专利名称：快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物及检测方法
技术领域：
本发明涉及组合物，特别涉及一种快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物及检测方法。
有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂杀虫剂是第二次世界大战后开始发展起来的，并是发展速度最快的一类杀虫药剂，仅有机磷类杀虫剂全世界已有300-400种原药，其广泛使用的基本品种近10种，占整个杀虫剂基本品种的70％，国内至今也有数十个品种投入生产，由于这类杀虫剂具有品种多、药效高、用途广等优点，因此在目前使用的杀虫剂中占有重要的地位。在我国市场供应品种的农药杀虫剂中，50％以上属于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，但其生产的总吨数远大于其他杀虫剂品种，使用量占总量的70％以上，这类杀虫剂因价格低、产生抗药性的速度和程度均低于拟除虫菊酯类杀虫剂，颇受农民欢迎，但因此，假货劣货也比较多。近年来伪劣农药坑害农事件的报道多见报端，已造成严重的损失和极坏的影响。管理好农资产品的生产和流通，实数当务之急，对于农药类的质量，虽已有必要的检测方法和手段，但多局限于在特定的实验室内进行，技术监督部门乃至用户缺少快速、便捷的检测方法及时对农药的真伪作出判断，目前尚未发现国内外有关农药快速检验技术研究的报道，更未见到市场上有此类商品出售，北京市商委和农办都要求我局提供农药快速定性检测的手段，为此发明者开展这方面的研究工作，其目的在于为技术监督部门、农资流通领域的有关单位，乃至农业生产用户提供一种快速便捷的鉴别真假伪劣的定性检测方法和实用手段。目前现有技术中用酶抑制法判别农药有效成分已有一些研究，但并未实用化。没有进入实用的原因主要是生物酶灵敏度高但稳定性差，难以长时间保存。
因此，本发明的主要目的是为了提供一种能够减少实验室内仪器分析的工作量，在短时间内对大量有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂进行筛选的手段，通过该手段可检测出的少量不合格的产品，然后再进行仪器分析；另一方面，该手段也可以作为农药经营部门或使用部门甚至农民对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂进行初步检验的方法。
具体的本发明的目的体现在提供提取容易、成本较低、灵敏度较高而且可以长时间保存的酶；提供最佳的底物和显色剂；提供快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，提供快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂检测方法。
本发明主要研究能对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂杀虫剂的进行现场快速定性检验方法及其使用的组合物，其中方法如试纸法，其为技术监督部门乃至用户提供一种便捷的现场检验方法和手段，及时对此类农药杀虫剂的真伪作出定性判断，保证农业生产免受损失。
其中，本发明所提供的酶包括种子酶或生物酶，如面粉羧酸酯酶、马血清丁酰胆碱酯酶、家蝇乙酰胆碱酯酶或家蝇羧酸酯酶，其中，各种酶的制备及、固化、测定、选择方法在以下有详细叙述。
其中，本发明所提供的底物包括按一定比例组合的α-NA和β-NA，显色剂为固兰B，其中α-NA和β-NA的最佳配比为2∶1。
因此，本发明所提供的组合物的组成包括α-NA、β-NA、固兰B、KH2PO4、Na2HPO4、Ma2S2O3及酶。
本发明所提供的组合物的组成配比(重量份数表示)为组份 配比α-NA0-200；β-NA0-200；固兰B0.1-1000；KH2PO40-1000；Na2HPO40-1000；Ma2S2O30-1000；酶 0.001-1。
本发明所提供的组合物的组成的优选配比(重量份数表示)为组份 配比α-NA 0.18；β-NA 0.09；固兰B 50；KH2PO481.2；Na2HPO49.47；Ma2S2O31.43；酶 0.05。
本发明所提供的快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂检测方法为将按上述配比混合制成粉剂分装在医用胶囊中保存的α-NA、β-NA、固兰B、KH2PO4、Na2HPO4、Ma2S2O组合物130mg-150mg用10ml水溶解于试管中，再将溶液分成两部分各5ml，一管做参比，一管加农药配成1000mg/L，按特殊要求或相应浓度将用上述酶的固定化酶滤纸裁成1×3cm长条，分别浸入试管中，5min后在室内进行进行显色对比。
其中酶滤纸的制备方法为将定性或定量滤纸在酶液中浸泡1min，取出后放于玻璃板上，在置于小型通风橱中阴干，酶即被吸附在滤纸上。醋酸纤维素薄膜的处理方法与滤纸相同；其中面粉羧酸酯酶液的制备方法为按面粉水为1∶1-1∶3.0的比例混合均匀后，用磁力搅拌器搅拌20min，然后在3500-4500g离心5min，取上清液装入塑料管，置-20℃保存备用；其中家蝇AchE和羧酸酯酶液的制备方法为将家蝇头、胸和腹部用剪刀剪断，分别进行匀浆，匀浆液在3500-4500g离心5min，上清液置-20℃保存备用，头部以AchE为主，腹部以羧酸酯酶为主；其中马血清丁酰胆碱酯酶液购自北京生物制品研究所；本发明的研究过程包括用离体法筛选合适的酶、筛选合适的底物和显色剂、研究现场快速检测劣假农药杀虫剂的定性方法、研究长期保存的方法。
