N30/72GK101865886SQ201010181330
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者周萍, 毛增亮, 钱志来, 陈建清 申请人:杭州蜂之语蜂业股份有限公司