本发明所提供的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物及检测方法的检验原理是基于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂属于神经毒剂，其共同的毒性机制是抑制生物体内的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，造成乙酰胆碱(Ach)的积累，影响正常的神经传导，使昆虫致死。AchE属于以丝氨酸残基为活性中心的酶类，羧酸酯酶与AchE类似，同样以丝氨酸残基作为活性中心，因此对AchE有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类药剂同样对羧酸酯酶有抑制作用。因此，依据样本对AchE或羧酸酯抑制作用的有无或大小，即可判断有机磷或氨基甲酸酯类药剂的有机或含量多少。其检测原理如下样本+酶→酶活性被抑制→底物不被水解→不变色→含有机磷或氨基甲酸酯药剂样本+酶→酶活性部分被抑制→底物水解量减少→溶液或滤纸有一定红色(比对照浅)→含量不够样本+酶→酶活性正常→底物被水解→溶液或滤纸变红→不含有机磷或氨基甲酸酯药剂本发明所提供的酶源包括面粉羧酸酯酶、马血清丁酰胆碱酯酶、家蝇乙酰胆碱酯酶和家蝇羧酸酯酶；所涉及的其它组份包括α或β-乙酸萘酯(α-NA或β-NA)，上海试剂一厂产品；固蓝B盐或固蓝RR盐，Fluka公司产品；KH2PO4、Na2HPO4、Ma2S2O3均为分析纯或化学纯。酶及底物显色剂的筛选方案如下本发明中涉及的酶的制备与固定化的方法包括其中面粉羧酸酯酶的制备方法为按面粉∶水为1∶2.5的比例混合均匀后，用磁力搅拌器搅拌20min，然后在3500-4500g离心5min，取上清液装入塑料管，置-20℃保存备用；其中家蝇AchE和羧酸酯酶的制备方法为将家蝇头、胸和腹部用剪刀剪断，分别进行匀浆，匀浆液在3500-4500g离心5min，上清液置-20℃保存备用，头部以AchE为主，腹部以羧酸酯酶为主；其中马血清丁酰胆碱酯酶购自北京生物制品研究所；其中酶的固定化方法为将定性或定量滤纸在酶液中浸泡1min，取出后放于玻璃板上，在置于小型通风橱中阴干，酶即被吸附在滤纸上。醋酸纤维素薄膜的处理方法与滤纸相同；其中羧酸酯酶的测定方法为羧酸酯酶的测定主要以α-NA和β-NA为底物，以固蓝B盐作显色剂，在600nm或555nm测定光吸收值。
本发明中所涉及的酶源的选择结果为分别以家蝇、面粉和马血清作酶源测定了常用有机磷和氨基甲酸酯灯杀虫剂的抑制能力。表1至表12显示出常见药剂对家绳、面粉和马血清来源的酯酶的抑制中浓度(I50)和抑制90％(I90)值。表1、2和表3、4显示出辛硫磷、敌百虫、故故畏、氧化乐果、二嗪农、毒死蜱、甲基异柳磷、增效磷、呋喃丹、甲基对硫磷、久效磷、对氧磷、甲胺磷和地定磷对家绳羧酸酯抑制I50和I90值，以α-乙酸萘酯为底物，I50值范围是10-7-10-5mol/L,I90为10-5-10-2mol/L，以β-乙酸萘酯为底物时，I50值范围是10-7-10-5mol/L,I90值为10-8-100mol/L。说明这些药剂对α-乙酸萘酯水解的抑制能力高于对β-乙酸萘酯的抑制能力。上述这些药剂对面粉来源的羧酸酯酶抑制I50和I90值，以α-乙酸萘酯为底物时分别为10-6-10-3mol/L和10-5-10-2mol/L。对马血清来源的酯酶，抑制I50和I90值，以α-乙酸萘酯为底物时分别为10-17-10-2mol/l和10-6-10-1mol/L，以β-乙酸萘酯为底物时分别为10-15-10-2mol/L和10-4-10-1mol/L。
上述结果表明，三种来源的酯酶对常用的有机磷药剂均达到了一定的敏感度，马血清来源的酯酶虽然对药剂较敏感，但是，不同药剂之间变化较大，I50值相差达1015数量级(表13)，不适合农药的检测。家蝇来源的酯酶与面粉来源的酯酶对农药的反应比较类似，但是家蝇作为酶源操作程序比较复杂，稳定性低，成本也比较高。因此，以面粉作为酶来源比较适合。表1不同家药对家蝇α-NA羧酸酯酶的抑制中浓度(I50值)及置信限
抑制剂浓度单位为mol/L置信限为90％保证概率。表2-表13同表1。
表2不同农药对家蝇α-NA羧酸酯酶I90值及置信限序号 农药 I90值(mol/L) 置信限1辛硫磷6.94×10-52.71×10-6～1.78×10-32氧东果1.65×10-41.52×10-5～1.77×10-33故故畏3.316×10-41.19×10-5～6.05×10-34故百虫3.40×10-48.35×10-5～1.85×10-35二唪哝6.86×10-43.60×10-5～1.31×10-26毒死蜱7.96×10-44.6×10-4～1.37×10-37甲基异柳磷2.30×10-31.73×10-4～3.07×10-18呋喃丹2.54×10-31.96×10-5～3.309增效磷3.91×10-33.20×10-3～4.77×10-310 对氧磷8.07×10-31.91×10-3～4.77×10-211 甲基对硫磷2.4×10-22.02×10-4～2.48×10-112 久效磷2.32×10-27.66×10-6～7.02×10-113 甲胺磷2.81×10-21.95×10-3表3不同农药对家蝇β-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药 I50值(mol/L) 置信限1敌百虫 4.64×10-64.55×10-6～4.73×10-62对氧磷 5.79×10-62.27×10-6～1.47×10-53辛硫磷 6.34×10-64.73×10-7～8.48×10-54二嗪哝 2.54×10-51.99×10-5～3.23×10-55敌敌畏 2.79×10-51.69×10-5～4.61×10-56呋喃丹 2.96×10-51.63×10-6～5.36×10-47氧乐果 5.36×10-52.72×10-5～1.06×10-48毒死蜱 5.37×10-51.85×10-5～1.56×10-49甲基异柳磷 9.38×10-51.55×10-5～5.69×10-410 甲胺磷 5.66×10-47.08×10-5～4.52×10-311 久效磷 8.57×10-42.78×10-8～2.36×10-112 增效磷 1.74×10-39.46×10-4～3.21×10-3表4不同农药对家蝇β-NA羧酸酯酶I90值及置信限序号 农药 I90值(mol/L) 置信限1敌百虫1.19×10-31.15×10-3～1.02×10-32辛硫磷2.03×10-38.42×10-5～4.91×10-23氧乐果8.98×10-33.68×10-3～2.19×10-24毒死蜱1.78×10-24.15×10-3～7.06×10-25对氧磷2.77×10-26.08×10-3～1.26×10-16呋喃丹7.99×10-21.41×10-3～4.54×10-17甲基异柳磷1.01×10-28.57×10-3～1.20×10-18二嗪哝1.10×10-27.91×10-3～1.53×10-2
表5不同农药对面粉α-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药I50值(mol/L) 置信限1敌敌畏 6.12×10-72.05×10-8～1.83×10-52对硫磷 1.02×10-62.94×10-7～3.54×10-63马拉氧磷 5.75×10-67.48×10-7～4.41×10-54甲基对硫磷 9.86×10-63.07×10-7～3.16×10-45久效磷 4.40×10-51.647×10-7～1.17×10-26氧乐果 8.96×10-52.20×10-9～3.66×10-17辛硫磷 1.02×10-41.57×10-9～9.01×10-18地定磷 1.92×10-42.45×10-7～1.50×10-19甲胺磷 4.89×10-41.73×10-5～1.38×10-210 甲基异柳磷 6.13×10-42.46×10-5～1.50×10-211 杀螟松 6.02×10-43.07×10-4～1.28×10-312 毒死蜱 6.38×10-41.71×10-6～2.50×10-113 喹硫磷 3.13×10-37.14×10-4～1.38×10-214 乐果 3.14×10-31.24×10-3～0.66×10-3表6不同农药对面粉α-NA羧酸酯酶I90值及置信限序号农药 I90值(mol/L)置信限1敌敌畏 4.43×10-51.38×10-6～1.43×10-32对硫磷 9.24×10-52.10×10-5～4.06×10-43马拉氧磷 1.57×10-41.71×10-5～1.45×10-34甲基对硫磷 3.41×10-46.84×10-6～1.70×10-25久效磷 1.42×10-21.2×10-5～1.67×10-16氧化乐果 3.45×10-23.16×10-8～3.75×10-17毒死蜱 6.61×10-21.02×10-5～4.26×10-1表7不同农药对面粉β-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药 I50值(mol/L) 置信限1敌敌畏1.77×10-67.45×10-8～4.18×10-52甲基对硫磷6.34×10-62.63×10-6～1.53×10-53马拉氧磷 8.54×10-69.18×10-7～7.95×10-4久效磷1.56×10-54.47×10-7～5.46×10-45杀螟松2.18×10-53.34×10-6～1.42×10-46对硫磷3.04×10-53.07×10-7～3.01×10-37辛硫磷4.49×10-51.59×10-6～1.17×10-38氧化乐果 5.97×10-52.18×10-7～1.63×10-29地定磷8.75×10-52.17×10-7～3.50×10-210 增效磷7.89×10-41.68×10-6～3.70×10-211 喹硫磷8.04×10-42.84×10-6～2.80×10-212 毒死蜱9.18×10-44.13×10-6～2.00×10-213 甲胺磷9.52×10-36.98×10-4～1.30×10-2
表8不同农药对面粉β-NA羧酸酯酶I90值及置信限序号 农药 I90值(mol/L) 置信限1敌敌畏 6.89×10-52.53×10-6～1.87×10-32马拉氧磷 1.37×10-41.29×10-5～1.47×10-33久效磷 5.22×10-48.89×10-6～3.10×10-24甲基对硫磷 3.64×10-38.41×10-4～1.58×10-25氧化乐果 5.10×10-34.21×10-6～6.17×10-16辛硫磷 5.73×10-38.03×10-5～4.10×10-17地定磷 1.18×10-24.37×10-6～3.18×10-18杀螟松 2.49×10-28.88×10-4～7.00×10-19对硫磷 4.70×10-41.36×10-4～1.62×10-1表9不同农药对马因清α-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药I50值(mol/L) 置信限1增效磷 2.60×10-173.98×10-18～1.70×10-162硫双磷 2.11×10-61.36×10-7～3.28×10-53敌敌畏 5.86×10-68.73×10-7～3.93×10-54辛硫磷 6.23×10-61.13×10-7～3.34×10-45地定磷 2.65×10-53.16×10-6～2.23×10-46呋喃丹 4.55×10-42.42×10-4～8.55×10-47甲基异柳磷 3.89×10-33.49×10-7～3.43×10-48甲基对硫磷 7.87×10-31.00×10-4～6.20×10-29马拉硫磷 1.52×10-27.13×10-6～3.22×10-1表10不同农药对马血清α-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药 I90(mol/L)置信限1增效磷3.07×10-61.49×10-6～6.33×10-32硫双磷6.10×10-53.50×10-6～1.26×10-33敌敌畏1.52×10-41.92×10-5～1.21×10-34辛硫磷1.54×10-41.97×10-6～1.20×10-25地定磷2.01×10-31.48×10-4～2.72×10-26呋喃丹0.28 9.49×10-2～8.1×10-1
表11不同农药对马血清β-NA羧酸酯酶I50值及置信限序号 农药I50值(moL/L)置信限1增效磷 1.28×10-156.99×10-20～2.34×10-112敌敌畏 2.16×10-63.95×10-7～2.06×10-53对氧磷 7.86×10-61.54×10-7～4.06×10-44地定磷 1.25×10-59.39×10-7～1.67×10-45辛硫磷 1.49×10-59.06×10-7～2.44×10-46硫双磷 2.09×10-42.77×10-6～1.57×10-27呋喃丹 3.25×10-42.77×10-6～1.57×10-28甲基异柳磷 9.65×10-42.38×10-4～2.81×10-39马拉硫磷 3.00×10-31.08×10-5～9.50×10-210 甲基对硫磷 3.62×10-21.24×10-3～1.07×10-1表12不同农药对马血清β-NA羧酸酯酶I90值及置信限序号农药I90值(mol/L)置信限1辛硫磷 1.92×10-49.11×10-6～4.06×10-32敌敌畏 2.38×10-42.66×10-5～2.13×10-33对氧磷 3.31×10-43.93×10-6～2.70×10-24地定磷 7.72×10-43.68×10-5～1.16×10-25呋喃丹 0.21 8.16×10-3～5.21×10-1表13农药对三种酶抑制的I50和I90值α-NA β-NAI50值的数量级 I90的数量级 I50值的数量级 I90的数量级家蝇酶10-7～10-210-5～10-210-6～10-310-3～10-0面粉酶10-7～10-210-5～10-110-6～10-310-5～10-4马血清10-7～10-210-6～10-210-15～10-210-4～10-1本发明中，酶固定化后对农药敏感度试验结果为通过十四种农药的实验表明，底物为β-NA，显色剂为固兰剂B盐时，随着农药浓度的降低(从1000～62.5mg/L)，显色逐渐加深。对照显色最深，对照和处理显色最明显对比均出现在5min左右(表14)。从表14可以看出，在药剂浓度为500-1000mg/L时，酶活性可以100％抑制，固定化酶滤纸片没有颜色，与对照具有明显的区别。
表14酶固定化后在不同浓度农药作用下的显色比较*农药 1000 500 250 125 62.5 对照 对照 时间I** I***二嗪农 0000+ ++ \4.5二溴磷 00000 \ +5敌敌畏 00000 \ ++ 5乐果乳油 0000+ + \5辛硫磷 00++ ++ +++ ++++++ 4伏杀磷 00+0+ ++ \4稻丰散 00+++ + \4增效磷 0+++++\ +++ 4毒死蜱 0++++ +++++\6.5马拉硫磷 0++++++++\4杀扑磷 0+++++\ +3杀螟松 0+++++++++++ 3-5喹硫磷 0++++ +++++\3.5*农药浓度单位mg/L；时间单位min。**对照Ⅰ用0.01％的TritonX-100；对照Ⅱ用PH6.0的缓冲液，“+”的多少表示红色的显现程序。
表15显示出1000mg/L农药对固定化后马血清和面粉酶抑制能力的比较。面粉来源的固定化羧酸酯酶显色时间比马血清短。二者对照和处理均有明显的区别。
表15固定化以马血清羧酸酯酶、面粉羧酸酯在农药浓度为1000mg/L时的显色比较<
底物量α-NA和β-NA均为0.224mg
底物的浓度对显色有一定影响，一些农药，如喹硫磷、增效磷、毒死蜱、久效磷、马拉硫磷等，当底物量为0.224mgα-NA+0.224mg β-NA时，因为底物和药剂对酶的竞争作用，使得处理也呈红色，对照与处理显色不明显。当降低底物浓度量为0.112mg，对照与处理显色区别明显。
对农药的检测实验表明，α-NA作底物显色快，但不稳定，β-NA显色要慢一些，但较稳定。检测所用农药的浓度对绝大多农药来说。1000mg/L是适宜的浓度，对照用PH6.0的缓冲溶液溶解显色剂和用0.01％的TritonX-100效果相差不大，TritonX-100略好一点。
本发明中，最佳底物及配比筛选非常重要，α-NA作为底物显色速度较快，颜色较深，但易褪色，对农药有选择性；β-NA作为底物显色速度较慢，颜色较浅，但稳定性及适用性，因此选择α-NA和β-NA的最佳配比对于快速、可靠的检测农药将是重要的环节之一。
表16显示出不同底物量的实验结果。底物量为0.28mg时，显色时间、处理与对照的差异以及显色维持时间都是比较合适的。
表16底物浓度实验α-NA+β-0.07+0.07 0.2+0.2 0+0.56 0.14+0.14NA(mg)空白++++++++ +++二嗪农 + +++++显色时间21 8 2(min)现象对比不明显 很快返色 对比略浅 对比明显表17和18显示出了α-NA和β-NA不同配比的实验结果。综合衡量显色时间、显色后的对比度以及显色持续时间，α-NA与β-NA以2∶1为最佳。
表17α-NA和β-NA配比筛选(1)药剂1∶1 1∶1.51∶21∶2.51∶31∶351∶42∶1空白++++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++稻丰散 + 0 0+0 0+ 0+++ 0喹硫磷 + +++ 0 0 000二溴磷 \ \ \ 0 \ \\ 0
表18 α-NA和β-NA配比筛选(2)药剂 1∶2 1∶2.5 2∶1空白 +++++++++稻丰散+ + +杀螟松0 0 0二溴磷0 0 0久效磷0 0 0SV1 + +++敌敌畏0 0 0喹硫磷0 \ \表19显示出了底物量为0.28mg,α-NA与β-NA为2∶1时，对部分农药的实验结果。显色时间＜5min 20min后不变色，显色对比很明显。
表19 2∶1底物配比农药显色实验(农药浓度1000mg/L)农药 空白 1000mg/L敌敌畏+++0二溴磷+++0马拉硫磷 +++0杀螟松+++0稻丰散++++久效磷+++0SV1 ++++伏杀磷++++杀扑磷+++0喹硫磷+++05.4农药检测极限的测定通过对常见农药浓度梯度显色的测定，确定出了每种农药的最低检出限及公共检出限。对敌敌畏、马拉硫磷、辛螟松、伏杀磷、杀扑磷、稻丰散、增效磷、对硫磷、氧化果、甲基异硫磷、甲基对硫磷、水胺硫磷、甲胺磷等农药分别测定了200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L浓度下的显色情况，找出了溶液中农药含量和酶片显色深浅的对应关系(表20)。证明在1000mg/L农药浓度下药品均能抑制显色。
表20农药检测极限的测定(显色时间4-5分钟)农药01000 900 800 700 600 500 400 300 200敌敌畏+++0+000000 0 0马拉硫磷 +++00++++++ ++++辛硫磷+++000++++++++伏杀磷+++000000++ ++杀扑磷+++000++++++++稻丰散+++00++++ ++++++增效磷+++00+++++ ++ ++++对硫磷+++000+++++ ++++甲基异柳磷+++00++++ +++ ++++甲基对硫磷+++000000++ ++水胺硫磷 +++000++++ ++ ++++敌敌畏显色下限的测定显色时间5分钟0 200 150 100 80 60 40mg/L+++ 000 ++ +本发明中，温度与显色时间的结果表明，外界温度的不同直线影响着反应溶液温度的变化，从而导致了显色反应时间的变化。在不同温度下(5℃-35℃)，测定了显色反应所需要的时间。由以下结果可知，显色时间与反应溶液的湿度成反比，温度越高显色时间越短。这是由于参加反应的酶活性与温度有关，温度越高酶的活性越高，显色越快，反之则越慢。所以在具体检测中，可以参考表21中的反应时间。
表21显色时间与温度的关系温度 显色时间5-6℃ 7-8分钟10-11℃ 5-6分钟15-16℃ 4-5分钟20℃ 3-4分钟25℃ 3分钟30℃ 3分钟35℃ 2分钟本发明中，光对显色的影响结果表明，在阳光照射下，进行显色反应实验，发现反应5分钟后酶片未显红色，仍呈黄白色。重复上述实验，用胶布缠裹试管，部分遮挡反应溶液和酶片，使其避免太阳光直射，反应5分钟后被遮挡部分的酶片变红，而在太阳光照射下的酶片呈黄白色。考虑参加反应的显色剂为光敏物质，在阳光照射下极易发生分解，导致酶片不显色。因为，在用该方法检测农药时注意不要在阳光下直射下进行，应在背阴处操作。
本发明中，检测试剂包装有保存实验结果表明，根据最佳底物及配比筛选实验情况我们选择2∶1的底物配方，加入0.1％抗氧化剂，分装在医用胶囊中保存。检测时，一个胶囊中的药品用10ml水溶液于试管中，再将溶液分成两部分各5ml，一管做参比，一管加农药配成1000mg/L，将固定化酶滤纸裁成1×3cm长条，分别浸入试管中，5min后进行显色对比(在室内，农药浓度1000mg/L)。
表22显示出将检验试剂用胶囊包装后，对农药的检测结果。对药浓度在500-1000mg/L时均能抑制固定化羧酸酯酶对底物的水解作用，检测试纸不能显色，对照和处理有明显的差别。
表22胶囊包装对农药的检测实验(农药浓度单位为mg/L)500 750 1000 0氧化乐果 ++ ++ ++++对硫磷000+++敌敌畏000+++马拉硫磷 +00+++辛硫磷000+++杀螟松000+++伏杀磷000+++杀扑磷000+++杀扑磷000+++稻丰散+00+++SV1 000+++表23显示出了检测试剂贮存期的试验结果。在室内每天日光灯光照16小时，放置101天后对显色没有影响。说明用胶囊包装检测试剂能够有效的阻止光解作用和在空气中的氧化作用。
表23胶囊药品保存实验(室温日光灯下保存101天)保存期 0天40天 101天显色程度+++++++++表24、25为胶囊药品保存的另外两个实验实验条件避光将胶囊放在加干燥剂的塑料袋中，抽真空后放在抽屉中保存。
不避光在日光灯下每天连续照射16个小时，胶囊放在加干燥剂的塑胶袋中保存。
表24胶囊药品避光与不避光保存实验保存天数 不避光 不避光 避光 避光0.++++++++++++5 ++++++++++++8 ++++++++++++11++++++++++++13++++++++++++23++++++++++++31++++++++++++46++++++++++++52++++++++++++59++++++++++++68++++++++++++101 +++++ ++ +++表25胶囊药品冷藏保存实验保存天数 不包锡纸 不包锡纸 包锡纸 包锡纸0 +++ +++ ++++++2 +++ +++ ++++++4 +++ +++ ++++++15+++ +++ ++++++18+++ +++ ++++++23+++ +++ ++++++26+++ +++ ++++++33+++ +++ ++++++45+++ +++ ++++++49+++ +++ ++++++67+++ +++ ++++++107 +++ ++ ++++++181 +++ ++ +++++
从上述连续3-6个月的监测中，表明不论是室温还是冰箱冷藏，避光还是不避光，用锡纸包还是不用锡纸包，对显色影响不大，均显亮丽的玫瑰红色，说明用胶囊包装保存是安全可靠的。
表26显示出固化酶的保存期实验。结果表明固定化酶滤纸片在保存11个月后对农药的检测没有明显的影响。
表26固定化酶滤纸室温保存期实验(农药浓度1000mg/L)1 2空白空白敌敌畏0+0+++++++杀螟松0+0+++++++久效磷0+0+++++++表27显示出固定化酶在冰箱中的保存期实验表27固定化酶低温保存实验保存时间 显色时间 保存条件451天+++10分钟 冰箱，塑料袋包装395天+++5分钟冰箱，塑料袋包装21天 +++5分钟室温，塑料袋包装5.8对农药销售部门有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂现场检测表28显示出对北京市农药检测结果，敌敌畏、敌百虫、辛硫磷检测正常，氧化乐果可能有问题，有待进一步仪器分析。
表29显示出对河北省三河市农药检测结果，在检测的11个农药样品中，仅木虱净显色稍红，其余均不显色。经调查得知，木虱净为混剂，仅含部分有机磷农药，符合我们的检测结果。
表28北京市农药检测结果农药名称1 2 3 空白 空白敌敌畏 0 0 0 ++ +++敌百虫 0 0 0 +++++辛硫磷 0淡黄 0淡黄 0淡黄 ++ ++氧化乐果(9715) +++ +++ +++ ++++++氧化乐果(重庆) 0+ 0+ + ++ ++
表29河北省三河市农药经销部门现场检测结果农药名称123空白 空白敌敌畏(天津)000++++++敌敌畏(邯郸)000++++++甲胺磷(德州)000++++++甲胺磷(石家 000++++++庄)对硫磷 000++++++辛硫磷 000++++++甲辛丹 000++++++木虱净 ++ ++ ++ ++++++扫螨尽 000++++++哒螨灵(扫螨 ++ ++ ++ ++++++尽)辛氰乳油 0 00++++++表30显示对河北省张家口市农药经销部门检测结果。除了水胺硫磷，菊马乳油，氧化乐果(9715)，蚜虱净外，其余农药均能明显显色分辨，达到现场检测农药的目的，菊马乳油及蚜虱净为有机磷和菊酯类混合药剂，故有微红存在，氧化乐果与真药显色差别较大，水氨硫磷及氧化乐果还有待于进一步用仪器测定其准确含量。
表30河北省张家口市农药现场检测结果农药 123空白 空白辛硫磷000++++甲胺磷(石家庄)000++++甲胺磷(燕水桥牌) 000+++ +++辛硫磷000+++ +++氧化乐果(石家庄) +00+++++甲基对硫磷(虎牌) 000++++菊马乳油+++++++对硫磷(银花牌)000+++ +++水胺硫磷++ ++ ++ +++ +++敌敌畏(铁狮牌)000++++氧化乐果(9715)++ ++++++敌敌畏(新丰) 000++++敌敌畏(陕西) 000++++辉丰快克000+++++蚜虱净 +++++++表31显示出对河北省张家口市植保站植物医院农药检测结果。除了甲胺磷(兰溪)略有红色、氧化乐果(9715)显色较深以外，其余农药均不显色，对比明显。在本实验过程中，氧化乐果(9715)显色不符合要求，考虑用仪器测定其有效含量。
表31张家口市植保站植物医院现场检测农药农药123空白 空白甲胺磷(兰溪)++0++++++甲胺磷(石家庄) 000++++++对硫磷(牛城)000++++++对硫磷(银花)000+++++辛硫磷(南通)000++++++敌敌畏(新丰)000++++++打虫灵(甲久乳油)000++++++氧化乐果(9715) ++ ++ ++ ++++++二溴磷(天津)000++++++6、酶法与仪器分析验证实验表32显示出酶法检测与仪器分析的验证实验。仪器分析结果与酶法检测结果具有比较好的对应关系，证明酶法检测是可靠的。
表32部分农药仪器分析与酶法检测比较农药 标值实测1000mg/L甲基对硫磷50％49％0马拉硫磷 45％44％0敌敌畏80％78％0乐果 40％ 5％+++
表31张家口市植保站植物医院现场检测农药农药123空白 空白甲胺磷(兰溪)++0++++++甲胺磷(石家庄) 000++++++对硫磷(牛城)000++++++对硫磷(银花)000++++++辛硫磷(南通)000++++++敌敌畏(新丰)000++++++打虫灵(甲久乳油)000++++++氧化乐果(9715) ++ +++ ++++++二溴磷(天津)000++++++表32显示出酶法检测与仪器分析的验证实验。仪器分析结果与酶法检测结果具有比较好的对应关系，证明酶法检测是可靠的。
表32部分农药仪器分析与酶法检测比较农药 标值实测(仪器分析)1000mg/L甲基对硫磷50％49％ 0马拉硫磷 45％44％ 0敌敌畏80％78％ 0乐果 40％ 5％ +++经过对生物化学检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的研究，我们筛选出从作物种子中提取的羧酸酯酶、α-NA与β-NA的混合底物及相应的包装载体，制成检测两类农药的试剂盒，用于现场对大量药剂的初判，作为现场无分析条件时的补充手段。该方法通过显色的手段，在5-35℃的条件下可以定性检验有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，甄别出质量低下的伪劣及失效的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂。该项目通过对大量酶系的筛选证明，从植物的种子提取的羧酸酯酶对常用的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂及其混合配置剂具有较高的敏感度，抑制中浓度(I50)小于1000mg/L。通过对不同介质酶的固定化试验证明，用定量滤纸将酶固定化后，在室温条件下，保存期在一年以上；经过大量配比筛选试验得到的不同底物、显色剂、缓冲介质的试验组合，在室温条件下，保存期在半年以上；由固定化酶、检测试剂组成的试剂盒，经河北三河县、河北张家口市等地现场检测证明，可以有效地鉴别含量低或假的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂。对部分经过鉴别的农药做仪器分析验证证明，该方法可靠，可以用于大量有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂仪器检测之前的初步筛选。
本发明的研究可达到脱离仪器现场快速定性签别有机磷及氨基甲酸酯类农药的假药、劣药、过期药、及合格药品的目的。
本发明的效果可达到为技术监督部门和农药销售部门及用户提供一种易保存、易携带，使用方便的适合现场快速定性鉴别有机磷及氨基甲酸酯类农药真伪劣的试样。
本发明所产生的社会效益或经济效益的预测分析结果表明，有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂杀虫剂的现场快捷定性检验技术是打击农药市掺假、造假现象的一项急需新技术，也是现代分析化学和物质检测的新方法和新技术，不仅有一定的经济效益，而且具有很大的社会效益。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂杀虫剂的主要应用于产粮区及水果和蔬菜产生，如河北、河南、山东及全国农业产区，其用量是巨大的，为了消除农药的残毒，必须在农作物收获前15天以上施用农药，若使用伪劣假农药易造成作物减产直至颗粒无收，而且病虫害极易在这段时间发生，所以对技术监督部门和农药销售部门及用户拥有这种快速定性鉴别试验是很有必要的。这两类农药在市场上销售的通常有十余种，从比较保守的估计，若每套销售1.5元，可鉴别一种农药，那么初期每年估计可销售十几万余元，随着其广泛的推广使用，其社会效益和经济效益将成倍增长。本发明所提供的检测手段可减少实验室内仪器分析的工作量，在短时间内对大量的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂筛选，剩下少量不合格的产品再进行仪器分析。另一方面也可以作为农药经营部门或使用部门甚至农民对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂进行初步检验的手段。
本发明在实际试验中对以下农药进行了测试的结果表明；1、对有机磷或氨基甲酸酯类农药进行测试
农药名称 浓度 生产厂家(1)敌敌畏 80％乳油天津农药厂产品(2)久效磷 95％原药江苏南通农药厂产品(3)对硫磷 98.7％原药 天津农药厂产品(4)甲基对硫磷 90％原药浙江黄岩农药厂产品(5)杀螟松 90％原药宁波农药厂产品(6)辛硫磷 90％原药上海农药厂产品(7)甲基异柳磷 73.5％原药 青岛第二农药厂产品(8)喹硫磷 70％原药浙江嘉兴市农药厂产品(9)马拉硫磷91.06％原药 宁波农药厂产品(10)马拉氧磷 55％原药山东德州农药厂产品(11)乐果 97％原药(12)氧乐果 72.08％原药(13)甲氨磷 80％原药苏州化工厂产品(14)乙酰甲氨磷 60％原药广西灵山农药厂产品(15)增效磷(SV1)98％原药山东乐陵市农药厂产品(16)倍硫磷 95％原药浙江黄岩农药厂产品(17)地定磷 89％原药上海农药厂产品(18)稻丰散 50％乳药(19)二嗪哝 50％乳药(20)敌百虫 90％原药浙江杭州农药厂(21)二溴磷 50乳油 天津市人民农药厂(22)毒死蜱 40％乳油(23)硫双磷 47.6％乳油(24)呋喃丹 97％原药(25)灭多威 86.7原药2对市场检测农药进行测试北京海淀区生产资料公司清河仓库农药检测(1)敌敌畏80％乳油河北邯郸市滏阳化工厂(2)敌百虫90％晶体河北邯郸市滏阳化工厂(3)辛硫磷 50％乳油江苏连云港市第二农药厂(4)氧化乐果40％乳油河北涿州中国人民解放军九七一五工厂河北省三河市农资公司(1)敌敌畏乳油 80％天津农药股份有限公司(2)敌敌畏乳油 80％邯郸滏阳化工集团有限公司(3)甲胺磷乳油 50％山东德州 98.2.21(4)甲胺磷乳油 50％石家庄化工厂 96.5.3(5)对硫磷乳油 50％天津市天兴农药厂 96.5.7(6)辛硫磷乳油 50％天津市天兴农药厂 96.4.1(7)辛氰乳油50％太原化工集团磷肥厂 96.3.25(8)甲辛丹乳油 35％保定农林科学院植保所杀虫剂开发中心 95.4.12(9)天灵光乳油 30％山东中石化工有限公司 96.3.17(10)木虱净乳油 20％石家庄新亚化工股份有限公司 96.5.12(11)扫螨尽乳油 15％江苏建湖县农药二厂 95.12.8河北省张家口市(1)辛硫磷(银花牌) 50％江苏启东农药厂 960401(2)甲胺磷乳油 50％石家庄化工厂 19960422(3)甲胺磷(燕水桥牌)50％湖南衡阳舍雁化工厂 19950626(4)甲胺磷乳油(农乐牌) 50％浙江兰溪农药厂 19950618(5)辛硫磷乳油(和乐牌) 40％山东乐陵农药厂 19960110(6)氧化乐果乳油40％石家庄农药化工厂 19970324(7)甲基对柳磷乳油(虎牌)50％苏州化工厂 96032804(8)菊马乳油(增产牌)20％北京顺义县农药厂 19940329(9)对硫磷乳油(银花牌) 50％江苏启东农药厂 19960422(10)水胺硫磷乳油 40％石家庄化工厂 19950703(11)氧化乐果乳油 40％中国人民解放军九七一五厂 19970305河北省张家口市植保站植物医院(1)甲胺磷乳油50％浙江兰溪市农药厂登记证号 D84P3-8(2)氧乐果乳油40％中国人民解放军第9715 工厂 燕京9705283(3)对硫磷乳油50％邢台市农药厂 牛城3037709(4)对硫磷乳剂 50％江苏启东农药厂银花951103(5)辛硫磷 40％江苏省南通染化厂宝灵(6)打虫灵(甲久乳油)40％江苏盐城丰山农药有限公司 丰山970215(7)二溴磷乳40％天津市绿洲化工厂试制96.3(8)敌敌畏乳油 80％邯郸滏阳化工集团有限公司 新丰97.6.2甲胺磷乳油 50％石家庄化工厂
权利要求
1.快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，其中组成包括α-NA、β-NA、固兰B、KH2PO4、Na2HPO4、Ma2S2O3及酶。
2.权利要求1所述的快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，其中所述的组成配比(重量份数表示)为组份 配比α-NA 0-200；β-NA 0-200；固兰B 0.1-1000；KH2PO40-1000；Na2HPO40-1000；Ma2S2O30-1000；酶 0.001-1。
3.权利要求1所述的快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，其中所述的组成配比(重量份数表示)为组份 配比α-NA 0.18；β-NA 0.09；固兰B 50；KH2PO481.2；Na2HPO49.47；Ma2S2O31.43；酶 0.05。
4.权利要求1所述的快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，其中所述的酶包括种子酶或生物酶。
5.权利要求4所述的快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物，其中所述的酶包括面粉羧酸酯酶、马血清丁酰胆碱酯酶、家蝇乙酰胆碱酯酶或家蝇羧酸酯酶，
6.快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的检测方法，其中包括将按上述配比混合制成粉剂分装在医用胶囊中保存的α-NA、β-NA、固兰B、KH2PO4、Na2HPO4、Ma2S2O组合物130mg-150mg用10ml水溶解于试管中，再将溶液分成两部分各5ml，一管做参比，一管加农药配成1000mg/L，按特殊要求或相应浓度将用上述酶的固定化酶滤纸裁成1×3cm长条，分别浸入试管中，5min后在室内进行进行显色对比。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的组合物及检测方法。组合物组成包括α－NA、β－NA、固兰B、KH
文档编号G01N21/77GK1234503SQ98101818
公开日1999年11月10日 申请日期1998年5月4日 优先权日1998年5月4日
发明者李林 申请人:北京市计量科学研究所